載單寧酸鐵和紫杉醇相變型納米粒用于體外超聲顯像及治療視網膜母細胞瘤

袁 勛，鞠豐翼，張 玙，喬 斌，王志剛，杜之渝

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科，重慶 400010；2.重慶明達眼科醫(yī)院眼科，重慶 400010；3.重慶醫(yī)科大學超聲分子影像重慶市重點實驗室，重慶 400010)

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma, Rb)為兒童最常見原發(fā)性眼內惡性腫瘤[1-2]，目前臨床常用影像學檢查方法有CT、MRI、超聲及光學相干斷層掃描(ophthalmic optical coherence tomography, OCT)等，治療方法包括化學治療(簡稱化療)、放射治療及手術等，各有其不足[3-5]。納米技術用于治療腫瘤高效而安全[6]。單寧酸(tannic acid, TA)為多酚化合物,可通過綠色合成途徑與Fe3+合成具有強黏附能力的光熱材料單寧酸鐵(FeIII-tannic acid, FeⅢTA)[7]。全氟戊烷(perfluoropentane, PFP)沸點低(29℃)且易相變，可促進藥物釋放，同時增強超聲顯像效果[8]。紫杉醇(paclitaxelaclitaxel, PTX)為常用化療藥物，將其與納米技術結合可獲得更高運載效率，提高腫瘤部位藥物濃度，增強治療效果[9-10]。本研究以FeⅢTA、PTX、PFP相結合制備光響應性PLGA納米粒，并體外評估其超聲顯像及治療Rb效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料 羥基端乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，分子量12 000 Da，聚合比50∶50，上海麗昂化學有限公司)，PTX(上海金穗生物科技有限公司)，PFP(Strem Chemicals公司)，TA(Sigma-Aldrich公司)，六水三氯化鐵[Iron(Ⅲ)chloride hexahydrate,FeCl3，賽默飛世爾科技有限公司]，聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA，Sigma公司)以及異丙醇、二氯甲烷、瓊脂糖、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清、細胞增殖及毒性檢測試劑盒CCK-8(上海紀寧實業(yè)有限公司)、活/死細胞雙染試劑盒(熒光探針細胞染色，上海復申生物科技有限公司)。Y79細胞系(人Rb細胞系)、人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)由重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所提供。

1.2 主要儀器 Sonics & Materials聲振儀，磁力攪拌器，低溫離心機，Olympus光學顯微鏡，Zeta SIZER3000HS馬爾文粒度儀，Htachi H-7600透射電子顯微鏡，Agilent Cary 3500紫外可見分光光度計，Shmadzu LC-2-1-A HT高效液相儀(日本島津公司)，808 nm激光儀，熱成像儀，Esaote Mylab 90型彩色超聲診斷儀(探頭頻率5～9 MHz)，ELX800酶標儀，蔡司激光共聚焦顯微鏡LSM800等。

1.3 制備納米粒 以雙乳化法制備PLGA/PTX/PFP納米粒，將50 mg PLGA和5 mg PTX加入2 ml二氯甲烷中并充分溶解。加入200 μl PFP，冰浴下乳化5 min(聲振、停止間隔5 s)，再加入4% PVA溶液5 ml，再次乳化5 min(聲振、停止間隔5 s)。加入2%異丙醇溶液10 ml，加磁珠冰浴攪拌6 h，經超純水離心、洗滌3次，獲得PLGA/PTX/PFP納米粒。取1 mg PLGA/PTX/PFP納米粒均勻重懸于2 ml超純水，依次加入10 μl TA溶液(40 g/L)和10 μl FeCl3溶液(10 g/L)，充分混合均勻，經超純水洗滌、離心3次，完成FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒制備。

1.4 測定相關表征 以光學顯微鏡觀察納米粒大小、分散性及相變特性,馬爾文粒徑分析儀檢測其粒徑、分布及電位。采用紫外分光光度計檢測1.000 g/L PLGA/PTX/PFP及不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000 g/L)FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒的吸光度。以透射電子顯微鏡分析納米粒的結構。配制不同濃度(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μg/ml)PTX，用高效液相色譜儀繪制PTX標準曲線(色譜柱：Welch-C18,4.6 mm×250 mm,流動相：甲醇∶水=77∶23，波長227 nm，流速：1 ml/min)，以有機溶劑(二甲基亞砜∶甲醇=1∶1)破壞納米粒后再次檢測并分析PTX含量，根據PTX標準曲線計算包載的PTX質量,得出PTX的包封率和載藥率。

將FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒隨機等量分成808 nm激光輻照組和未受激光輻照組，分別裝入透析袋，置于緩沖介質中。于0.5、1、2、4、6、12、24 h對2組分別取樣，對激光輻照組在1 h采樣結束后立刻用808 nm激光(1 W/cm2)輻照5 min，再將透析袋放回緩沖溶液中繼續(xù)上述流程。以高效液相色譜儀檢測并繪制2組PTX藥物釋放率。

1.5 測定體外光熱效應 對FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒按不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000 g/L)分組，以1.000 g/L PLGA/PTX/PFP為納米粒組，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)為空白對照組，每組取200 μl分別置于96孔板中，經808 nm激光(1 W/cm2)輻照10 min。以熱成像儀檢測各組溫度變化,光鏡下觀察FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒相變。

1.6 體外超聲顯像 取9 g瓊脂糖粉置于燒杯中，加入350 ml脫氣水，以微波爐加熱并充分攪拌溶解，將200 μl規(guī)格槍頭盒裝滿槍頭，將瓊脂溶液緩慢注滿槍頭盒，待其等待自然冷卻，得到凝膠模型。取上述各濃度FeⅢTA/PTX/PLGA/PFP納米粒懸液和PBS各200 μl置于96孔板中，以PBS為對照組，用808 nm激光(1 W/cm2)輻照5 min后取出，置于瓊脂糖凝膠模型中，以超聲診斷儀分析顯像效果，測量超聲信號灰度值。

1.7 細胞培養(yǎng) 以含1%雙抗、10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育人源性Y79細胞系及HUVEC。

1.8 測定生物安全性 將HUVEC和Y79細胞分別置于96 孔板中孵育12 h，棄去孔中舊培養(yǎng)基，加入含0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 g/L FeⅢTA/PLGA/PFP納米粒的新鮮培養(yǎng)基100 μl，繼續(xù)孵育24 h，然后棄去孔中舊培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，再每孔加入100μl含10% CCK-8新鮮培養(yǎng)基孵育2 h，檢測吸光值A450；每組測量5次并分析。

1.9 CCK-8法檢測Y79細胞存活 將Y79細胞于96孔板中孵育12 h，棄掉舊培養(yǎng)基，分為空白對照組、激光組、FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP(FPTP)組、FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP+激光(FPTP+激光)組，分別加入納米粒后孵育4 h，再次棄掉培養(yǎng)基，加入100 μl無血清培養(yǎng)基；予激光組和FPTP+激光組激光(1 W/cm2)輻照5 min，再次孵育6 h后加入CCK-8試劑并孵育30 min，酶標儀檢測吸光值A450，每組測量5次并分析。檢測不同濃度(0、0.250、0.500、1.000 g/L)FPTP+激光組納米粒的殺傷作用，方法同上。

1.10 活/死細胞法檢測Y79細胞存活 共聚焦皿板中孵育細胞12 h，棄掉培養(yǎng)基，加入1 ml濃度1.000 g/L的不同納米粒無血清培養(yǎng)基，分為空白對照組、激光組、FPTP組、FPTP+激光組，加入不同納米粒后孵育4 h，再次棄掉培養(yǎng)基，加入1 ml新鮮血清培養(yǎng)基，予激光組和FPTP+激光組經激光(1 W/cm2)輻照5 min，再孵育6 h后，各皿中加入200 μl活/死細胞雙染試劑并孵育15 min，觀察各組細胞存活情況。

1.11 流式細胞法檢測Y79細胞存活 將Y79細胞置于48孔板中孵育12 h，棄掉培養(yǎng)基，加入濃度為1.000 g/L的無血清培養(yǎng)基200 μl，分為空白對照組、激光組、FPTP組、FPTP+激光組，分別加入納米粒后孵育4 h，再次棄掉培養(yǎng)基，加入200 μl無血清培養(yǎng)基；予激光組和FPTP+激光組經激光(1 W/cm2)輻照5 min，再次孵育6 h后送檢。

1.12 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以uation.3±s表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，兩變量之間關系采用線性相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 納米粒表征 成功制備出FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒，粒徑(155.8±55.68)nm(圖1A)，分散指數(PdI：0.100)，電位(-27.3±5.14)mV，其大小均勻，分散性好；透射電鏡下觀察，中心的PLGA/PTX/PFP納米粒被FeⅢTA外殼包裹(圖1B)。FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP的吸光度明顯高于PLGA/PTX/PFP，且隨濃度變化(圖1C)。PTX的標準曲線回歸方程為y=19 414x+12 788，r=0.997 2；其包封率為(70.89±8.03)%，載藥率為(9.61±0.63)%，0.5 h和1 h時釋藥率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而激光輻照組PTX釋藥率明顯升高(P<0.05，圖1D)。

圖1 載FeⅢTA/PTX/PFP的PLGA納米粒相關表征 A.納米粒粒徑分布圖； B.透射電鏡圖； C.PTP納米粒和不同濃度FPTP納米粒吸光光度圖； D.FPTP納米粒體外紫杉醇釋放曲線圖

2.2 體外光熱效應及光致相變 激光輻照不同濃度FPTP納米粒, 5 min時溫度上升趨于平穩(wěn),濃度越高溫度上升越快、越高，而PTP納米粒和PBS對照組溫度均未見升高(圖2A)。對于不同濃度FPTP納米粒，5 min時熱成像圖(圖2B)和溫度定量分析結果均呈正相關(r=0.842 8，P<0.05，圖2C)。光鏡下觀察，隨輻照時間增加，發(fā)生相變的FPTP納米粒逐漸增多(圖2D)。

圖2 納米粒光熱圖與光致相變圖 A.PTP納米粒和不同濃度FPTP納米粒經近紅外激光輻照的升溫曲線圖； B.納米粒組激光輻照5 min的熱成像圖； C.不同濃度FPTP納米粒激光輻照5 min時溫度與濃度關系定量分析圖； D.FPTP納米粒經激光輻照后相變圖

2.3 體外超聲顯像 超聲顯像中，激光輻照后，B模式和造影模式均可見明顯信號增強(圖3)；定量分析信號強度變化，隨納米粒濃度增加，B模式信號(r=0.991，P<0.01)及造影模式信號(r=0.992，P<0.01)均明顯增強并呈正相關。

圖3 不同濃度FPTP納米粒體外超聲顯像圖

2.4 生物安全性 不同濃度FPP納米粒對人正常細胞和腫瘤細胞均無細胞毒性(P>0.05)，見圖4A。

2.5 CCK-8法檢測Y79細胞存活情況(表1) 激光組對Y79細胞毒性殺傷作用與空白對照組納米粒比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，而FPTP+激光組強于FPTP組(P<0.01，圖4B)。0.250 g/L、0.500 g/L、1.000 g/L FPTP納米粒對Y79細胞的毒性殺傷作用均高于對照組(P均<0.01)，0.500 g/L、1.000 g/L組高于0.250 g/L組(P均<0.01)，而1.000 g/L組高于0.500 g/L組(P<0.01)，見圖4C。

圖4 納米粒細胞毒性作用 A.FPP納米粒對Y79細胞和HUVEC細胞的毒性； B.不同納米粒組對Y79細胞的殺傷情況； C.不同濃度FPTP+激光納米粒組對Y79細胞的殺傷情況

表1 各組Y79細胞存活情況(%)

2.6 活/死細胞法和流式細胞法檢測Y79細胞存活(表2) 空白對照組和激光組Y79細胞存活率均較高 (P>0.05)；FPTP組、FPTP+激光組Y79細胞存活率均低于空白對照組(P<0.01)；FPTP組Y79細胞存活率高于FPTP+激光組(P<0.01)，見圖5。空白對照組和激光組Y79細胞凋亡均較少 (P>0.05)；FPTP組、FPTP+激光組Y79細胞凋亡率均高于空白對照組(P均<0.01)；FPTP組Y79細胞凋亡率低于FPTP+激光組(P<0.01)，見圖6。

圖6 流式細胞儀檢測不同納米粒組細胞凋亡 A.空白對照組； B.激光組； C.FPTP組； D.FPTP+激光組

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞存活情況 A.空白對照組； B.激光組； C.FPTP組； D.FPTP+激光組 (綠/紅色分別為活/死細胞)

表2 各組Y79細胞存活情況(%)

3 討論

目前治療Rb的優(yōu)先級順序依舊是拯救生命、保留眼球和保存視力[11]。對于較小腫瘤，經瞳孔810 nm聚焦激光溫熱療法是首選治療方法，OCT引導光凝治療對于治療肉眼不可見的新生Rb具有重要臨床價值[12]；但對較大腫瘤需多次由外至內進行光凝治療并結合化療[13]，在提高腫瘤部位藥物濃度、抑制腫瘤生長的同時降低藥物全身毒副作用[14-16]。通過結合納米技術和相變材料，可制備超聲分子探針，實現增強超聲顯像效果[17]。

相變材料的激發(fā)方式有多種選擇[18-19]。本研究將光凝治療、化療與超聲顯像相結合，制備出診療一體FPTP納米粒，可同時增強療效和超聲顯像效果，其粒徑為(155.8±55.68)nm，電位為(-27.3±5.14)mV，有利于通過腫瘤血管進入腫瘤[20]；電鏡可見電子密度較高的FeⅢTA呈黑色，包裹住中間灰白色的PFP；FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP的吸光度主要來自FeⅢTA殼，也表明FeⅢTA成功搭載在納米粒上。PLGA/PTX/PFP納米粒和PBS均無法經激光輻照產熱，提示FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒的光熱效應來源于FeⅢTA。體外超聲顯像顯示，FeⅢTA經激光激發(fā)產熱，促進PFP相變，從而增強超聲顯像效果，兩種模式下回聲均隨納米粒濃度增加而逐漸增強。體外檢測FPTP納米粒在經激光和未經激光輻照下的PTX釋放結果表明PFP經光熱激發(fā)后發(fā)生相變，促進PTX的藥物釋放。體外生物安全性實驗結果顯示，高濃度FPP納米粒在未經激光激發(fā)的情況下不會對正常細胞和腫瘤細胞造成損害，具有較好的生物安全性。體外細胞實驗結果顯示，單一激光輻照不會對細胞造成殺傷效果，同時FPTP納米粒未經激光輻照時雖可緩慢地釋放PTX，但對腫瘤的殺傷效果有限，而FPTP納米粒經激光輻照可迅速提高藥物濃度，達到光熱治療和化療協(xié)同殺傷腫瘤細胞的目的。將光熱治療和化療相結合，腫瘤細胞殺傷效果明顯增強，且隨濃度升高而增強。激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀觀察結果顯示FPTP+激光組對腫瘤細胞殺傷效果最強，為進一步開展體內動物實驗奠定了基礎。