基于高效高壓差低溫連續(xù)式提取技術(shù)的五指毛桃提取工藝研究

劉常青，黃偉明，王旭龍，宋力飛，馬志鵬

(廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510663)

五指毛桃，別名五指牛奶、土黃芪，為?？浦参锎秩~榕(FicushirtaVahl.)干燥后的根，是華南地區(qū)煲湯保健常用藥食兩用中藥材，具有健脾利濕、益肺止咳、舒筋通絡(luò)的功效，常用于脾虛浮腫、食少無力、肝炎、風(fēng)濕痹痛、肺癆咳嗽等癥的治療[1-3]?，F(xiàn)代研究表明，五指毛桃含有豐富的多糖、生物堿、香豆素、黃酮等活性物質(zhì)，其中五指毛桃的主要有效成分為香豆素類化合物——補骨脂素，具有消炎、抗病毒、抑制腫瘤、抗凝、免疫調(diào)節(jié)和影響藥物代謝等作用[4-7]。目前文獻(xiàn)報道的五指毛桃中補骨脂素的提取溶劑多為有機溶劑，方法各不相同，如甲醇冷浸提取法、三氯甲烷水浴回流提取法、乙醇超聲提取法、甲醇超聲提取法等[8-12]。有機溶劑易殘留，造成安全隱患。本研究首次運用高效高壓差低溫連續(xù)式提取分離濃縮技術(shù)及成套裝備對五指毛桃進(jìn)行提取，并以五指毛桃中主要有效成分補骨脂素的提取率為指標(biāo)，對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，對五指毛桃提取物的規(guī)?；崛√峁┮欢ǖ募夹g(shù)支持與理論指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

五指毛桃(玉林市弘健中藥材有限公司)；補骨脂素對照品(批號：190113，純度：≥99%)；甲醇(分析純)；乙腈(色譜純)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效高壓差低溫連續(xù)式提取分離濃縮技術(shù)及成套裝備(廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司)；Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent公司)；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 工藝流程

五指毛桃提取工藝流程：粉碎→高壓差提取→離心(取清液)→微濾(取清液)→反滲透(取濃液)→真空濃縮→五指毛桃提取物。

2.2 補骨脂素含量的測定

2.2.1 供試品制備 將五指毛桃粉碎，精密稱取五指毛桃細(xì)碎品1 g，加入10 mL甲醇，超聲(功率100 W，頻率40 kHz)提取30 min(水溫升高約1 ℃)，冷卻至室溫后用甲醇補足失質(zhì)量，搖勻，濾過，濾過液用0.45 μm微孔濾膜(有機)過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：DIKMA Platisil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：55%乙腈(B)-水，運行時間：15 min，檢測波長：246 nm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取補骨脂素對照品10 mg，加甲醇溶解定容至10 mL。分別精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用甲醇稀釋配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“2.2.2”項色譜條件下進(jìn)樣，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=136221X+752.5，R2=0.999 4。結(jié)果表明，補骨脂素在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)與其峰面積積分線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取0.03 mg/mL對照品溶液及供試品溶液，分別按照“2.2.2”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果對照品溶液峰面積的RSD為0.68%，供試品溶液RSD為1.97%。

2.2.5 重復(fù)性試驗 取同一批次五指毛桃藥材6份，每份1 g，按照“2.2.1”項下方法對供試品溶液進(jìn)行制備，分別進(jìn)樣測定補骨脂素的峰面積，結(jié)果RSD為1.83%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量20 μL，分別記錄補骨脂素的峰面積，平均峰面積為30 587.52，RSD為1.32%，供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收試驗 精密稱取已知補骨脂素含量為0.22 mg/g的供試品6份，每份約0.5 g，依次加入濃度為0.01 mg/mL的對照品溶液10 mL，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積。補骨脂素平均回收率為101.27%，RSD為1.41%。

2.3 提取率的計算

2.4 單因素試驗

以水為溶劑，通過高效高壓差低溫連續(xù)式提取技術(shù)對五指毛桃進(jìn)行提取，以五指毛桃功效成分補骨脂素的提取率為評價指標(biāo)，選擇提取次數(shù)、提取料液比、提取壓力三個因素進(jìn)行單因素試驗，考查其對五指毛桃中補骨脂素提取率的影響。

2.4.1 提取次數(shù)對提取率的影響 固定提取料液比為1∶15，提取壓力為30 MPa，考察提取次數(shù)為1、2、3、4、5次條件下對補骨脂素提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 提取次數(shù)對提取率的影響

由圖1可知，提取次數(shù)在2～5次時提取率逐漸提高，在提取2次時出現(xiàn)明顯拐點，但在提取3次后提取率變化不明顯，綜合能耗、提取效率、濃縮效率等方面考量，將提取次數(shù)確定為2次。

2.4.2 提取料液比對提取率的影響 固定提取次數(shù)為2次，提取壓力為30 MPa，分別在提取料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30條件下進(jìn)行試驗，考察提取料液比對五指毛桃中補骨脂素提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取料液比對提取率的影響

隨著提取料液比的增大，提取率呈不斷增大趨勢，當(dāng)料液比為1∶20時，五指毛桃中補骨脂素提取率出現(xiàn)明顯拐點，當(dāng)料液比進(jìn)一步增大時，提取率趨勢變得平緩。因此，確定料液比為1∶20。

2.4.3 提取壓力對提取率的影響 固定提取次數(shù)為2次，提取料液比為1∶20，分別在提取壓力為20 MPa、25 MPa、30 MPa、35 MPa、40 MPa條件下進(jìn)行試驗，考查提取壓力對五指毛桃中補骨脂素提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取壓力對提取率的影響

從圖3可以看出，隨著提取壓力的不斷增大，五指毛桃中補骨脂素的提取率呈增加趨勢，當(dāng)提取壓力為30 MPa時，隨著提取壓力的增加，提取率增加效果不明顯，30 MPa提高至40 MPa時，提取率變化幅度約為1%，由于較高的提取壓力對提取設(shè)備的磨損較大，綜合實際因素考量，確定提取壓力為30 MPa。

2.5 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以五指毛桃中補骨脂素的提取率為評價指標(biāo)，選取提取次數(shù)、料液比、提取壓力三個因素進(jìn)行正交試驗，對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平

2.6 五指毛桃提取工藝優(yōu)化

五指毛桃提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果及方差分析見表2、表3。影響五指毛桃補骨脂素提取率的因素主次順序為A(提取次數(shù))>C(提取壓力)>B(料液比)，最佳工藝條件為A3B2C3，即：提取次數(shù)為3次，料液比為1∶20，提取壓力為35Mpa。此試驗條件在正交表中并未出現(xiàn)，通過補充試驗驗證，得到補骨脂素的提取率為82.27%，大于正交試驗結(jié)果中出現(xiàn)的最高值，說明利用正交試驗對五指毛桃提取工藝進(jìn)行優(yōu)化是有效的。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 方差分析

2.7 驗證試驗

在最優(yōu)工藝條件下，即提取次數(shù)為3次，提取料液比為1∶20，提取壓力為35Mpa，進(jìn)行3次驗證試驗，得到補骨脂素的平均提取率為81.38%，說明基于高效高壓差低溫連續(xù)式提取技術(shù)的五指毛桃提取工藝優(yōu)化結(jié)果可靠性良好。

3 討論

本研究以水為溶劑，基于高效高壓差低溫連續(xù)式提取技術(shù)對五指毛桃提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在提取次數(shù)為3次，料液比為1∶20，提取壓力為35 Mpa的條件下，提取率達(dá)82.27%。五指毛桃為華南地區(qū)煲湯保健常見藥食兩用中藥材，具有健脾利濕、益肺止咳、舒筋通絡(luò)的功效。以水為溶劑對五指毛桃進(jìn)行提取，提取物不存在有機溶劑殘留的隱患，在功能性食品中添加具有很大優(yōu)勢，為五指毛桃產(chǎn)品的開發(fā)提供了參考，為基于高效高壓差低溫連續(xù)式提取技術(shù)的五指毛桃提取規(guī)?；a(chǎn)提供了理論指導(dǎo)。