一種苯醚氰菊酯膠體金免疫快速檢測試紙條的研制

吳小勝 賈芳芳 崔海峰 王兆芹 魏力杰 崔娜 趙正苗 萬宇平

摘要：通過制備苯醚氰菊酯半抗原，研制出一種能夠檢測蔬菜、水果中苯醚氰菊酯的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為1 μg/kg，檢測時間僅為15 min，假陽性率和假陰性率均為0，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求，該試紙條能夠應(yīng)用到基層實驗室的大批量樣本檢測，具有實際意義。

關(guān)鍵詞：苯醚氰菊酯;膠體金免疫層析試紙條;快速檢測

中圖分類號：TS201.6;S482.3+5?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）07-0196-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.040

Abstract： To establish a rapid assay for detection of cypermethrin in vegetables and fruit，and gold immunochromatography assay was studied. The limit of detection is 1 μg/kg. And we can obtain the results in 15 minutes. The assay gives no false positive and false negative results. The method is accurate，simple，reliable and convenient to rapidly detect cypermethrinon the spot.

Key words： cypermethrin; gold immunochromatography assay strip; rapid detection

苯醚氰菊酯屬于擬除蟲菊酯類殺蟲劑，擬除蟲菊酯類殺蟲劑是中國應(yīng)用范圍非常廣泛的農(nóng)藥種類。苯醚氰菊酯分子式為C24H25NO3，作為新一代衛(wèi)生殺蟲劑，主要用于防治蚊蠅、蟑螂等害蟲，低毒，目前研究報道較少，檢測方法局限于高效液相色譜法等儀器方法[1-10]。儀器方法較難應(yīng)用于基層實驗室的大批量樣本檢測，苯醚氰菊酯膠體金免疫層析試紙條較好地解決了該問題。該試紙條能夠檢測蔬菜、水果中的苯醚氰菊酯農(nóng)藥殘留，靈敏度較高，檢測時間短，檢測方便，是理想的初篩方法，并具有實際應(yīng)用價值。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

苯醚氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，氯金酸（HAuCl4·3H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）均購自美國Sigma公司，檸檬酸三鈉、碳酸鉀購自北京百欣試劑公司;樣本提取劑、樣本復(fù)溶液、膠體金分析儀由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供;渦旋儀、均質(zhì)器均購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.2?方法

1.2.1?苯醚氰菊酯半抗原的制備

1）取苯醚氰菊酯（化合物a）0.375 g，加四氫呋喃30 mL溶解，0～5 ℃攪拌20 min，加氫化鋁鋰0.11 g，恢復(fù)到室溫，逐漸加熱回流反應(yīng)4 h。停止反應(yīng)，加冰水30 mL，乙酸乙酯30 mL×3，萃取3次，合并有機(jī)相，蒸干，二氯甲烷/正己烷（V/V，1/10）80 mL重結(jié)晶，得到0.34 g產(chǎn)物化合物b，收率91.89%。

2）取0.34 g化合物b，加乙醇50 mL溶解，加1-甲?；h(huán)丙烷-2-羧酸0.12 g，加三乙胺0.1 mL，室溫攪拌8 h，轉(zhuǎn)移到0～5 ℃攪拌10 min，加硼氫化鈉0.11 g，繼續(xù)攪拌1 h。反應(yīng)停止，旋蒸蒸干，加水30 mL，乙酸乙酯30 mL×3，萃取3次，合并有機(jī)相，蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷/甲醇（V/V，10/1）洗脫分離，得到0.38 g半抗原產(chǎn)物化合物d（圖1），收率為88.37%。

1.2.2?免疫原的制備

1）苯醚氰菊酯半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物合成。取20 mg化合物d，加2 mL DMF溶解，加17 mg NHS、23 mg EDC，室溫攪拌1 h，得到半抗原活化液A液，取BSA 100 mg，加0.05 mol/L PB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4 ℃攪拌過夜，0.02 mol/L PB緩沖液透析純化，得到免疫原苯醚氰菊酯-BSA，-20 ℃保存，備用。

2）苯醚氰菊酯半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)物合成。取12 mg化合物d，加2 mL DMF溶解，加11 mg NHS、17 mg EDC，室溫攪拌1 h，得到半抗原活化液A液，取卵清蛋白80 mg，加0.05 mol/L PB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4 ℃攪拌過夜，0.02 mol/L PB緩沖液透析純化，得到免疫原苯醚氰菊酯-OVA，-20 ℃保存，備用。

1.2.3?膠體金的制備?取0.01%氯金酸水溶液100 mL加熱至沸騰;一邊攪拌，一邊加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5 mL;待氯金酸水溶液變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)煮沸15 min，冷卻后，4 ℃避光保存。

1.2.4?苯醚氰菊酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備?在磁力攪拌下，用0.2 mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至7.2，每毫升膠體金溶液中加入50 μg苯醚氰菊酯單克隆抗體，混勻，靜置10 min，加入10% BSA，使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%，靜置10 min。離心、洗滌、重懸，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5?標(biāo)記物凍干?將100 μL苯醚氰菊酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物加入到微孔板中，置于冷凍干燥機(jī)，冷阱溫度為-50 ℃，預(yù)凍3 h，再真空干燥15 h，即得到苯醚氰菊酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干的微孔試劑。

1.2.6?檢測方法?向微孔中加入100 mL待檢樣本溶液，混勻，室溫下孵育3 min，吸取70 mL滴至試紙條上，反應(yīng)10 min，根據(jù)圖2判定結(jié)果或通過膠體金分析儀讀取檢測結(jié)果。其他時間判讀無效。

1.2.7?樣本檢測限?在空白蔬菜、水果樣本中分別添加苯醚氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μg/L，按照“1.2.6”用3批試紙條進(jìn)行檢測，每個濃度重復(fù)5次，根據(jù)試驗結(jié)果確定樣本檢測限。

1.2.8?試紙條的檢測

1）特異性。分別配制500 μg/L氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等藥物，用此試紙條檢測，重復(fù)3次，判斷試紙條的特異性。

2）準(zhǔn)確性。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性。取經(jīng)儀器確證的50份陰性蔬菜、水果樣品（質(zhì)量濃度小于1 μg/kg），50份陽性蔬菜、水果樣品（質(zhì)量濃度大于1 μg/kg），用該試紙條檢測苯醚氰菊酯藥物殘留，計算假陽性率和假陰性率?！掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定：試紙條假陽性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為零。

3）穩(wěn)定性。將試紙條保存于2～8 ℃環(huán)境中，每隔1個月檢測試紙條的準(zhǔn)確性，連續(xù)測定15個月。具體方法為：分別檢測經(jīng)儀器確證的20份陰性蔬菜、水果樣品（質(zhì)量濃度小于1 μg/kg），20份陽性蔬菜、水果樣品（質(zhì)量濃度大于1 μg/kg），重復(fù)測定2次，根據(jù)試驗結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性。

2?結(jié)果與分析

2.1?膠體金的鑒定

肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好、無雜質(zhì)、透明度較高。取冷卻后的膠體金溶液在透射電鏡下觀察膠體金顆粒的均一程度，測量膠體金顆粒粒徑，經(jīng)透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布較均勻，粒徑為20 nm左右（圖3）。

2.2?樣本檢測限

配置苯醚氰菊酯濃度分別為0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μg/L的蔬菜、水果樣品進(jìn)行檢測，確定檢測限。該試紙條的檢測限為1 μg/kg，結(jié)果見表1、圖4、圖5。

2.3?特異性

該試紙條檢測500 μg/L的氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等藥物，結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好（表2）。

2.4?準(zhǔn)確性

用該試紙條檢測50份陰性蔬菜、水果樣品，檢測結(jié)果均為陰性，說明假陽性率低于5%;用該試紙條檢測50份陽性蔬菜、水果樣品，試紙條檢測結(jié)果均為陽性（表3），說明試紙條假陰性率為零，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求。

2.5?穩(wěn)定性

12個月內(nèi)，試紙條的假陽性率和假陰性率均符合要求，從第13個月起，試紙條會出現(xiàn)少量失效、假陰性等現(xiàn)象（表4）。

3?討論

目前，有關(guān)檢測苯醚氰菊酯的文獻(xiàn)非常有限，通過制備苯醚氰菊酯半抗原，讓其與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求，對試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等性能測試，均符合要求。試紙條的檢測時間僅為15 min，檢測限為1 μg/kg，比現(xiàn)有文獻(xiàn)中儀器方法用時更短，操作更簡便。

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