高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定涼茶中20種非法添加化學(xué)藥物

羅 偉，杜俊威，林秋鳳，鄭耀林，鄢 蕓

(東莞市食品藥品檢驗所，廣東 東莞 523000)

涼茶源遠流長，以中草藥熬制的能消除暑氣及內(nèi)熱而得名[1]。隨著涼茶的開發(fā)應(yīng)用，逐漸開發(fā)出了能舒緩感冒咳嗽、消炎鎮(zhèn)痛的品種。在兩廣(廣東、廣西)地區(qū)流傳著“沒什么問題是一杯涼茶不能解決的”說法，可見民眾對涼茶的喜愛。涼茶的配方及術(shù)語中蘊含了嶺南人民的智慧和深厚文化底蘊，早在2006年被納入國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)目錄[2]。

隨著“王老吉”和“加多寶”涼茶品牌的知名度越來越高，涼茶的市場也得到了極大拓展。在兩廣地區(qū)，散裝涼茶鋪隨處可見，并形成了一些知名品牌。但是近年來，部分涼茶商家為了提高品牌的知名度和涼茶的功效，向自制涼茶中非法添加多類化學(xué)藥物的新聞報道不斷，如中山市涼茶抽檢中發(fā)現(xiàn)對乙酰氨基酚含量高達1 679.2 μg/mL。涼茶的非法添加，藥物劑量隨意，多種混合，亦不注意配伍禁忌；銷售時既無專業(yè)藥師指導(dǎo)使用，又無用量限制。消費者在不知情的情況下，大量或長期飲用，可能會出現(xiàn)重復(fù)或過量用藥的情況，易發(fā)生嚴重的藥品不良反應(yīng)，如致過敏樣反應(yīng)，肝、腎損傷等[3-4]。

目前，因涼茶的地域性，市售散裝涼茶中非法添加化學(xué)藥物的檢測仍沒有國家標準。涼茶樣品基質(zhì)復(fù)雜，其中所含的黃酮、多糖、有機酸和生物堿等，易干擾檢測，非法添加分析難度較大[5-6]。采用應(yīng)用于保健品或中成藥檢測的薄層色譜法或高效液相法，靈敏度和準確性不高[7]。檢出陽性樣品，仍需用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)確證[8-9]。

為了調(diào)研東莞市售涼茶的非法添加情況，于東莞各鎮(zhèn)區(qū)共購買了200份不同品牌、不同功效的涼茶，主要有治療風(fēng)寒及風(fēng)熱感冒、清熱祛濕、消炎止痛、止咳平喘等類別。對乙酰氨基酚、酮洛芬、異丙安替比林和萘普生有解熱鎮(zhèn)痛功效，馬來酸氯苯那敏和鹽酸苯海拉明抗組胺藥物，多用于治療過敏性鼻炎，磺胺甲噁唑、甲氧芐啶協(xié)同具有抑菌和殺菌作用，起到抗炎的效果[10]。張科明等[11]已采用LC-MS/MS測定涼茶中止咳平喘或解熱鎮(zhèn)痛類的化學(xué)藥物。本研究針對20種化學(xué)藥物，探索建立一種適用于各種功效的涼茶，便捷準確的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

儀器：LC-20AD高效液相色譜儀(島津公司)，3200 QTRAP質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司)，電子天平(Sartorius公司)，渦旋儀(Vortex公司)，超聲提取儀(Branson公司)。

化合物標準物質(zhì)：馬來酸氯苯那敏(99.7%，批號：100047-200606)、地塞米松(99.6%，100129-201105)、對乙酰氨基酚(100%，批號：100018-200408)、潑尼松(100%，批號：100012-200706)、萘普生(100%，100198-201205)、磺胺甲噁唑(100%，100025-200904)、氨基比林(100%，100503-200301)、非那西丁(100%，100095-198904)、氫化可的松(100，100152-200206)、吡羅昔康(100%，100177-200603)、舒林酸(100%，100335-200001)、酮洛芬(100%，100337-0001)、萘丁美酮(100%，101003-200801)、異丙安替比林(100%，100525-200301)、甲氧芐啶(99.0%，批號：100031-200304)、枸櫞酸噴托維林(100%，100432-200401)、鹽酸苯海拉明(100%，100066-200807)、磷酸苯丙哌林(100%，100237-199701)、醋酸地塞米松(99.6%，100122-200805)均購自中檢所，甲基潑尼松龍(99.4%，G168078)購自德國Dr Ehrenstorfer公司。

試劑：乙腈(批號：SHBK0734)、甲酸(批號：K3123 0964239)和甲醇(批號：I0945607812 )均為德國MERCK公司的色譜純試劑。

樣品：涼茶樣品購自東莞市各區(qū)，同品牌同功效涼茶采集1份樣品，包括癍沙、熱感咳茶、特效口腔茶、清開靈茶、感冒茶、止咳化痰茶等市面常見品牌、品種，及少數(shù)涼茶店自配方自命名的涼茶樣品200份。

1.2 實驗條件

1.2.1 標準溶液的配制 20種化學(xué)藥物的標準物質(zhì)，分別按照說明書要求進行烘干等前處理，準確稱取約10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇-乙腈(1∶1，v/v)溶解后定容，制成濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液，取儲備液各1 mL至同一100 mL容量瓶中，配成10 μg/mL混合標準溶液。置于-18 ℃環(huán)境中。

臨用時，取恢復(fù)至室溫的混合標準溶液，用乙腈-甲醇(1∶1)及色譜的流動相逐級稀釋成500 ng/mL、250 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、30 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL濃度的混合標準工作溶液，用于考察方法的靈敏度，各化學(xué)成分的線性范圍，繪制標準曲線。

1.2.2 樣品處理 樣品制備：市面上購買的涼茶樣品，貯于4 ℃，測定時，準確吸取恢復(fù)至常溫的涼茶樣品10 mL于50 mL容量瓶，加30 mL甲醇-乙腈(1∶1)，超聲30 min后定容。準確吸取上述溶液5mL至10 mL容量瓶中，流動相B定容，搖勻，0.22 μm濾膜濾過后上機。

空白試驗，除不加試樣外，均按供試品的制備步驟進行。

1.2.3 色譜條件 用Waters Atlantic T3柱(2 mm×100 mm，3 μm)進行分析，洗脫條件見表1。柱溫35 ℃，進樣量 10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件 電離子噴霧正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；霧化氣(GS1)50 psi，輔助氣(GS2)50 psi，電離電壓 5.5kV，離子源500 ℃。各化合物的采集參數(shù)見表2。

表2 20種化學(xué)藥物的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)及保留時間

50 ng/mL混合標準工作溶液檢測結(jié)果見圖1。各組分的分離度、信號響應(yīng)均比較高。

圖1 20種化學(xué)藥的總離子流

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理及色譜條件優(yōu)化

2.1.1 預(yù)處理方法選擇 涼茶以中草藥為基礎(chǔ)原料，在熬制過程中溶解出多糖、鞣質(zhì)、色素、氨基酸、生物堿及黃酮等復(fù)雜混合成分[12]。先鹽析脫水，再加入C18粉末，PSA做吸附劑進行分散固相萃取，取上清液進行檢測。因20種化學(xué)藥物品類不同，極性及機構(gòu)差異大，經(jīng)固相萃取部分目標成分含量損失較大。本方法針對的目標成分比較多，使用類極性質(zhì)子溶劑和級性非質(zhì)子溶劑乙腈-甲醇(1∶1，v/v)稀釋樣品。經(jīng)測試多品牌不同品種的涼茶樣品，目標峰處未見干擾，回收率得到了提高，極大精簡了前處理步驟和耗材，檢驗周期短，經(jīng)濟便捷，專屬性強，可根據(jù)出峰時間及離子對比例，定性非法添加物質(zhì)。

各類中成藥、保健品及功能性食品為達到宣稱的療效，其中非法添加外源性化學(xué)藥物的含量，通常添加量較高[13]，如對乙酰氨基酚，一次服用量達到300～600 mg，才能起退燒作用。所添加的外源化學(xué)藥物的起效劑量，經(jīng)以上步驟稀釋后，濃度能落在液相-質(zhì)譜(LC-MS)定量的數(shù)量級范圍內(nèi)。方法的檢出限能滿足涼茶非法添加外源性化學(xué)藥物的檢測需求。

2.1.2 加標回收和精密度實驗 流動相的優(yōu)化：為縮短檢測時間，優(yōu)化峰形，提高分離度，對比了各類常用流動相體系，0.1%甲酸水、0.1%乙酸水、0.02 mol /L乙酸銨溶液，分別組合乙腈、甲醇，上機檢測，發(fā)現(xiàn)使用甲醇有機相的流動相體系會使對乙酰氨基酚色譜峰形前延及變寬，氨基比林峰形鈍；水相含有甲酸、乙酸的流動相中甲氧芐啶洗脫不完全，對乙酰氨基酚峰形無改善，其他組分峰形出峰時間延長。0.02 mol /L乙酸銨溶液(pH=4.2)能有效改善目標成分峰的分叉及拖尾狀況，配合乙腈，分離度及峰形改善。實現(xiàn)了16 min內(nèi)20種目標成分良好分離。

色譜柱的選擇：分別用相同粒徑的Luna C18及Waters Atlantic T3柱進行實驗，考察其對20種目標成分的分離效果。發(fā)現(xiàn)Luna柱的基線噪音大，目標峰峰形寬、響應(yīng)低的狀況。Atlantic waters T3柱的分離度、峰形及響應(yīng)較好。

2.2 方法的線性、靈敏度、回收率和精密度試驗

2.2.1 檢測方法的線性及靈敏度試驗 取按“2.2.1”步驟制備的系列標準溶液，按上述高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜的條件進樣測定。以各組分的上機濃度為橫坐標，表2中定量離子對的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積為縱坐標，用外標法繪制標準曲線。各類組分的響應(yīng)高低不同，檢出限 1～30 mg/mL，定量限5～50 mg/mL。線性依據(jù)其定量限的高低進行確定，結(jié)果20種化學(xué)藥物在各自的線性范圍內(nèi)，峰面積與測得濃度線性良好，相關(guān)系數(shù)在 0.996 2～1.000 0之間。線性范圍、曲線和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 20種化學(xué)藥物的線性范圍、校準曲線、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限

2.2.2 回收率和精密度試驗 陰性涼茶樣品高、中、低水平添加，各濃度制備6份平行的陽性樣品，按步驟處理，考察回收率和精密度，結(jié)果見表 4。樣品中各化學(xué)藥物的加標回收率在88.13%～114.60%之間，相對標準偏差(RSD)在1.18%～9.00%之間。

2.3 涼茶樣品的測定

測定從東莞市各鎮(zhèn)區(qū)涼茶店及市場購買的各品牌不同功效的散裝涼茶共200份的添加情況。所有樣品中均未檢出以上20種化學(xué)藥物。

3 結(jié)論及討論

本項目主要研究涼茶中非法添加各類化學(xué)藥物測定的方法，并對本市市售涼茶的非法添加情況進行摸底。優(yōu)化預(yù)處理方法、色譜、質(zhì)譜條件，完善針對20種可能非法添加于涼茶的具功效的化學(xué)藥物的定性定量檢測方法。預(yù)處理樣品過程中，比較了多種固相萃取的填料和方法，但目標成分損失大、回收率低，無法兼顧各類目標化學(xué)物。已有報道的非法添加含量高，質(zhì)譜的方法檢出限較低，回歸了最直接的溶解稀釋方法，能滿足監(jiān)管的分析需求。

表4 陰性涼茶樣品中20種化學(xué)藥物的加標回收率及相對標準偏差

此分析測定方法的方法學(xué)驗證結(jié)果符合涼茶樣品的分析要求。涼茶樣品只需要經(jīng)簡單的稀釋過濾兩步前處理步驟，即可上機定性定量，簡化了分散固相萃取及固相小柱凈化的繁瑣步驟，節(jié)約了固相萃取的耗材及有機試劑的使用。方法應(yīng)用性廣、分析周期短。研究過程中應(yīng)用此方法實際檢測200份不同種類的涼茶樣品，測定的目標成分種類多、范圍廣，可應(yīng)用于市售散裝涼茶中非法添加的化學(xué)藥物的快速篩查和測定，為市售涼茶的質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

涼茶樣品的購樣測定結(jié)果顯示，本市區(qū)域的品牌涼茶店的涼茶中，非法添加狀況較少。2013年本市出臺了《涼茶店管理暫行辦法》，暫行辦法的有效期至2017年10月31日，暫行辦法中強調(diào)了對全市涼茶店的監(jiān)管，并規(guī)定涼茶需要當天制作和銷售。但是市售涼茶，特別是路邊及流動攤販，在銷售時，可能存在針對消費者描述癥狀，臨時添加化學(xué)藥的情況。

促進涼茶文化的發(fā)揚光大，需要保障涼茶的質(zhì)量安全，可通過以下方式：散裝涼茶應(yīng)要求涼茶銷售商家注明涼茶的原料，并提示涼茶為食品，不能代替藥品，使消費者獲取更多的商品信息；加強消費者的意識，開展群眾監(jiān)督，引導(dǎo)消費者維護自身合法權(quán)益；在涼茶銷售的旺季，如夏季，進行市售涼茶的專項檢查，控制食品衛(wèi)生風(fēng)險；各涼茶生產(chǎn)、銷售單位需建立詳細臺賬和人員管理制度，對涼茶原料進行有效溯源和控制，保留從具備合法經(jīng)營資質(zhì)的單位購買原材料的購買憑證和供應(yīng)方證照，并配備食品安全管理人員；完善市售涼茶備案制度，涼茶生產(chǎn)單位對涼茶種類及配方進行備案，不添加未經(jīng)批準為藥食同源的中草藥及涼茶目錄之外的原料，不生產(chǎn)經(jīng)許可的目錄之外的產(chǎn)品；通過擴大覆蓋面、突擊抽檢等方式進行有效監(jiān)管。