羅中鏈霉菌耐堿菌株一新亞種的多相分類及基因組分析

李 鑫 羅曉霞 張利莉*

（1塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

耐堿鏈霉菌是挖掘生物活性產(chǎn)物的寶貴資源，通常在近pH中性環(huán)境不能生長或生長緩慢，在高pH的環(huán)境下生長較好，高pH環(huán)境可能激活了耐堿微生物的某些基因使其具有獨(dú)特的生理和代謝機(jī)制，能夠產(chǎn)生特殊及多樣化的代謝產(chǎn)物[1-3]。但目前已知微生物資源僅占實(shí)有總數(shù)的1%～10%，極端環(huán)境的微生物資源更是知之甚少，還有很大挖掘空間[4-5]。因此，極端環(huán)境微生物物種鑒定十分重要，物種鑒定是獲得微生物資源、了解物種分布情況以及活性產(chǎn)物挖掘的重要基礎(chǔ)。隨著人類長期濫用抗生素及用藥習(xí)慣不規(guī)范等因素造成耐藥菌株的出現(xiàn)，新型藥物的尋找迫在眉睫。傳統(tǒng)的挖掘方式不能滿足生產(chǎn)生活需要，基于基因?qū)虻拇渭壌x產(chǎn)物挖掘策略成為目前的研究熱點(diǎn)?；?qū)虻拇渭壌x產(chǎn)物挖掘策略就是對微生物進(jìn)行全基因組測序，通過基因組注釋、分析以及相關(guān)蛋白和基因簇的預(yù)測明確菌株的次級代謝潛能，從而有針對性地進(jìn)行挖掘，避免了傳統(tǒng)挖掘方式耗時長、隨機(jī)性大等限制性因素，因此基因組信息能夠?yàn)橥诰虼渭壌x產(chǎn)物快速、準(zhǔn)確獲得新的天然產(chǎn)物提供理論基礎(chǔ)。

TRM49041是我室從羅布泊地區(qū)分離的一株耐堿菌株，為了明確其分類學(xué)地位及代謝潛力，本研究擬從形態(tài)特征、基因型特征、生理生化特征、化學(xué)特征和基因組測序等方面進(jìn)行分析及鑒定，為豐富微生物種質(zhì)資源庫、尋找結(jié)構(gòu)新穎作用機(jī)制獨(dú)特的天然產(chǎn)物奠定良好工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌株：菌株TRM49041分離自新疆羅布泊地區(qū)渠溝沉積物，菌種純化后保存于實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 基因特征鑒定

參照Andreas等人的方法[6]提取TRM49041全基因組 DNA，以 27F（5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）為引物，TRM49041基因組DNA為模板，擴(kuò)增菌株16S rRNA基因,通過克隆測序獲得菌株16S rRNA基因序列，后在EzTaxon server[7]數(shù)據(jù)庫中比對，通過 MEGA6[8]，采用最大簡約法、最大似然法以及鄰近法三種方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。全基因組測序采用Illumina Hiseq平臺測序。

1.2.2 形態(tài)特征鑒定

參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》[9]，將菌株接種于 ISP 系列培養(yǎng)基（ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6和ISP7）[10]以及查氏培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)10～14 d，觀察并記錄菌株生長情況，菌株電鏡拍攝委托廣東微生物所完成。

1.2.3 生理生化特征鑒定

生理生化指標(biāo)檢測方法采用《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》[9]進(jìn)行菌株生長溫度、生長鹽濃度、生長pH、碳源利用、黑色素產(chǎn)生、硫化氫產(chǎn)生、明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原、氧化酶產(chǎn)生、過氧化氫酶產(chǎn)生、尿素酶產(chǎn)生、脂肪酶產(chǎn)生以及纖維素分解等指標(biāo)測定。

1.2.4 化學(xué)特征鑒定

全細(xì)胞水解糖和氨基酸組分鑒定參照Hasegawa等[11]方法，極性脂鑒定參照Minnikin等[12]方法通過二維薄層TLC板顯色鑒定，甲基萘醌鑒定參照Collins等[13]方法進(jìn)行提取，通過HPLC檢測，細(xì)胞脂肪酸由廣東微生物所完成，按照MIDI公司微生物識別系統(tǒng)測定。

1.2.5 全基因組測序、注釋及分析

TRM49041測序由上海派森諾公司完成。測序采用全基因組鳥槍法，構(gòu)建不同插入片段文庫，利用二代測序技術(shù)對文庫進(jìn)行雙末端測序。采用A5-MiSeq和SPAdes對去除接頭序列的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼裝得到contig和scaffold，對所得序列進(jìn)行評估比較以及堿基校對。將所得基因組序列進(jìn)行相關(guān)功能元件預(yù)測以及蛋白編碼基因功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 基因型特征的鑒定

對菌株TRM49041的16SrRNA基因進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)與Streptomyces luozhongensisTRM 49605T最相似，相似性為99.59%，ANI值為99.97%；與菌株Streptomyces roseolilacinusNBRC 12815T的相似性為98.54%，ANI值為86.27%。分別用最大簡約法、最大似然法以及鄰近法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)菌株TRM49041呈獨(dú)立的分支，與羅中鏈霉菌最相近（圖1）。

圖1 菌株TRM49041 16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.1.2 形態(tài)特征鑒定

菌株TRM49041在ISP系列培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基以及PDA培養(yǎng)基上均長勢良好（表1），在ISP1培養(yǎng)基中菌體生長良好、菌落偏小、密集，呈黃色光滑凸起狀；在ISP2培養(yǎng)基中菌體生長良好，菌落呈黃色褶皺狀；在ISP3培養(yǎng)基中菌落呈褶皺凸起狀；在ISP4、ISP5培養(yǎng)基中菌落呈黃、褐色光滑凸起狀；在ISP6培養(yǎng)基中菌體生長較弱、菌落呈白色凹陷狀；在ISP7培養(yǎng)基中菌體生長良好，菌落呈黃、褐色褶皺狀；在NA培養(yǎng)基中菌體生長旺盛、菌落偏小，密集，呈白色光滑凸起狀；在查氏、PDA培養(yǎng)基中菌落呈黃色褶皺凸起狀。菌株在ISP4培養(yǎng)基上生長最旺盛，菌體量最多且菌落形態(tài)規(guī)整呈圓形，基內(nèi)菌絲呈黃色（圖2-a），因此選用ISP4培養(yǎng)基作為摸索TRM49041最適溫度、最適鹽濃度、最適pH及菌株形態(tài)特征鑒定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。通過S-3000N掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌株氣生菌絲呈灰白色，粗壯，無間隔，未見孢子及孢子囊形成（圖2-b），形態(tài)特征鑒定結(jié)果表明TRM49041符合鏈霉菌一般特性。

表1 TRM49041在不同培養(yǎng)基生長情況

圖2 TRM49041菌落形態(tài)及掃描電鏡圖

2.1.3 生理生化特征鑒定

通過最適生長溫度、最適生長NaCl濃度、最適生長pH以及碳源利用情況等方面對TRM49041的生理生化特征進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表2所示。TRM49041最適生長溫度為37℃，最適pH為8.0～10.0，最適NaCl濃度為1%，菌株能夠利用蔗糖、D-甘露醇、可溶性淀粉、D-半乳糖醇、棉子糖、乳糖、麥芽糖和L-鼠李糖作為唯一碳源。牛奶凝固與胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原、氧化酶產(chǎn)生、過氧化氫酶以及脂肪酶產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)均呈現(xiàn)陽性結(jié)果；黑色素產(chǎn)生、硫化氫產(chǎn)生、明膠液化、尿素酶產(chǎn)生及纖維素水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陰性。通過生理生化特征鑒定，發(fā)現(xiàn)菌株與Streptomyces luozhongensisTRM 49605T相似性較大，但也存在差異。

表2 TRM49041及相似菌株生理生化指標(biāo)比較

2.1.4 化學(xué)指標(biāo)鑒定

通過全細(xì)胞水解糖組分、氨基酸組分、磷脂類型等方面對菌株TRM49041進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明TRM49041全細(xì)胞水解糖組分為核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖及半乳糖（圖3-a）；全細(xì)胞氨基酸組分為L,L-DAP（圖3-b）；細(xì)胞膜磷酸脂類主要有DPG（磷脂酸甘油）、PE（磷脂酰甲醇胺）、PG（磷脂酰甘油）、PIM（磷脂酰甲基肌醇）以及一個未知類型的L極性脂（圖 3-c）；其主要脂肪酸類型為 C16:0ω8c（12.20%）、cyclo-C19:0（12.08%）、iso-C16:0（10.34%）、C18:1ω9c（7.39%）和cyclo-C17:0（7.33%）；甲基萘醌類型為 MK-10（H6）和 MK-10（H8）。通過對菌株細(xì)胞壁化學(xué)組分特征的鑒定，發(fā)現(xiàn)TRM49041與相似菌株Streptomyces luozhongensisTRM 49605T和Streptomyces roseolilacinusNBRC 12815T存在差異（表3），具有典型新菌種的特性。

圖3 TRM49041化學(xué)指標(biāo)圖

表3 TRM49041及相似菌株化學(xué)指標(biāo)比較

通過菌株16S rRNA基因以及基因組ANI值比對，結(jié)果顯示TRM49041與羅中鏈霉菌為同一個種，在形態(tài)特征、基因型特征、生理生化特征及化學(xué)特征具有相似之處，同時也存在明顯差異。因此將TRM49041確定為羅中鏈霉菌的一個亞種，根據(jù)其耐堿特性，命名為羅中鏈霉菌耐堿亞種（Streptomycesluozhongensissubsp.alkalitolerant）。

2.2 TRM49041基因組分析

2.2.1 TRM49041基因組組裝與注釋

TRM49041全基因組測序基于Illumina Hiseq測序平臺，通過構(gòu)建不同插入片段的文庫，進(jìn)行雙末端測序，插入片段大小為400 bp，測序模式為paired-end 2*150 bp，采用A5-MiSeq和SPAdes進(jìn)行從頭拼接基因組。

原始數(shù)據(jù)結(jié)果表明，菌株TRM49041共有70 889 032個raw reads，通過序列拼接獲得68個骨架，基因組全長7 019 135 bp，GC含量為73.99%，共編碼6 212個基因。通過COG數(shù)據(jù)庫分析（E-value＜1E-10），獲得COG功能注釋的基因有5 193個，主要為功能預(yù)測、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物代謝、能量轉(zhuǎn)化以及次級代謝產(chǎn)物合成等，非編碼RNA中含有1個5S rRNA、1個16S rRNA、1個23S rRNA以及 66個tRNA。

2.2.2 TRM49041 KEGG代謝通路分類

KEGG分類，是對糖代謝、脂代謝以及次級代謝物生物合成途徑等多種代謝途徑進(jìn)行歸類，是了解物種生命活動特征、代謝活動潛能的重要工具。通過KEGG代謝通路分類，菌株TRM49041共有4 348個基因被注釋，其中關(guān)于糖代謝基因450個，占基因總數(shù)10.35%，氨基酸代謝基因361個，占基因總數(shù)8.30%，以及跨膜運(yùn)輸基因138個，占基因總數(shù)3.17%（圖4），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)注釋基因中含有15個鏈霉素產(chǎn)生代謝通路相關(guān)基因，因此推測此菌株是一株能夠產(chǎn)生鏈霉素或鏈霉素類似物的菌株。

圖4 TRM49041 KEGG功能歸類

2.2.3 TRM49041次級代謝潛能預(yù)測

通過GeneMarks及NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白編碼基因，TRM49041共有6 212個ORF，在NCBI NR數(shù)據(jù)庫中檢索到相關(guān)蛋白編碼基因數(shù)量為5 967個。通過antiSMASH預(yù)測該菌株次級代謝潛能，共獲得27個潛在天然產(chǎn)物生物合成基因簇（表4）。

表4 TRM49041antiSMASH預(yù)測次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇

antiSMASH分析結(jié)果表明：鏈霉菌TRM49041具有豐富的天然產(chǎn)物生物合成基因簇，菌株含有NRP和Polyketide類基因簇，如cluster1，與鏈霉素生物合成基因簇相似性為85%；cluster2為核苷類化合物，與衣霉素生物合成基因簇相似性為64%；cluster5和cluster21為非核糖體肽類化合物，cluster5與salinichelins生物合成基因簇相似性為69%，cluster21與化合物JBIR-126生物合成基因簇相似性為92%；cluster3和cluster11為萜類化合物，cluster3與Ikarugamycin生物合成基因簇相似性為100%，cluster11與hopene生物合成基因簇相似性為76%；cluster18、cluster24為聚酮類化合物，cluster18與星孢菌素生物合成基因簇相似性為66%，cluster24與尼日利亞菌素生物合成基因簇相似性為55%。通過進(jìn)一步比對分析發(fā)現(xiàn)cluster1具有鏈霉素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因；cluster2含有衣霉素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因；cluster3具有Ikarugamycin生物合成相關(guān)基因；cluster18具有星孢菌素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因；cluster21含有JBIR-126合成相關(guān)基因；cluster24含有尼日利亞菌素核心生物合成基因，因此推測TRM49041是一株能夠產(chǎn)生鏈霉素、衣霉素、星孢菌素、Ikarugamycin、JBIR-126和尼日利亞菌素的潛力菌株，極具挖掘潛力。

3 討論

本研究通過形態(tài)特征、基因型特征、生理生化特征及化學(xué)特征鑒定TRM49041具有羅中鏈霉菌的特征[14]，同時也存在明顯差異，根據(jù)鑒定結(jié)果以及TRM49041獨(dú)特的耐堿特性確定其為羅中鏈霉菌耐堿亞種（Streptomyces luozhongensissubsp.alkalitolerant）。通過基因組分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TRM49041具有更豐富的潛在次級代謝生物合成基因簇。因此，基于16S rRNA基因序列比對相同種相似性非100%的菌株，也具有挖掘潛力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)表明，基于16S rRNA序列物種鑒定方式的辨識度并不是很高，尤其是相近種的鑒定，作為物種鑒定及生態(tài)學(xué)研究的黃金標(biāo)準(zhǔn)不具備更細(xì)致的分辨能力，有研究發(fā)現(xiàn)，在2 013個細(xì)菌和古菌完整基因中，物種的16S rRNA基因存在異質(zhì)性，尤其是極端環(huán)境來源的微生物，差異分歧更加明顯[15]。用眾多保守基因中的一個基因來反映菌株親緣關(guān)系，存在種內(nèi)變異性和基因組內(nèi)操縱子間的異源性，可能會出現(xiàn)一定的偏差[16]，因此僅通過16S rRNA基因不足以很好的區(qū)分相似種或種內(nèi)親緣關(guān)系，多個看家基因聯(lián)用或?qū)ふ曳直媛矢叩蔫b定標(biāo)準(zhǔn)可能會一定程度減少偏差，能夠更細(xì)致劃分種群分類關(guān)系，使得更多物種資源得到充分利用[17]。

TRM49041是一株耐堿鏈霉菌，高pH的環(huán)境可能會激活耐堿微生物的某些沉默基因，誘導(dǎo)出獨(dú)特的代謝途徑。通過基因簇預(yù)測TRM49041具有多種生物活性的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，如：抗結(jié)核桿菌的鏈霉素；抗真菌、抗病毒的衣霉素；抗真菌、抗高血壓的星孢菌素等，初步推測該菌株具有較強(qiáng)的代謝能力，具有非常重要的挖掘價值。通過測序分析，解析菌株次級代謝途徑已成為天然產(chǎn)物挖掘的主流趨勢，本研究通過COG分析、GO注釋以及KEGG代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，TRM49041基因組中含有鏈霉素等多個次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因。鏈霉素作為重要的臨床用藥，備受關(guān)注，通過代謝組分分析，從D-葡萄糖出發(fā)合成6-磷酸葡萄糖，在脒基轉(zhuǎn)移酶等多種酶作用下合成鏈霉素。6-磷酸葡萄糖也作為新霉素、卡那霉素等合成的前體物質(zhì)，因此通過選擇葡萄糖作為碳源，能夠提高抗生素的產(chǎn)量，此外通過對脒基轉(zhuǎn)移酶等關(guān)鍵酶基因進(jìn)行克隆加倍，或增加強(qiáng)啟動子等基因修飾也可大大提高抗生素的產(chǎn)量，為后期抗生素挖掘提供思路。

本研究相關(guān)結(jié)果為鏈霉菌的鑒定、分類提供參考數(shù)據(jù)，通過基因組預(yù)測及代謝組分分析可為抗生素的挖掘提供指導(dǎo)思路。