自酸蝕樹脂粘接劑合成納米銀對(duì)唾液生物膜抗菌性的初步研究

楊玉瓊，孟翔峰

0 引 言

牙本質(zhì)樹脂粘接界面在口腔環(huán)境的長(zhǎng)期作用下，容易出現(xiàn)老化及微滲漏[1]，同時(shí)樹脂材料粗糙的表面也易聚集菌斑生物膜，從而導(dǎo)致繼發(fā)齲的發(fā)生[2-3]。因此對(duì)樹脂粘接劑進(jìn)行抗菌改性是提高修復(fù)體壽命的一個(gè)可行方法。納米銀的抗菌效果被大量文獻(xiàn)所證實(shí)[4-5]。而納米銀原位合成法能夠解決納米銀在樹脂材料中的分散問題，該方法利用單體聚合反應(yīng)產(chǎn)生的自由基來還原銀離子生成納米銀[6-8]。我們的前期研究將納米銀原位合成法引入到樹脂粘接劑中，發(fā)現(xiàn)合成的納米銀能夠?qū)?biāo)準(zhǔn)變異鏈球菌株產(chǎn)生良好的抗菌效果[9]。而納米銀原位合成法面對(duì)具有更高酸性的一步法自酸蝕樹脂粘接劑以及菌落結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的唾液生物膜，其方法的可靠性及有效性需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料2-乙基己酸銀(LotA1918077, 百靈威公司，美國(guó))；甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯(Tertbutylaminoethyl methacrylate，TBAEMA) (LotBCBF8391V, 西格瑪奧德里奇公司，美國(guó))；Clearfil SE Bond(可樂麗公司，日本)；Clearfil SE One(可樂麗公司，日本)；活/死細(xì)菌染色試劑盒(賽默飛公司，美國(guó))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備電子分析天平(FA2004，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))；超聲清洗器(KQ-250DE，昆山舒美有限公司，中國(guó))；光固化燈(Bluephase C8，義獲嘉偉瓦登特公司，列支敦士登)；透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)(Tecnai G2 Spirit BIOTWIN，F(xiàn)EI 公司，美國(guó))；超凈臺(tái)(SW-CJ-1D 型，蘇州凈化有限公司，中國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(NikonA1，尼康公司，日本)；生化培養(yǎng)箱(SPX-80型，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó))。

1.2 粘接劑試件的制備及分組稱取0.08 g 2-乙基己酸銀鹽，將其添加到0.92 g TBAEMA中，充分震蕩混勻后形成8%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的銀源溶液[10]，再將其以0%、0.1%、0.2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加到兩步法自酸蝕樹脂粘接劑Clearfil SE Bond(CSB)的第2步粘接劑(bond)部分及一步法自酸蝕樹脂粘接劑Clearfil SE One(CSO)中。使用慢速切割機(jī)切取內(nèi)徑6 mm、厚1 mm的有機(jī)玻璃模具。將有機(jī)玻璃模具置于透明聚酯薄膜上，而后滴入樹脂粘接劑使其充滿模具，覆蓋透明聚酯薄膜后用蓋玻片將氣泡擠出并壓實(shí)，用1000 mW/cm2光固化燈正反面各光照20 s，待試件完全固化后輕輕取出。用打孔器制作內(nèi)徑6 mm、厚1 mm的透明聚酯薄膜作為空白對(duì)照組。每組制作12個(gè)試件，于無菌水中浸泡1周后取出，超聲清潔15 min后置于37 ℃干燥箱烘干，環(huán)氧乙烷消毒后備用。

所有實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組：透明聚酯薄膜；對(duì)照組(0%Ag CSB，0%Ag CSO)；含銀實(shí)驗(yàn)組(0.1%Ag CSB，0.1%Ag CSO，0.2%Ag CSB，0.2%Ag CSO)。采用透射電子顯微鏡對(duì)含銀實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行形貌觀察及粒徑分析，采用菌落計(jì)數(shù)及活/死菌染色來評(píng)價(jià)所有組別的抗菌效能。

1.3 納米銀形貌及粒徑分布情況測(cè)定從6組樹脂粘接劑中每組任意選取3個(gè)試件，用超薄切割機(jī)將樹脂包埋后的試件切成70 nm厚度的薄片，將薄片置于銅網(wǎng)上，并在透射電子顯微鏡下觀察納米銀的形貌及其在樹脂粘接劑中的分散情況。從每組樹脂粘接劑的鏡下觀察圖像中隨機(jī)截取10張TEM圖像，使用Nano measurer 1.2圖像處理軟件測(cè)量圖中固定面積下的任意100個(gè)納米銀顆粒粒徑，并采用Origin 9.0數(shù)據(jù)分析軟件(Origin Lab公司，美國(guó))進(jìn)行納米銀粒徑分析。

1.4 含納米銀樹脂粘接劑對(duì)唾液生物膜的抗菌性檢測(cè)

1.4.1 人唾液標(biāo)本的采集本實(shí)驗(yàn)共納入20名健康成年志愿者，納入標(biāo)準(zhǔn)為：18～25歲健康成年人，無糖尿病、傳染病等系統(tǒng)性病史，近3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素，口腔檢查明確無齲病及牙周病病史，無錯(cuò)頜畸形。排除標(biāo)準(zhǔn)為：有過口腔疾病治療史或系統(tǒng)性疾病治療史或?qū)Ρ緦?shí)驗(yàn)干預(yù)措施不愿合作者。

采集唾液前要求志愿者從前1天早晨8:00開始不刷牙不漱口，至第2天早晨8:00于實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一采集唾液，采集唾液前2 h內(nèi)禁止飲食。每人分別領(lǐng)取1支15 mL無菌離心管，在無菌環(huán)境下采集1 mL唾液后迅速蓋上管蓋，防止外源性細(xì)菌污染。共收集得到20 mL唾液。將收集得到的所有志愿者的唾液在無菌操作臺(tái)中倒入50 mL無菌管中，用無菌玻璃棒混合均勻，經(jīng)消過毒的濾網(wǎng)過濾后與甘油按照體積比7∶3混合，混合后分裝于2 mL無菌離心管中，存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中備用。

1.4.2 唾液生物膜的培養(yǎng)唾液生物膜接種原液由1 mL人唾液標(biāo)本與50 mL McBain培養(yǎng)液[5]混勻配制而成，按1.5 mL/孔加入到24孔板中。每組隨機(jī)選取9個(gè)試件，由無菌鑷子夾取，放入孔板中，每孔放入1個(gè)試件。將24孔板密封后于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，保持菌斑生物膜面向上將試件逐個(gè)取出，移至新的24孔板中，每孔加入1.5 mL新鮮McBain培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，與前一步驟相同，將試件移至新的24孔板中，每孔加入1.5 mL新鮮McBain培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最終取出表面附有菌斑生物膜的試件進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)及活/死菌染色實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 菌斑生物膜菌落計(jì)數(shù)每組取6個(gè)試件分別放入24孔板中，用1 mL PBS輕輕沖洗以去除試件表面松散的細(xì)菌，將試件轉(zhuǎn)移至盛有1 mL PBS的無菌離心管中，超聲振蕩5 min，收集牙菌斑生物膜，并將其震動(dòng)混勻，梯度稀釋后涂布于胰蛋白大豆血瓊脂固體培養(yǎng)基(TSB)上，37 ℃下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)(CFU)，將菌落計(jì)數(shù)結(jié)果換算為抗菌率。抗菌率計(jì)算公式為：

抗菌率=(N0-N)/N0×100%

N0：空白對(duì)照組平均CFU值；N：各組不同銀源濃度粘接劑的平均CFU值。

1.4.4 菌斑生物膜細(xì)菌染色每組取3個(gè)試件分別放入24孔板中，1 mL PBS輕輕沖洗試件表面后將試件移至新的24孔板，用1 mL活/死菌試劑于暗室中著色15 min后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，細(xì)胞膜完整的活菌染色后呈綠色熒光；細(xì)胞膜受損的死菌染色后呈紅色熒光；活/死菌接近或重疊的部分會(huì)顯示出橙/黃色熒光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析選用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)同一種樹脂粘接劑(CSB/CSO)的不同含銀濃度(0%Ag、0.1%Ag、0.2%Ag)組表面抗菌率進(jìn)行單因素方差分析，并選用Student-Newman-Keuls(SNK)法進(jìn)行兩兩比較；對(duì)相同含銀濃度(0%Ag/0.1%Ag/0.2%Ag)下不同樹脂粘接劑(CSB、CSO)組表面抗菌率采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 納米銀形貌觀察及粒徑分析6組樹脂粘接劑試件的透射電鏡圖顯示，對(duì)照組可見微米級(jí)填料呈團(tuán)簇狀分散于樹脂基質(zhì)中，而實(shí)驗(yàn)組中除了團(tuán)簇狀的微米級(jí)填料外，還均勻分散著納米級(jí)的黑色納米銀顆粒，且隨著銀源濃度的增高，納米銀顆粒的分布更為密集。見圖1。實(shí)驗(yàn)組中納米銀顆粒生成的粒徑分布圖見圖2，經(jīng)過軟件分析計(jì)算，0.1%Ag CSB組、0.2%Ag CSB組、0.1%Ag CSO組、0.2%Ag CSO組的納米銀平均粒徑分別為(10.82±3.66)nm、(8.84±3.21)nm、(21.38±5.39)nm、(17.77±4.72)nm。

圖2 實(shí)驗(yàn)組生成的納米銀顆粒粒徑分布圖

a-c分別為: 0%、0.1%、0.2%Ag CSB組；d-f分別為: 0%、0.1%、0.2%Ag CSO組圖中箭頭所指為納米銀顆粒

2.2 唾液生物膜全菌落計(jì)數(shù)結(jié)果0%Ag CSO組的抗菌率顯著高于0%Ag CSB組(P<0.05)，但顯著低于CSB和CSO的0.1%Ag和0.2%Ag組的抗菌率(P<0.05)；CSB和CSO的0.2%Ag組的抗菌率顯著高于它們各自的0.1%Ag組(P<0.05)；在0.1%Ag或0.2%Ag濃度下，CSB和CSO組間的抗菌率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組唾液生物膜的全菌落計(jì)數(shù)及抗菌率結(jié)果比較

2.3 唾液生物膜染色結(jié)果試件表面唾液生物膜染色結(jié)果顯示，0%Ag CSB組試件表面呈大面積綠色熒光，說明試件表面覆蓋大量活菌；0%Ag CSO組試件表面綠色熒光中有部分散在紅色點(diǎn)狀熒光，說明有部分活菌覆蓋的同時(shí)也有部分死菌覆蓋； CSB和CSO的0.1%Ag 和0.2%Ag組試件表面呈現(xiàn)紅、橙或黃色熒光，說明試件表面覆蓋大量死菌。見圖3。

a-c分別為: 0%、0.1%、0.2%Ag CSB組；d-f分別為: 0%、0.1%、0.2%Ag CSO組

3 討 論

在樹脂粘接修復(fù)體的長(zhǎng)期使用過程中，口腔內(nèi)的菌斑生物膜極易侵入牙體組織與樹脂間的粘接界面，當(dāng)口腔微生態(tài)環(huán)境處于不平衡狀態(tài)時(shí)，附著在粘接界面的致齲菌會(huì)利用食物代謝產(chǎn)酸，從而促使牙本質(zhì)基底部脫礦，產(chǎn)生繼發(fā)齲[11]，最終導(dǎo)致修復(fù)失敗。因此，賦予樹脂粘接劑一定的抗菌性是十分必要的。

盡管納米銀的抗菌作用機(jī)制尚不明確，但研究已經(jīng)證實(shí)納米銀可通過釋放銀離子或自身溶出來發(fā)揮抗菌效果，并且納米銀具有廣譜抗菌性及良好的生物相容性[12]。但使納米銀在聚合物中得到均勻分散是其材料設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。而原位合成法利用樹脂的聚合反應(yīng)來生成納米銀，使其得到均勻分散，已經(jīng)被很多研究所證實(shí)[6]。Cheng等[13]將0.08 g 2-乙基己酸銀鹽溶解于0.92 g仲胺中制成8%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的銀鹽溶液，然后將8%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的銀鹽溶液按一定比例添加到含無定型磷酸鈣的復(fù)合樹脂中，聚合后的樹脂中原位合成了納米銀，粒徑為(2.7±0.6)nm，并使材料具有了一定的抗菌性。

而在本研究中，納米銀原位合成法進(jìn)一步應(yīng)用到酸性更強(qiáng)的一步法自酸蝕樹脂粘接劑中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示即使在較高酸性條件下，該方法也能夠原位生成分散均勻的納米銀顆粒。值得注意的是，含銀CSB組所生成納米銀的平均粒徑比含銀CSO組納米銀平均粒徑小，推測(cè)這是由于兩步法自酸蝕樹脂粘接劑CSB的bond部分pH值較高，接近生理pH值，而一步法自酸蝕樹脂粘接劑CSO的pH值較低(pH=2.3)，研究表明納米銀顆粒的粒徑大小會(huì)受到反應(yīng)液的pH值的影響，pH值越小，所生成納米銀顆粒粒徑越大[14]。

樹脂粘接劑經(jīng)光照固化后，未聚合的殘余單體會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性[15]。粘接劑中的未聚合單體在24 h內(nèi)可洗脫90%以上，1周后可降至無法檢測(cè)的水平[16]，因此本實(shí)驗(yàn)將試件在無菌水中浸泡1周，以排除粘接劑中殘余未聚合單體的不利影響。本實(shí)驗(yàn)采用體外唾液生物膜模型檢測(cè)含納米銀試件的抗菌性能。生物膜模型一般可分為3種，分別為特定混合菌種、單一菌種以及全菌種模型[17]。本實(shí)驗(yàn)采用全菌種模型，通過收集不同志愿者的唾液以模擬口腔內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性和異質(zhì)性。在前期研究中，0.1%Ag組試件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)變異鏈球菌株的抗菌率超過95%[9]；而本研究中0.1%Ag組試件的抗菌率卻只有60%左右，這提示本研究采用的唾液生物膜因?yàn)槭怯筛黝惣?xì)胞、基質(zhì)、空隙及管道系統(tǒng)組成，具有復(fù)雜三維立體結(jié)構(gòu)的生態(tài)系統(tǒng)[18]，其高度的結(jié)構(gòu)特異性會(huì)阻礙Ag+發(fā)揮抗菌效能，從而使抗菌效率降低。但是針對(duì)唾液生物膜復(fù)雜的生態(tài)結(jié)構(gòu)，本研究顯示銀源濃度提高到0.2%時(shí)，能夠顯著改善CSB和CSO的抗菌效果。

作為系列研究，本研究將原位合成法應(yīng)用到酸性更高的一步法自酸蝕粘接劑中，仍然合成了均勻分散的納米銀顆粒，盡管其生成粒徑受到其酸性影響，但其仍對(duì)唾液生物膜有一定的抗菌性能。本實(shí)驗(yàn)僅研究了含納米銀自酸蝕樹脂粘接劑的短期抗菌性能，其生物相容性/機(jī)械性能以及對(duì)唾液生物膜的長(zhǎng)期抗菌性能尚待進(jìn)一步研究。