鴨坦布蘇病毒、鴨腸炎病毒和番鴨細(xì)小病毒TaqMan三重實時熒光定量PCR檢測方法的建立與臨床應(yīng)用

吳雙 姜勇 徐建生 吳植 謝軍 宋海港 魏若瑤 高悅 朱善元

摘要：本研究旨在建立一種快速、敏感和高特異性檢測鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、鴨腸炎病毒（DEV）和番鴨細(xì)小病毒（MDPV）的TaqMan三重實時熒光定量PCR（q-PCR）的診斷方法并應(yīng)用于臨床疑似樣品檢測。根據(jù)DTMUV的E基因、DEV的UL2基因和MDPV的VP3基因保守區(qū)域，分別設(shè)計合成了3對特異性引物和探針，在建立單重q-PCR方法的基礎(chǔ)上建立了三重q-PCR方法。運用三重q-PCR方法對198份來自江蘇和安徽的鴨組織疑似病料進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，建立的TaqMan三重q-PCR可同時檢測這3種病毒，檢測靈敏度至少達(dá)100個拷貝，相關(guān)系數(shù)（R2）均在0.99以上，擴(kuò)增效率為90%～110%。同時，該方法對H9亞型禽流感病毒（H9N2 AIV）、鴨甲肝病毒Ⅰ型（DHAV-1）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、鴨呼腸孤病毒（DRV）、新城疫病毒（NDV）、鵝細(xì)小病毒（GPV）的檢測均為陰性，表明該方法具備特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好和快速等優(yōu)點。與常規(guī)PCR檢測方法相比，三重q-PCR方法靈敏度大約高100倍。臨床疑似樣品檢測結(jié)果表明DTMUV的檢出率最高，3種病毒混合感染亦常見。建立的TaqMan三重q-PCR檢測方法為DTMUV、DEV和MDPV的臨床樣品檢測提供了快速、有效、特異和靈敏的工具，也為臨床分子流行病學(xué)調(diào)查及定量分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒;鴨腸炎病毒;番鴨細(xì)小病毒;TaqMan實時熒光定量PCR

中圖分類號：S834文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）03-0626-08

Establishment and clinical application of triple TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR detection method for duck Tembusu virus， duck enteritis virus and Muscovy duck parvovirus

WU Shuang1，JIANG Yong1，2，XU Jian-sheng2，WU Zhi1，XIE Jun1，SONG Hai-gang1，2，WEI Ruo-yao2，GAO Yue1，ZHU Shan-yuan1

（1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College/Jiangsu Provincial Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High-tech Research，Taizhou 225300， China;2.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract：This study aimed to establish a triple TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR（q-PCR） method for the rapid， sensitive and specific detection of duck Tembusu virus （DTMUV）， duck enteritis virus （DEV） and Muscovy duck parvovirus （MDPV）. Based on the conserved regions of DTMUV E， DEV UL2 and MDPV VP3 genes， three pairs of specific primers and probes were designed and synthesized respectively. Furthermore， a triple q-PCR method was established based on the establishment of a single q-PCR method. The triple q-PCR method was used to detect 198 suspected samples from Jiangsu and Anhui. The results showed that the established TaqMan triple q-PCR method could detect these three viruses simultaneously. The detection sensitivity was at least 100 copies， the correlation coefficient （R2） was above 0.99， and the amplification efficiency ragned from 90% to 110%. At the same time， the detection results of H9N2 avian influenza virus （H9N2 AIV）， duck hepatitis A virus type I （DHAV-1）， Muscovy duck reovirus （MDRV）， duck reovirus （DRV）， Newcastle disease virus （NDV） and goose parvovirus （GPV） were negative， it showed that the method had the advantages of high specificity， high sensitivity fastness good repeatability. The sensitivity of triple q-PCR method was approximately 100 times greater than that of conventional PCR assay. The results of clinical suspected samples indicated that the detection rate DTMUV was highest， and mixed infections of three viruses were also common. This triple TaqMan q-PCR assay provides a fast， efficient， specific and sensitive tool for the detection of DTMUV， DEV， MDPV and also lays the foundation for clinical molecular epidemiological investigation and quantitative analysis.

Key words：duck Tembusu virus;duck enteritis virus;Muscovy duck parvovirus;TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

中國目前擁有世界上最大的水禽養(yǎng)殖量，在過去幾十年中規(guī)模不斷擴(kuò)大且發(fā)展愈發(fā)快速[1]。隨著水禽養(yǎng)殖規(guī)模和集約化程度的發(fā)展，與之伴隨的是疫病的不斷增多，而水禽疫病不僅是影響水禽飼養(yǎng)業(yè)的頭號殺手，還是水禽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的嚴(yán)重桎梏。其中，病毒性疫病成為水禽養(yǎng)殖業(yè)成功發(fā)展的最大障礙。由鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）感染引起的疾病稱為鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE）或鴨瘟（Duck plague，DP）[2]，是雁鴨科水禽中分布最廣泛且最具破壞性的傳染性病毒病之一，相對較高的死亡率，包括家養(yǎng)鴨和野鴨[3]在內(nèi)的廣泛的寄主范圍，使其對水禽養(yǎng)殖仍具有不可忽視的威脅。鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV）引起的鴨坦布蘇病毒病是近十年出現(xiàn)的一種新發(fā)水禽疫病，于 2010年從中國東部沿海地區(qū)開始，逐漸蔓延至全國大部分地區(qū)[4]。多個品種的鴨鵝均可感染，尤其對具有高經(jīng)濟(jì)效益的種鴨、種鵝和蛋鴨的危害最為明顯，引起嚴(yán)重的產(chǎn)蛋下降，給鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）引起的番鴨細(xì)小病毒病主要見于三周齡內(nèi)的雛番鴨，根據(jù)年齡的不同，死亡率最高可達(dá)80%[6]。番鴨細(xì)小病毒病在中國番鴨養(yǎng)殖區(qū)域普遍存在，具有極高死亡率和發(fā)病率，一旦發(fā)生，會造成水禽養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。準(zhǔn)確迅速診斷這些疫病是開展相應(yīng)防控工作的基石，q-PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便、快速、易操作、可定量分析等優(yōu)點，建立單重或多重的q-PCR檢測方法并應(yīng)用于臨床樣本的鑒別診斷，不僅可分析病毒核酸在動物體內(nèi)的含量，有助于臨床診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查，還可有助于病毒分離鑒定，為上述疫病的研究和防控提供技術(shù)保障。

1材料與方法

1.1主要材料與儀器

PurePlasmid Mini Kit質(zhì)粒提取試劑盒購自CWBIO公司，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司，Premix Ex Taq（Probe qPCR）、Premix Taq（TaKaRa Taq version 2.0 plus dye）DNA酶、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0 RNA/DNA提取試劑盒、PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EASY Dilusion（for Real time PCR）引物稀釋液均購自寶生物工程（大連）有限公司。DNA marker、E.coli DH5α購自天根（北京）生化科技有限公司，克隆載體pGEM T-easy購自Promega公司， FastPrep-24 5G高速勻漿儀購自美國MP公司，Veriti PCR儀和QuantStudio 3 Real-time PCR System均購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied biosystems）。

1.2引物設(shè)計合成和毒株

根據(jù)GenBank已公開發(fā)表的DTMUV E基因（GenBank登錄號：AB110492.1），DEV UL2基因（GenBank登錄號：JQ248597.1），MDPV VP3基因（GenBank登錄號：AF166110.1）設(shè)計了3套引物和探針（表1），本研究中由于引物和探針的位置高度保守，因此并不涉及區(qū)分野毒株及疫苗株。引物和探針均由英濰捷基（上海）有限公司合成。

DTMUV由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所饋贈，DRV和番鴨呼腸孤病毒（MDRV）由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈，H9亞型禽流感病毒（H9N2 AIV）由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院饋贈，DEV、鴨甲肝病毒I型（DHAV-I）、新城疫病毒（NDV）、MDPV、鵝細(xì)小病毒（GPV）為本實驗室分離并保存。

DTMUV、DEV、MDPV分別為鴨坦布蘇病毒、鴨腸炎病毒、番鴨細(xì)小病毒。

1.3核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄

將-80 ℃保存的組織樣品剪碎，與PBS以1∶9的比例（質(zhì)量比）加入到2 ml研磨管中，利用FastPrep-24 5G高速勻漿儀將組織樣品勻漿，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液。參照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0提取試劑盒說明書提取病毒RNA和DNA，并依據(jù)此方法對DHAV-Ⅰ、DTMUV、MDRV、DRV、DPV、DEV、NDV、H9N2 AIV進(jìn)行核酸提取。參照TaKaRa PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對DTMUV、DHAV-Ⅰ、MDRV、DRV、NDV、H9N2 AIV進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系如表2所示，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA置于-80 ℃保存。

1.4重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以DTMUV的cDNA，DEV、MDPV的DNA為模板，對E基因、UL2基因、VP3基因進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收參照AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒說明書進(jìn)行，回收目的片段后連接至pGEM T-easy載體，再轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α。將陽性克隆菌送至上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。質(zhì)粒的提取參照康為世紀(jì)PurePlasmid Mini Kit高純度質(zhì)粒小提試劑盒說明書進(jìn)行，提取的質(zhì)粒用微量蛋白核酸定量儀測定質(zhì)粒含量，使用下式計算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)[7]：

質(zhì)?？截悢?shù)=（6.02×1023）×（質(zhì)粒含量×10-9）質(zhì)粒長度×660

為建立3種病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對每個質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，從1 μl 1×107拷貝至1×101拷貝。而對于多重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線，將3種重組質(zhì)粒稀釋到1 μl 3×108 拷貝 ，同體積合并后得到1×108 拷貝的混合質(zhì)粒，然后將合并的質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋后建立多重標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5單重和多重q-PCR反應(yīng)條件

單重q-PCR檢測DTMUV、DEV和MDPV的反應(yīng)體系如下：2×Premix Ex Taq（Probe qPCR） 10.0 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl，上、下游引物和探針（10 μmol/L）0.5 μl，DNA模板1.0 μl，滅菌超純水7.1 μl。在QuantStudio 3 Real-time PCR系統(tǒng)的反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

多重q-PCR反應(yīng)體系：10.0 μl 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），0.4 μl 50×ROX Reference Dye，1.0 μl DNA模板及引物、探針、滅菌超純水組合成20.0 μl反應(yīng)體系。同時對引物和探針含量不斷優(yōu)化以獲得更好的反應(yīng)結(jié)果。多重反應(yīng)的反應(yīng)條件與單重反應(yīng)相同，無S型擴(kuò)增且Ct值高于36均判定為陰性。

1.6多重q-PCR靈敏度、特異性和重復(fù)性試驗

為了明確多重q-PCR的靈敏度，將上述重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在無核酸酶的水中進(jìn)行10倍梯度稀釋含量為1×107拷貝至1×101拷貝，稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品用作q-PCR的擴(kuò)增模板。

為了確定多重q-PCR的特異性，提取了鴨主要疫病病原DNA或cDNA并作為擴(kuò)增模板，主要包括H9N2 AIV、DRV、GPV、NDV、MDRV、DHAV-Ⅰ，滅菌超純水為陰性對照。

為了驗證多重q-PCR的重復(fù)性，使用1×107拷貝至1×101拷貝10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒來分析組間及組內(nèi)變異系數(shù)，組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)均為3次。

1.7臨床樣品采集和檢測

2018年7月份至2019年8月份從江蘇宿遷、睢寧、沛縣以及安徽靈璧等地共采集198只死亡鴨及瀕死鴨的組織樣品，樣品采集過程中嚴(yán)格遵守國家農(nóng)業(yè)部于2016年修訂的獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范（NY/T 541-2016）中的要求，包括采樣基本原則、采樣前準(zhǔn)備、樣品采集與處理方法、樣品保存與廢棄物處理等。組織樣品使用FastPrep-24 5G高速勻漿儀進(jìn)行研磨，使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0提取試劑盒提取病毒RNA和DNA，使用TaKaRa PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用建立的多重q-PCR方法進(jìn)行檢測。同時使用本試驗中的3對引物進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，與單重q-PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2結(jié)果

2.1單重q-PCR檢測方法的建立

為建立多重q-PCR檢測方法，首先建立并優(yōu)化單重q-PCR檢測方法。DTMUV用NED熒光基團(tuán)標(biāo)記，DEV使用FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記，MDPV使用VIC熒光基團(tuán)標(biāo)記。使用10倍梯度稀釋為1×107拷貝至1×101拷貝含量的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，DEV的單一熒光定量PCR的靈敏度約為10拷貝（圖1），DTMUV和MDPV單一熒光定量PCR靈敏度為100拷貝（圖2、圖3）。所有標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率：DTMUV（R2=0.999，E=92.6%），DEV（R2=0.999，E=95.6%），MDPV（R2=1.000，E=93.8%），這表明每種病毒的單重q-PCR檢測方法是有效。

A和C表示單一q-PCR FAM熒光曲線，E=95.6%，R2=0.999，Slope=-3.431，Y-Inter=40.169;B和D表示多重q-PCR FAM熒光曲線，E=96.7%，R2=0.997，Slope=-3.403，Y-Inter=39.886。

A和C表示單一q-PCR NED熒光曲線，E=92.6%，R2=0.999，Slope=-3.512，Y-Inter=40.169;B和D表示多重q-PCR NED熒光曲線，E=90.2%，R2=0.998，Slope=-3.581，Y-Inter=43.572。

ction method and multiple fluorescence quantitative detection method for duck Tembusu virus

A和C表示單一 q-PCR VIC熒光曲線，E=93.8%，R2=1，Slope=-3.479，Y-Inter=39.567;B和D表示多重q-PCR VIC熒光曲線，E=93.4%，R2=1，Slope=-3.490，Y-Inter=41.517。

2.2多重q-PCR檢測方法的建立

為建立針對多個病毒的多重q-PCR檢測方法，將引物和探針的濃度在多重反應(yīng)體系中進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表3。結(jié)果表明，多重q-PCR可以高效檢測3種疫病的靶基因，每種病毒的檢測靈敏度約為100拷貝。所有標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率（圖4）：DEV（R2=0.997，E=96.7%），DTMUV（R2=0.998，E= 90.2%），MDPV（R2=1.000，E=93.4%），這表明建立的多重q-PCR檢測方法有效。

2.3多重q-PCR的靈敏度

將梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（1 μl 1×107拷貝）進(jìn)行q-PCR檢測。結(jié)果顯示，DTMUV可檢測到1×101拷貝的質(zhì)粒;MDPV、DEV可檢測到1×102拷貝的質(zhì)粒，1×101拷貝的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及陰性對照無熒光擴(kuò)增。相同拷貝的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在單重和多重?zé)晒舛康捏w系中Ct值有所不同，多重體系的Ct值要比單重體系的Ct值高0.2左右，這可能是由于多重?zé)晒舛矿w系中不同引物和探針的相互影響造成的。常規(guī)PCR檢測DTMUV、MDPV和DEV的靈敏度分別為1 μl 1×103拷貝、1×104拷貝和1×104拷貝，本試驗建立多重q-PCR方法的靈敏度是常規(guī)PCR的100倍左右，因此檢測已感染但無臨床癥狀鴨同樣可以得到準(zhǔn)確結(jié)果。上述結(jié)果表明多重q-PCR方法靈敏度高。

A：DEV熒光標(biāo)記 E=96.7%，R2=0.997，Slope=-3.403，Y-Inter=39.886;B：DTMUV熒光標(biāo)記 E=90.2%，R2=0.998，Slope=-3.581，Y-Inter=43.572;C：MDPV熒光標(biāo)記 E=93.4%，R2=1，Slope=-3.490，Y-Inter=41.517。

2.4多重q-PCR的重復(fù)性

選取10倍梯度稀釋為1 μl 1×106～1×104拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行q-PCR。組內(nèi)重復(fù)連續(xù)做3次，組間重復(fù)是在3個不同的時間分別做3次，每次3個重復(fù)。結(jié)果（表4）顯示DEV的組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為0.60%～1.40%和1.09%～3.22%;DTMUV的組內(nèi)的變異系數(shù)為1.04%～2.28%，組間變異系數(shù)為1.66%～3.67%;MDPV組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為1.02%～2.67%和1.28%～2.58%。因此，基于TaqMan探針的三重q-PCR檢測方法重復(fù)性好。

2.5多重q-PCR的特異性

對DTMUV的cDNA，DEV和MDPV的DNA（陽性對照），無菌超純水（陰性對照）以及H9N2 AIV、GPV、DRV、MDRV、NDV、DHAV-Ⅰ6種主要鴨病毒的DNA或cDNA進(jìn)行多重q-PCR檢測。結(jié)果表明，H9N2 AIV、GPV、DRV、MDRV、NDV、DHAV-Ⅰ 6種主要鴨病毒和陰性對照的檢測結(jié)果均為陰性（未檢測到熒光信號），而DTMUV、DEV、MDPV（圖5）均可被檢測到，說明建立多重q-PCR方法特異性強(qiáng)。

1～7： H9N2 AIV、GPV、DRV、MDRV、NDV、DHAV-Ⅰ、陰性對照。

2.6臨床采集樣品的檢測結(jié)果

應(yīng)用建立的多重q-PCR方法對臨床采集的198份樣品的DNA或cDNA進(jìn)行檢測，靈璧地區(qū)DTMUV、DEV和MDPV 3種病毒陽性率分別為8.3%（4/48），1.5%（3/48）和10.4%（5/48）;沛縣地區(qū)DTMUV的檢出率為6.1%（5/82），其他2種病毒則沒有檢出;睢寧地區(qū)DTMUV和DEV的陽性率分別是2.9%（1/35）和8.6%（3/35）;宿遷地區(qū)DTMUV和DEV的陽性率為1.5%（1/68）和2.9%（2/68）;睢寧和宿遷地區(qū)均無MDPV檢出。圖6顯示了在198份樣品中3種病毒的單獨感染、混合的情況，圖中數(shù)字表示三重q-PCR核酸檢出陽性的樣品數(shù)量，并集部分為核酸檢出陽性的混合感染數(shù)量。198份疑似組織病料同時運用常規(guī)PCR方法進(jìn)行了檢測，安徽地區(qū)DTMUV、DEV 和MDPV陽性檢出率分別為6.25%（3/48），6.25%（3/48）和8.33%（4/48），江蘇沛縣DTMUV的檢出率為4.87%（4/82），同樣無DEV、MDPV檢出。江蘇睢寧和宿遷臨床樣品常規(guī)PCR檢測結(jié)果與q-PCR檢測結(jié)果一致。由此可見，q-PCR方法較常規(guī)PCR方法更加準(zhǔn)確可靠。

DTMUV：鴨坦布蘇病毒;DEV：鴨腸炎病毒;MDPV：番鴨細(xì)小病毒。

3討論

DTMUV屬于黃病毒屬、黃病毒科，是一種單股正鏈RNA病毒，病毒基因組編碼包括衣殼（C）、前膜（PrM）、后膜（M）和包膜（E）及7個在3′末端編碼的非結(jié)構(gòu)（NS）蛋白（即NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5）[8-11]。DEV屬于皰疹病毒科馬立克病毒屬的DNA囊膜病毒，DEV能引起鴨一種急性、熱性、敗血性、高度傳染性疫病，不同日齡的鴨均可感染[12-13]。DEV侵入機(jī)體后首先攻擊機(jī)體的免疫器官， 導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫受到嚴(yán)重的破壞，所以病毒感染機(jī)體后容易引起免疫抑制和其他病毒繼發(fā)感染而加快死亡[14]。MDPV屬于細(xì)小病毒科依賴病毒屬的單鏈、線狀、無囊膜 DNA 病毒[15-16]，主要感染 1～3周齡雛番鴨，俗稱“三周病”，依據(jù)年齡的不同，致死率高達(dá)50%～80%[17]。

隨著中國水禽養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，及時準(zhǔn)確檢測和診斷水禽病毒病是疫病監(jiān)測和防控的重要組成部分。目前，水禽病毒病的檢測診斷主要依靠臨床癥狀、病理變化、血清學(xué)、常規(guī)PCR檢測等方法[18-21]，主要適應(yīng)于檢測單一感染，然而水禽病毒病常常表現(xiàn)為混合感染，常規(guī)檢測難以準(zhǔn)確判定。常規(guī)PCR方法僅用于病原定性，無法定量，并且伴隨著交叉感染的風(fēng)險（導(dǎo)致假陽性）和提取物質(zhì)量差（導(dǎo)致假陰性）[22]等問題。

基于TaqMan探針的多重q-PCR是一種快速、高特異性、高靈敏度和高重現(xiàn)性的檢測方法，是針對水禽養(yǎng)殖中單一病毒感染或多病毒混合感染最為快速且有效的檢測方法。研究結(jié)果表明二重q-PCR檢測方法已成功運用到水禽病毒性疫病檢測中，張艷芳等[23]建立了DPV及DTMUV TaqMan二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法，2種病毒的檢測靈敏度均可達(dá)100個拷貝;曾婷婷等[24]建立了DTMUV與產(chǎn)蛋下降綜合征病毒二重TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法，檢測靈敏度為100個拷貝。本研究中建立的TaqMan三重?zé)晒舛縋CR檢測方法，對DEV的檢測靈敏度為10個拷貝，對DTMUV及MDPV的檢測靈敏度為100個拷貝，比常規(guī)PCR靈敏度高100倍左右。該方法中建立的3個標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的相關(guān)性和擴(kuò)增效率，相關(guān)系數(shù)都在0.997以上，擴(kuò)增效率為90%～110%，從1×107～1×102拷貝的質(zhì)粒均呈良好的線性關(guān)系。從樣品研磨處理開始，大概3～4 h可以得到檢測結(jié)果。這相比于血清學(xué)檢測方法速度快、準(zhǔn)確性高、操作簡便、敏感性高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，因此非常適合多病毒共感染的診斷、定量分析及流行病學(xué)監(jiān)測，為臨床上DEV、DTMUV、MDPV的快速診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查提供了有效手段。

參考文獻(xiàn)：

[1]GUO Y F， CHENG A C， WANG M S. Development of TaqMan MGB fluorescent real-time PCR assay for the detection of anatid herpesvirus 1[J]. Virology Journal， 2009， 6（1）：71.

[2]SANDHU T S， SHAWKY S A. Duck virus enteritis （Duck plague） [M]. Iowa State Press： Diseases of Poultry 11th edition，2003： 354-363.

[3]MONTGOMERY R D， STEIN G J R， NOVILLA M N， et al. An outbreak of duck virus enteritis （duck plague） in a captive flock of mixed waterfowl[J]. Avian Dis， 1981， 25： 207-213.

[4]LIU P， LU H， LI S， et al. Duck egg drop syndrome virus：an emerging Tembusu-related flavivirus in China[J]. Sci China Life Sci， 2013， 56（8）： 701-710.

[5]趙冬敏，黃欣梅，劉宇卓，等. 新型黃病毒在種鵝中垂直傳播的研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2012， 43（1）： 99-102.

[6]WANG J， LING J， WANG Z， et al. Molecular characterization of a novel Muscovy duck parvovirus isolate： evidence of recombination between classical MDPV and goose parvovirus strains[J]. BMC Vet Res， 2017， 13： 327.

[7]HUANG Y L， PANG V F， PAN C H， et al. Development of a reverse transcription multiplex real-time PCR for the detection and genotyping of classical swine fever virus[J]. J Virol Methods， 2009，160（1/2）：111-118.

[8]ZHANG W， CHEN S， SURESH M， et al. An updated review of avian-origin Tembusu virus： a newly emerging avian Flavivirus[J]. Journal of General Virology， 2017， 98：2413-2420.

[9]GUZMAN M G， HALSTEAD S B， ARTSOB H， et al. Dengue： a continuing global threat[J]. Nat Rev Microbiol， 2010， 8： 7-16.

[10]BECKER N， JST H， ZIEGLER U， et al. Epizootic emergence of Usutu virus in wild and captive birds in Germany[J]. PLoS One， 2012， 7（32）： 604.

[11]BALTIMORE D. Expression of animal virus genomes[J]. Bacteriol Rev，1971， 35： 235-241.

[12]程安春. 鴨瘟[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2015.

[13]LI Y， HUANG B， MA X， et al. Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus [J]. Virology， 2009， 391（2）：151-161.

[14]劉忠偉，楊穎，江楠，等. 鴨瘟強(qiáng)毒人工感染雛鴨的顯微和超微病理學(xué)變化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45 （16）：140-147.

[15]劉家森，姜騫，司昌德，等. 番鴨細(xì)小病毒與鵝細(xì)小病毒PCR鑒別診斷方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2007， 37（6）：469-472.

[16]WANG J， LING J， WANG Z， et al. Molecular characterization of a novel Muscovy duck parvovirus isolate： evidence of recombination between classical MDPV and goose parvovirus strains[J]. BMC Vet Res， 2017， 13： 327-329.

[17]WAN C， CHEN H， FU Q， et al. Genomic characterization of goose parvovirus and Muscovy duck parvovirus coinfection in Fujian[J]. China Kafkas Univ Vet Fak Derg， 2015， 21（8）： 929-934.

[18]CHENG A， HAN X， ZHU D， et al. Application of indirect immuno-fluorescent staining method for detection and antigen location of duck enteritis virus in paraff in sections[J]. Chin J Vet Sci， 2008， 28： 871-875.

[19]劉玉偉，辛長勛，王碩，等.山東省鴨類感染豬圓環(huán)病毒3型的初步調(diào)查[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，50（5）：126-128.

[20]王永娟，董亞青，郭方超，等.鴨源H9N2亞型禽流感病毒RT-PCR檢測方法的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（1）：105-106，115.

[21]張艷雯，何永權(quán)，吳云月，等. 廣西雞源H9N2亞型禽流感病毒分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，49（4）：780-786.

[22]HANSEN W R， BROWN S E， NASHOLD S W， et al. Identification of duck plague virus by polymerase chain reaction[J]. Avian Dis， 1999， 43（1）：106-115.

[23]張艷芳，謝芝勛，謝麗基，等. 鴨坦布蘇病毒和鴨瘟病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（3）：77-82.

[24]曾婷婷，謝芝勛，謝麗基，等. 應(yīng)用二重實時熒光定量RT-PCR鑒別坦布蘇病毒與產(chǎn)蛋下降綜合征病毒[J]. 中國家禽， 2015， 37（1）：17-21.

（責(zé)任編輯：陳海霞）