酵母多肽的分離純化及其化妝品功效研究

付豪 劉平平 朱劍鋒 李燕龍 李萌 王昌濤

摘要：通過反復(fù)凍融與超聲破碎結(jié)合的方法破碎酵母細胞提取酵母蛋白，并以等電點沉淀法對酵母發(fā)酵上清液以及酵母細胞液進行純化，得到粗蛋白，研究蛋白質(zhì)的抗氧化能力以及抑制酪氨酸酶的能力。結(jié)果顯示，3種釀酒酵母上清蛋白都具有很好的清除DPPH的能力，2.6 g/L左右的濃度其清除率能達到72%左右;不同釀酒酵母上清蛋白中，釀酒酵母1號上清蛋白對酪氨酸酶具有更好的抑制效果;不同釀酒酵母粗蛋白在0.45 g/L左右基本上不具有清除DPPH自由基的能力，釀酒酵母1號粗蛋白對酪氨酸酶的抑制率相對于其他的酵母粗蛋白來說也更好;3.5 g/L的不同釀酒酵母多肽對DPPH 自由基的清除率可達50%左右，對酪氨酸酶的抑制率也可達到12%左右。

關(guān)鍵詞：酵母菌;多肽;抗氧化;美白

中圖分類號：TQ658?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）07-0184-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.037

Abstract： yeast protein was extracted from yeast cells by means of repeated freeze-thaw and ultrasonic crushing. The supernatant of yeast fermentation and yeast cell fluid were purified by isoelectric point precipitation method. Crude protein was obtained，and the antioxidant capacity of protein and tyrosinase inhibition ability were studied. The results showed that the supernatant of saccharomyces cerevisiae，yellow wine yeast and sake yeast had good DPPH scavenging ability，and the concentration of 2.6g /L could reach 72%. The supernatant of saccharomyces cerevisiae among the three yeast supernatant proteins had better inhibitory effect on tyrosinase. The three yeast crude proteins basically had no DPPH free radical scavenging ability at about 0.45g /L，and the inhibition rate of saccharomyces cerevisiae crude proteins on tyrosinase was better than that of other yeast crude proteins. The DPPH radical scavenging rate and tyrosinase inhibition rate of 3 kinds of yeast polypeptides with 3.5 g/L were about 50% and 12% respectively.

Key words： yeast; polypeptide; antioxidant; whitening

酵母菌是一種革蘭氏陽性單細胞真菌，屬于兼性厭氧菌[1，2]。酵母中含有豐富的蛋白質(zhì)，一般超過40%，甚至高達60%[3]。酵母含有完整的氨基酸群，包括人體必需的8種氨基酸，特別是在谷物蛋白中含量較少的賴氨酸，在酵母中含量較高[4]。多肽和皮膚細胞間存在比較好的親和性，相比于核酸、蛋白質(zhì)等高分子天然生活性物質(zhì)，多肽類易溶于水，分子質(zhì)量小，易被吸收利用，在美白、抗氧化和修復(fù)肌膚等功效方面，活性多肽的性能遠優(yōu)于分子較大的蛋白質(zhì)[5]，且其具有相對的安全穩(wěn)定性。研究表明，具有抗皺成分的多肽，如棕櫚酰五肽（Pal-KTTKS）、棕櫚酰六肽（Pal-VGVAPG）能夠促進透明質(zhì)酸、彈性蛋白和膠原蛋白的合成，從而提高皮膚含水量，減少皺紋的產(chǎn)生[6];通過頭發(fā)角蛋白的變性或消化得到的多肽，通過酯化反應(yīng)得到酰化或者酯化的修飾應(yīng)用于頭發(fā)護理，使頭發(fā)軟化，保持光澤并且具有良好的梳理性。

隨著生活水平的提高，人們對化妝品的需求也越來越多，對化妝品的要求也越來越高，近年來，化妝品配方中有多添加天然原料而少添加化工合成原料的趨勢，尤其是在延緩衰老、美白這幾個方面。從近幾年的化妝品銷售額和人均水平來看，含生物活性物的化妝品具有廣闊的發(fā)展空間，加之中國酵母資源豐富且是產(chǎn)酵母大國，多有將廢棄的酵母蛋白不經(jīng)再利用而排入河流中，造成大量的資源浪費和污染，故利用酵母菌得到酵母多肽應(yīng)用在化妝品中具有較大的經(jīng)濟和現(xiàn)實意義。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

3種酵母購自北京市食品釀造研究所;酵母浸粉、蛋白胨購自北京奧博星公司;DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）購自美國Sigma公司;牛血清蛋白購自北京百靈威公司;福林酚購自北京迪朗公司;碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鈉、硫酸銅、無水乙醇皆為市售分析純。

HWS-280型智能恒溫恒濕箱（寧波江南儀器廠）; RJ-LD-IIB型低速大容量多管離心機（北京柏萊斯特公司）;JY-92-IIN型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝公司）;Sigma3-18K型臺式高速冷凍離心機（廣州深華公司）;普通型透析袋（8000-14000）（上海源葉公司）;SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)公司）;RE-5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2?試驗方法

1.2.1?酵母培養(yǎng)?按2%、2%、1%（w/v）比例準確稱量蛋白胨、葡萄糖和酵母浸粉，溶于錐形瓶中，攪拌均勻后置于高壓鍋內(nèi)滅菌。取出后冷卻至室溫，紫外滅菌后，分別將釀酒酵母1號、釀酒酵母2號和釀酒酵母3號菌株接種至培養(yǎng)基中，貼好標簽，記錄時間，放入恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2?酵母蛋白分離純化

1）酵母上清及酵母細胞液的制備。將3種培養(yǎng)后的酵母菌取出，離心后分裝上清液和沉淀，為防止酵母菌再生長以及其他菌的污染，將分離后的上清液和菌泥再次放入高壓鍋中滅菌，輔以紫外滅菌，上清液4 ℃保存，酵母菌泥做后續(xù)處理。

用反復(fù)凍融法[7]與超聲破碎法結(jié)合的方法[8]對酵母菌泥中的酵母菌進行破碎。凍融法條件：加水量25%，冷卻溫度-20 ℃，冷凍時間2 h，解凍溫度25 ℃，解凍時間1 h，如此重復(fù)3～5次。超聲波細胞破碎條件：將去離子水加入被凍融后的菌泥中，使酵母濃度大約在20 g/L，冰浴。調(diào)節(jié)超聲參數(shù)，使變幅桿選擇開關(guān)在6，超聲總時間為13 min，超聲時間5 s，間歇時間7 s，報警溫度60 ℃，超聲功率400 W。

2）酵母上清液及細胞液蛋白純化。利用等電點沉淀法[9]沉淀分離得到蛋白質(zhì)的沉淀。配制1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH至10，反應(yīng)1 h后5 000 r/min下離心30 min，取上清液;用HCl溶液調(diào)節(jié)上清液，直至出現(xiàn)明顯的絮狀物，常溫靜置2 h，8 000?r/min下離心20 min，收集沉淀，用去離子水輕輕洗滌2～4次，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

透析除鹽[10]。用普通型透析袋（8 000-14 000）透析：將透析管剪成20 cm左右的小段，浸泡在2%碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA（pH=8）中將透析袋煮沸10 min，戴手套操作，用去離子水徹底漂洗透析袋，將一端用橡皮筋扎緊，注水檢驗是否漏水，再將樣液注入透析袋中，加入玻璃珠，扎緊另一端口子，放入干凈的大燒杯中或大量筒中，注滿去離子水靜置，每隔5 h換一次水，5次后取出透析袋，將里面的樣液取出，8 000 r/min下離心20 min冷凍保存，將透析袋置于1 mmol/L的EDTA液煮沸10 min后徹底漂洗，4 ℃去離子水中保存。將所得的樣品凍干得到粗蛋白樣品。

1.2.3?蛋白質(zhì)的含量測定?準確稱量除鹽后的蛋白質(zhì)，配制水溶液使其濃度在500 mg/L左右，用福林酚法測量蛋白質(zhì)的含量[11]。

試劑A：準確稱取10 g Na2CO3、2 g NaOH、0.25 g酒石酸鈉溶于500 mL去離子水中;試劑B：0.5 g硫酸銅溶于100 mL去離子水;將A與B按50∶1（體積比）的比例混合均勻即為試劑甲。將福林酚與去離子水按?1∶1（體積比）的比例混合即為試劑乙。

標準曲線的繪制：精準稱量結(jié)晶牛血清蛋白，溶于去離子水中，濃度為250 mg/L，分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準溶液，用水補足到1 mL，加入5 mL試劑甲迅速混合放入25 ℃水浴10 min，逐管加入試劑乙，立即混合，25 ℃水浴反應(yīng)30 min，在700 nm測量吸光度。以吸光度對蛋白質(zhì)濃度C進行線性回歸，得到回歸方程y=0.001 3x+0.023 6，R2=0.993 7。

樣品蛋白質(zhì)含量測定：取1 mL樣品溶液，加入5 mL試劑甲迅速混合放入25 ℃水浴10 min，逐管加入試劑乙，立即混合，25 ℃水浴反應(yīng)30 min，在700 nm測量吸光度。每種樣品3個重復(fù)。根據(jù)回歸方程計算出樣品的蛋白濃度，并計算出干重比。

樣品蛋白質(zhì)濃度=（樣品A700 nm-0.023 6）/0.013，樣品干重比=樣品蛋白質(zhì)濃度/總濃度。

1.2.4?多肽制備酶解及純化?根據(jù)上述得出的蛋白質(zhì)的干重比和總質(zhì)量計算出每種酵母菌得到的蛋白質(zhì)含量，用堿性蛋白酶（200 U/mg）酶解粗提的酵母蛋白[12]：酶解溫度55 ℃，pH=8.0;加酶量0.01%～0.10%;酶解時間3 h后，煮沸滅酶，待溫度冷卻至室溫后，用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)至pH 7.0，8 000 r/min下離心20 min，去上清液。

醇沉：取上述上清液，按1∶1（體積比）的比例加入冰乙醇，4 ℃下靜置12 h，8 000 r/min下離心20 min，取上清液，45 ℃下減壓旋蒸去除乙醇，取旋轉(zhuǎn)瓶中液體，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5?雙縮脲法檢測多肽含量[13]?雙縮脲試劑配制：溶解1.50 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0 g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）于500 mL去離子水中，在攪拌下加入300 mL的10%氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1 L，貯存在內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中以備使用。

標準牛血清蛋白溶液：牛血清蛋白溶液濃度為5 g/L，用0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液配制。

標準曲線的繪制：取干凈試管12支，分別加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL的標準蛋白溶液，用水補足到2 mL，然后加入4 mL雙縮脲試劑，在室溫下放置30 min，于540 nm波長下測量吸光度。

不同釀酒酵母酶解液測量：吸取2 mL待測液，加入4 mL雙縮脲試劑，在室溫下放置30 min，于540 nm波長下測量吸光度。根據(jù)標準曲線得出多肽濃度。

1.2.6?活性測定

1）抗氧化活性研究。對DPPH自由基清除作用[14]：取3 mL 的待測液與3 mL 的2×10-4 mol/L的DPPH溶液混勻（A1）;取3 mL的去離子水與3 mL 的2×10-4 mol/L的DPPH溶液混勻（A2）;取3 mL的去離子水與3 mL待測液混勻（A3）;避光反應(yīng)30 min后，517 nm下測A1、A2、A3管吸光度值。

DPPH自由基清除率（%）=（A3+A2-A1）/A2×100%

2）體外美白試驗。采用抑制酪氨酸酶法[15]。取17.91 g十二水磷酸氫二鈉溶于去離子水定容500 mL，得到溶液A;取7.8 g二水磷酸二氫鈉溶于去離子水定容500 mL，得到溶液B;分別取溶液A和溶液B 92.6、107.4 mL，配成200 mL的pH 6.8的PBS磷酸緩沖液。用35 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解0.05 g L-酪氨酸，再加入65 mL PBS磷酸緩沖液得0.05%的L-酪氨酸溶液。

按照表1配制不同的溶液。其中C1、C2為空白組，T1、T2為樣品組，C1為T1的對照，得到樣品的酪氨酸酶抑制率，C2為T2的對照，得到樣品本身的吸光度，減少試驗出現(xiàn)的隨機誤差。

C2管配好搖勻后，在37 ℃水浴鍋中水浴加熱10 min，波長475 nm下調(diào)零; C1管溶液配好搖勻，37 ℃水浴10 min后，加1 mL的酶活力為100 U/mL的酪氨酸酶，繼續(xù)水浴10 min，測定C1吸光度值。

按上述方法，以T2調(diào)零測定T1吸光度值。

樣品對酪氨酸酶的活性抑制率T=（C1-T1）/C1×100%

2?結(jié)果與分析

2.1?不同酵母蛋白的干重比

圖1所示為500 mg/L不同釀酒酵母粗蛋白中蛋白質(zhì)的含量及不同釀酒酵母蛋白的干重比。由回歸曲線方程計算經(jīng)過初步純化后500 mg/L的不同釀酒酵母細胞液中蛋白質(zhì)總濃度，分別為釀酒酵母1號177.23 mg/L、釀酒酵母2號153.38 mg/L、釀酒酵母3號138.77 mg/L，經(jīng)計算所得的不同釀酒酵母蛋白的干重比分別為釀酒酵母1號35.45%、釀酒酵母2號30.68%、釀酒酵母3號27.75%。再根據(jù)干重比得到每種酵母蛋白的總質(zhì)量，從而得知酶解時加酶量的范圍。

2.2?抗氧化活性研究

2.2.1?酵母發(fā)酵上清液對自由基清除能力?釀酒酵母1號、釀酒酵母2號、釀酒酵母3號發(fā)酵上清液對DPPH自由基的清除效果如圖2所示。所使用的釀酒酵母1號、釀酒酵母2號、釀酒酵母3號上清液的最高蛋白質(zhì)濃度分別為15.57、16.87、16.70 g/L。由圖2可知，當釀酒酵母1號、釀酒酵母2號上清液中的蛋白質(zhì)濃度含量很高時，其不具有清除DPPH自由基的效果，當將樣品稀釋即蛋白質(zhì)濃度降低時，釀酒酵母2號和釀酒酵母1號上清液對DPPH自由基的清除能力隨蛋白質(zhì)濃度的降低而升高，但當繼續(xù)降低蛋白質(zhì)濃度時，釀酒酵母1號上清對DPPH自由基的清除率降低;釀酒酵母3號上清對DPPH自由基的清除率隨蛋白質(zhì)濃度降低的降低而降低。由此可知，當釀酒酵母1號和釀酒酵母2號上清液中的蛋白質(zhì)濃度很高時，其對自由基的清除率很低，甚至會出現(xiàn)相反效果。

2.2.2?不同釀酒酵母提取物生物活性?以維生素C作為陽性對照檢測不同釀酒酵母多肽的抗氧化能力，其結(jié)果如圖3所示，圖中釀酒酵母1號、釀酒酵母2號、釀酒酵母3號多肽濃度分別為8.40、6.00、5.43 g/L。由圖3可知，3種釀酒酵母多肽都具有很好的還原性和清除DPPH自由基的作用。其中釀酒酵母3號多肽濃度最低，但其清除DPPH自由基的能力是最高的。

3?結(jié)論

通過培養(yǎng)不同釀酒酵母菌，以不同釀酒酵母菌本身作為原材料，利用超聲波法和反復(fù)凍融法協(xié)同作用來分離酵母蛋白，用等電點沉淀法提取得到酵母粗提蛋白，經(jīng)過除鹽初步純化，以福林酚法測定粗蛋白質(zhì)的含量，計算出干重比，從而得到酶解時需要加酶的范圍，再測量不同釀酒酵母菌的培養(yǎng)液和酶解后多肽的抗氧化性與美白功效。結(jié)果可知，不同釀酒酵母上清蛋白都具有很好的清除DPPH的能力，2.6 g/L左右的濃度清除率能達到72%左右;在一定濃度范圍內(nèi)，酵母上清液蛋白的抗氧化性能隨著濃度的升高而增大，且有一個閾值;不同釀酒酵母上清蛋白均具有更好的抑制酪氨酸酶的效果;不同釀酒酵母粗蛋白在0.45 g/L左右基本上不具有清除DPPH自由基的能力，釀酒酵母1號粗蛋白對酪氨酸酶的抑制率相對于其他的釀酒酵母粗蛋白來說更高;3.5 g/L的釀酒酵母1號多肽對DPPH 自由基的清除率可達50%左右，對酪氨酸酶的抑制率也可達到12%左右。本研究通過研究樣品對DPPH自由基的清除作用及對酪氨酸酶的抑制作用來檢測不同釀酒酵母樣品的抗氧化及美白效果，為酵母多肽在產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。

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