木犀草素治療卵巢過(guò)度刺激綜合征的實(shí)驗(yàn)研究*

張曦倩， 姚俐， 羅燕群， 朱秀蘭， 許虹， 董梅， 劉風(fēng)華

廣東省婦幼保健院生殖中心(廣東廣州 511442)

卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過(guò)程中應(yīng)用促排卵藥物所導(dǎo)致的醫(yī)源性疾病，主要表現(xiàn)為卵巢增大、胸腹腔積液、血液濃縮等，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂、凝血功能障礙、腎功能損害，不僅影響胚胎發(fā)育和妊娠率，甚至危及患者生命[1-2]。OHSS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中卵巢組織炎癥過(guò)度反應(yīng)和毛細(xì)血管通透性增加在其中發(fā)揮重要作用[3]。目前臨床對(duì)OHSS的治療主要是對(duì)癥支持治療，尚無(wú)特效手段，因此，尋求新的治療策略迫在眉睫。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，中藥方劑或制劑在OHSS中的治療可能具有一定的前景，如補(bǔ)腎安胎方可減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡等[4]。然而，中藥處方往往有效成分不明，給臨床工作及研究帶來(lái)很大困難，明確治療OHSS的有效成分意義重大。木犀草素(luteolin)是一種天然黃酮類化合物，存在于多種中藥及天然植物中，具有多種藥理活性，如抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用[5]，此外，研究表明木犀草素在調(diào)控血管通透性方面亦作用顯著[6- 7]?；谀鞠菟氐乃幚碜饔眉癘HSS的發(fā)病機(jī)制，我們猜測(cè)木犀草素可能對(duì)OHSS具有一定的治療作用。2018年6月至2019年5月本研究以O(shè)HSS模型大鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)觀察卵巢組織中炎癥因子白細(xì)胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及受體(VEGFR)-2的表達(dá)，并首次探討木犀草素對(duì)OHSS模型大鼠炎癥反應(yīng)及血管通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SFP級(jí)健康未成熟雌性SD大鼠24只(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，22日齡，(50.2±4.71)g，飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物飼養(yǎng)房，自然晝夜光線照明，室內(nèi)通風(fēng)好，相對(duì)濕度40%～70%，室溫(22±2)℃，光暗周期為12 h，水食自取，喂飼普通飼料。

1.2 試劑與儀器 木犀草素(分子式：C15H10O6，分子：286.24，純度98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；羧甲基纖維素鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；孕馬血清促性腺激素(PMSG)購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；人絨毛膜促性腺激素(HCG)購(gòu)自上海淳麥生物科技有限公司；大鼠VEGF、IL-6酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；VEGFR-2一抗、Actin一抗及相應(yīng)二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；其他實(shí)驗(yàn)常用試劑購(gòu)自廣州永津生物有限公司；多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Spectramax M5型；Western blot電泳儀、電轉(zhuǎn)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 造模方法及給藥方法 隨機(jī)將大鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和木犀草素組，每組8只。其中模型對(duì)照組和木犀草素組按改良的Ujioka等[8]的方法建立OHSS模型：每只大鼠從22～25日齡連續(xù)皮下注射含10 IU PMSG 的0.1 mL 生理鹽水，1次/d，末次注射PMSG 1 d后予皮下注射含100 IU HCG的 0.1 mL 生理鹽水；造模過(guò)程中，正常對(duì)照組采用0.1 mL生理鹽水皮下注射。木犀草素組采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液將木犀草素配成的混懸液20 mg/(kg·d)灌胃，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組分別給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，與造模同時(shí)開始，以上3組組均于22日齡開始灌胃，連續(xù)給藥1周。

1.4 標(biāo)本采集 于HCG注射48 h后(28日齡最后1次灌胃給藥后)頸椎脫臼法處死大鼠，分離雙側(cè)卵巢并稱重，稱重后快速勻漿-20℃保存，用于ELISA 和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.5 ELISA檢測(cè)各組大鼠卵巢組織中VEGF、IL-6的水平 各組大鼠卵巢勻漿組織中VEGF、IL-6的水平測(cè)定采用ELISA法，檢測(cè)步驟參考相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書。

1.6 Western blot法檢測(cè)各組大鼠卵巢組織VEGFR-2蛋白的表達(dá) 各組大鼠卵巢組織勻漿后， BCA法行蛋白定量，每組各取30 μg蛋白液，行10%SDS-Page凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗VEGFR-2(1∶1 000)、Actin (1∶2 000)，4℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗(1∶2 000)，室溫孵育1h后行發(fā)光顯影，Image J分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢重量比較 模型對(duì)照組大鼠卵巢重量明顯高于正常對(duì)照組(t=17.93,P<0.01)；而木犀草素連續(xù)灌胃后，大鼠的卵巢重量明顯減輕(t=5.505,P<0.01)。見圖1。

注：*與模型對(duì)照組比較P<0.01

2.2 各組大鼠卵巢組織VEGF及IL-6水平的比較 模型對(duì)照組大鼠卵巢VEGF的水平明顯高于正常對(duì)照組(t=18.90,P<0.01)，而木犀草素連續(xù)灌胃后，大鼠的卵巢VEGF的水平明顯降低(t=15.27,P<0.01)，見圖2-A。模型對(duì)照組大鼠卵巢IL-6的水平明顯高于正常對(duì)照組(t=16.22,P<0.01)，而木犀草素連續(xù)灌胃后，大鼠的卵巢IL-6的水平明顯降低(t=12.89,P<0.01)，見圖2-B。

注：A:VEGF;B:IL-6; *與模型對(duì)照組比較P<0.01

2.3 各組大鼠卵巢組織VEGFR-2表達(dá)水平的比較 模型對(duì)照組大鼠卵巢VEGFR-2的水平明顯高于正常對(duì)照組(t=13.63,P<0.01)，而木犀草素連續(xù)灌胃后，大鼠的卵巢VEGFR-2的表達(dá)水平明顯降低(t=14.55,P<0.01)。見圖3。

注：A：各組VEGFR-2蛋白表達(dá)；B：各組蛋白條帶分析；*與模型對(duì)照組比較P<0.01

3 討論

OHSS的經(jīng)典生理變化為小動(dòng)脈血管擴(kuò)張和血管通透性增加，導(dǎo)致血管內(nèi)液體外滲，引起第三間隙液體潴留，造成低血容量、低鈉血癥、血液濃縮、中心靜脈壓降低[3, 9-10]。OHSS的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，近年來(lái)的研究認(rèn)為，VEGF、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，以及全身或局部的炎性介質(zhì)如IL-6、IL-11、PGE2及COX-2均可能直接或間接參與了OHSS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[3, 11-13]。其中，VEGF被認(rèn)為是引起OHSS患者卵巢血管通透性增加的最重要因素[3, 11]。HCG在OHSS的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其作用于卵巢顆粒細(xì)胞后可使VEGF mRNA及VEGFR-2表達(dá)增加，VEGF作用于卵巢組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF-2使其磷酸化，而后調(diào)控血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-Cadherin)、緊密連接蛋白Nectin 2及Claudin 5等連接蛋白，并抑制此3種連接蛋白的表達(dá)，升高的VEGF抑制這3種連接蛋白的表達(dá)，進(jìn)而使內(nèi)皮細(xì)胞間的連接變得松散，血管通透性增加，加快OHSS的發(fā)生[11, 14- 15]。急性全身或局部炎癥在OHSS發(fā)病過(guò)程中同樣起著重要作用，研究人員發(fā)現(xiàn)，OHSS患者血清中早期炎癥反應(yīng)因子C反應(yīng)蛋白的水平明顯升高[16]。Geva 等[17]發(fā)現(xiàn), OHSS 患者取卵日卵泡液中的IL-6 水平較正常對(duì)照組相比顯著升高，并認(rèn)為取卵日卵泡液中的IL-6 濃度可作為高危者OHSS 早期發(fā)展的預(yù)測(cè)因子。Atilgan等[18]在OHSS大鼠中同樣發(fā)現(xiàn)炎癥因子如IL-6、TNF-α等顯著升高，而抑制炎癥反應(yīng)可顯著改善OHSS病理發(fā)生、發(fā)展。本研究中，我們采用經(jīng)典的造模手段建立OHSS大鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)果一致，模型對(duì)照組大鼠的卵巢重量較正常對(duì)照組明顯增多；ELISA結(jié)果顯示，模型對(duì)照大鼠卵巢組織中VEGF和炎癥因子IL-6和水平顯著升高，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照大鼠卵巢組織中VEGFR-2蛋白表達(dá)明顯升高，表明本研究OHSS造模成功。

由于OHSS的發(fā)病機(jī)制尚未明確，治療上以對(duì)癥支持治療為主，效果不盡人意，嚴(yán)重者不得不終止妊娠[19-20]?？紤]到炎癥反應(yīng)和毛細(xì)血管通透性增高在OHSS發(fā)生發(fā)展中的地位，探尋具有抗炎和調(diào)控血管通透性的治療策略，對(duì)于OHSS的治療可能具有較好的前景。黃酮類化合物木犀草素在自然界中分布廣泛，因其最初是從草本植物木犀草的枝葉中分離出而得名，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)金銀花、菊花、荊芥、黃芩屬、紫蘇屬等天然藥材中均含有木犀草素，其因具有抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用備受關(guān)注。既往國(guó)內(nèi)外在體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素劑量高達(dá)每天100 mg/kg 也未有明顯毒副作用的報(bào)道[21-22]，而本研究所用木犀草素濃度為每天20 mg/kg,遠(yuǎn)低于每天100 mg/kg，因此我們認(rèn)為該濃度較為安全。有研究證實(shí)，木犀草素可以通過(guò)多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮其藥理作用，包括MAPK、Akt、NF-κB等，其可以有效改善LPS誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子-α、IL-6生成[23-27]。本研究也發(fā)現(xiàn)，使用木犀草素連續(xù)給藥后，OHSS大鼠卵巢組織中炎癥因子IL-6的水平顯著降低。此外，木犀草素在調(diào)控血管通透性方面亦作用顯著。Cook等[6]發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過(guò)阻斷VEGF生成調(diào)控血管通透性，進(jìn)而抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。木犀草素還可以通過(guò)抑制炎癥因子產(chǎn)生及抑制VEGF生成達(dá)到治療過(guò)敏性/炎癥性皮膚病的效果[28]。然而目前尚未有研究使用木犀草素對(duì)OHSS進(jìn)行治療探討。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)使用木犀草素給藥后，OHSS模型大鼠的卵巢重量顯著減輕；ELISA結(jié)果顯示，木犀草素可顯著降低OHSS模型大鼠卵巢組織中VEGF和炎癥因子IL-6和水平；Western blot結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，木犀草素可有效降低OHSS模型大鼠卵巢組織中VEGFR-2蛋白的表達(dá)，表明木犀草素可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)控血管通透性從而達(dá)到治療OHSS的目的。

綜上所述，木犀草素可有效減輕OHSS模型對(duì)照組大鼠的卵巢重量，以及抑制OHSS模型大鼠卵巢組織IL-6、VEGF的升高，并降低VEGFR-2的表達(dá)水平，對(duì)未來(lái)OHSS的臨床治療研究提供參考，且對(duì)中藥或天然植物藥治療OHSS提供一定的理論依據(jù)。然而，本研究目前只從現(xiàn)象學(xué)層面觀察了木犀草素治療OHSS的作用，并未在分子水平和基因?qū)用嫔钊胩接懫淇寡滓约罢{(diào)控血管通透性的作用機(jī)制，我們將在今后開展進(jìn)一步工作予以證實(shí)。