小鼠感染Chinese1型弓形蟲慢性期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和包囊分布研究

郭子璇，蘇瑞景，肖傳斌，仝宗喜，楊玉榮

(河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002)

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種細胞內(nèi)寄生原蟲，可以侵染幾乎所有溫血動物的有核細胞，誘發(fā)弓形蟲病，免疫功能受抑制的動物和患者表現(xiàn)為急性弓形蟲病，健康動物和人感染弓形蟲常表現(xiàn)為無明顯癥狀的慢性感染。進入弓形蟲慢性感染階段，弓形蟲形成包囊，可寄生于多個器官，但分布于橫紋肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的包囊最多[1]。研究發(fā)現(xiàn)，我國人和肉用動物弓形蟲的感染率約為8.2%和23.7%，其主要流行的蟲株為Chinese1型弓形蟲[2]，但同為基因型Chinese1型弓形蟲的不同分離株，其致病性還存在很大差異[3-4]。目前，Chinese1型弓形蟲慢性感染對大腦的致病性方面研究，還不豐富。張義華等[5]發(fā)現(xiàn)，Chinese1(TgCtwh6)慢性弓形蟲感染小鼠腦部的損傷與小膠質(zhì)細胞活化有關(guān)。本試驗研究虎源Chinese1(TgTigerCHn1)弓形蟲對BALB/c小鼠大腦的致病性和包囊分布，旨在為慢性弓形蟲病致人和動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面研究提供參考數(shù)據(jù)，增進對我國人和動物慢性弓形蟲病危害的認識和了解。

1 材料與方法

1.1 弓形蟲蟲株與抗體TgTigerCHn1(Chinese1)弓形蟲蟲株分離于河南省動物園老虎[6]。兔抗弓形蟲多克隆抗體和弓形蟲抗原由美國農(nóng)業(yè)部Dubey試驗室饋贈，小鼠/兔HRP/DAB(ABC)IHC檢測試劑盒購自Abcam公司(貨號：ab64264)。

1.2 試驗分組健康BALB/c小鼠10只，弓形蟲檢測陰性，購于鄭州大學實驗動物中心(實驗動物處理遵守動物倫理與福利相關(guān)規(guī)定)。小鼠隨機分為2組，每組5只，試驗組小鼠腹腔注射無菌生理鹽水稀釋的弓形蟲速殖子1個/只(速殖子濃度采用<100，101，102，103，104，105梯度稀釋后，經(jīng)小鼠生物學測定確定[6])，每只小鼠接種量為1 mL，對照組小鼠腹腔注射無菌生理鹽水1 mL/只。自由采食飼料和飲水，每日觀察小鼠臨床情況并記錄。接種后60 d(60DPI)，采集小鼠血清，乙醚麻醉后處死，10%的中性福爾馬林溶液固定小鼠中樞神經(jīng)組織。

1.3 弓形蟲檢測方法采用改良凝集實驗(Modified Agglutination Test，MAT)方法檢測小鼠血清中弓形蟲IgG[7]，確定小鼠是否感染弓形蟲。組織壓片方法檢查大腦皮質(zhì)中是否含有弓形蟲包囊，光學顯微鏡觀察。

1.4 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)連續(xù)切片制作及染色運用常規(guī)病理學技術(shù)制作腦組織連續(xù)石蠟切片，切片厚度7 μm。全腦的矢狀面，1/2大腦全部制做連續(xù)切片，約110張/只小鼠。中樞神經(jīng)系統(tǒng)全長(1.43±0.20)cm，采用石蠟切片技術(shù)制片后，觀察到的中樞神經(jīng)系統(tǒng)體積略小于真實體積。顯微鏡下觀察可見，含大腦的切片110張，厚度(0.43±0.05)cm；含腦干的切片90張，腦干厚度(0.42±0.02)cm；含小腦的切片73張，厚度(0.39±0.14)cm。

采用蘇木素與伊紅對比染色法 (Hematoxylin-Eosin staining，H&E)觀察大腦皮質(zhì)、基底核、間腦、中腦、后腦、小腦蚓部和半球部位的病理損傷，統(tǒng)計全部腦組織內(nèi)的弓形蟲的包囊數(shù)量、血管周圍炎癥反應(yīng)數(shù)量和包囊周圍炎癥程度。正常腦組織評為0分，包囊周圍單核細胞浸潤數(shù)量為10個到30個評為1分；30個到50個評為2分；50個以上評為3分[8-9]。采用免疫組織化學染色方法(immunohistochemical staining，IHC)觀察弓形蟲抗原分布。

1.5 數(shù)據(jù)處理采用軟件GraphPad prims 5.0(Graphpad Software Inc.，San Diego，CA，USA)對得到的數(shù)據(jù)進行分析，并制圖。

2 結(jié)果

2.1 BALB/c小鼠弓形蟲的感染情況試驗組、對照組小鼠存活期均達60 d，未見明顯臨床異常表現(xiàn)。60 d后，試驗組小鼠(n=5)腹腔注射TgTigerCHn1弓形蟲速殖子后，其MAT滴度均1∶200，且大腦皮質(zhì)壓片均可觀察到弓形蟲包囊，顯示100%小鼠成功感染弓形蟲。對照組小鼠，其MAT滴度均<1∶25，且大腦皮質(zhì)壓片未檢查到弓形蟲包囊，顯示未感染弓形蟲(表1)。

表1 BALB/c小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲的發(fā)病情況(感染后60 d，1個速殖子/只，腹腔注射)

2.2 慢性弓形蟲病小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理組織學變化小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲速殖子60DPI，眼觀，其大腦輕微腫大，蛛網(wǎng)膜充血。顯微鏡下，小鼠腦組織呈非化膿性腦炎特征。弓形蟲生長于神經(jīng)元內(nèi)，并形成包囊，其周圍可見嗜神經(jīng)元現(xiàn)象和神經(jīng)細胞壞死，小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和單核細胞增生形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)(圖1 A)；弓形蟲包囊周圍的血管周圍浸潤單核細胞、淋巴細胞，形成袖套現(xiàn)象(圖1 B)；有的多個弓形蟲包囊呈衛(wèi)星樣分布(海馬較明顯)，周圍可見明顯的神經(jīng)細胞壞死和炎癥反應(yīng)(圖1 C)；此外，蛛網(wǎng)膜下腔可見多量單核細胞、淋巴細胞浸潤，炎癥附近可見弓形蟲包囊(圖1 D)；多數(shù)弓形蟲包囊分布于神經(jīng)元，也可見生長于小腦浦肯野細胞中的包囊(圖1 E)；免疫組織化學方法驗證這些包囊呈弓形蟲抗原陽性(圖1 F)。

2.3 慢性弓形蟲病小鼠中樞神經(jīng)組織弓形蟲包囊的分布弓形蟲包囊在慢性弓形蟲病小鼠中樞神經(jīng)組織切片中呈近圓形，且不均勻分布(圖1;圖2A，B)。小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲，從顱側(cè)到尾側(cè)的大腦皮質(zhì)、基底核、腦干、中腦、后腦、小腦蚓部和半球部位，其弓形蟲包囊數(shù)量、血管周圍炎癥反應(yīng)數(shù)量和包囊周圍炎癥程度均有顯著性差異。弓形蟲包囊數(shù)量從高到低依次為，大腦皮質(zhì)>中腦>基底核>間腦>后腦>小腦蚓部>小腦半球。其中，大腦皮質(zhì)的弓形蟲包囊數(shù)量最多，為(16.06±1.01)個/cm2腦組織(圖2 B)，包囊周圍的炎癥程度也最重，弓形蟲包囊數(shù)量與炎癥程度呈正相關(guān)(圖2 A，C)。基底核的血管周圍炎反應(yīng)最為劇烈(圖2 D)。小腦蚓部和半球的弓形蟲包囊數(shù)量最少，為(1.44±0.15)個/cm2小腦蚓部，包囊周圍的炎癥反應(yīng)程度也較輕(圖2 B，C)。腦干中，中腦的弓形蟲包囊數(shù)量最多，為(12.51±1.05)個/cm2腦組織(圖2 B)。其大腦包囊總數(shù)量可達約10 700個。

圖1 BALB/c小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲慢性期中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理變化 A.大腦中神經(jīng)元內(nèi)弓形蟲包囊(箭頭)和周圍的膠質(zhì)結(jié)節(jié)現(xiàn)象(三角形)，H&E染色；B.血管袖套(三角形)和附近的弓形蟲包囊(箭頭)，H&E染色；C.海馬多個弓形蟲包囊(箭頭)，H&E染色；D.大腦中蛛網(wǎng)膜下腔炎性細胞浸潤(三角形)和附近的弓形蟲包囊(箭頭)，H&E染色；E.小腦浦肯野細胞中的包囊(箭頭)，H&E染色;F.大腦弓形蟲包囊(箭頭)和神經(jīng)元細胞核(三角形)，IHC染色

圖2 BALB/c小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲后中樞神經(jīng)系統(tǒng)弓形蟲包囊分布、數(shù)量和損傷 A.弓形蟲包囊總數(shù)量；B.弓形蟲包囊平均數(shù)量；C.弓形蟲包囊周圍炎癥評分；D.發(fā)生血管周圍炎癥的平均數(shù)量

3 討論

弓形蟲急性感染期的速殖子，受到宿主免疫反應(yīng)抑制后轉(zhuǎn)化為緩殖子，并形成包囊，轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥酒?；而慢性感染期的緩殖子，在宿主免疫功能低下時又可以活化成為速殖子，重新轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙愿腥?，造成嚴重的臨床癥狀和后果。關(guān)于急性和慢性感染階段沒有嚴格的界定，一般，弓形蟲急性感染期可在感染后持續(xù)3周，超過3周，動物未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，則進入慢性感染期。本研究結(jié)果顯示，虎源Chinese1型弓形蟲(TgTigerCHn1株，1個)感染小鼠60 d后，全部存活，且無明顯臨床癥狀，病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)多量的弓形蟲包囊，未見弓形蟲速殖子，說明這些小鼠已進入慢性感染階段。

一般認為，弓形蟲感染宿主后，弓形蟲包囊可長時間存在于腦組織或橫紋肌中(大約一生)，免疫能力正常的宿主可建立有效的Th1型細胞免疫反應(yīng)抑制包囊激活，并抵抗弓形蟲所引發(fā)的腦炎[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染虎源弓形蟲慢性期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布大量的弓形蟲包囊，且存在與弓形蟲包囊相關(guān)的病理組織損傷，并引發(fā)了弓形蟲性非化膿性腦炎。關(guān)于Chinese1型弓形蟲對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和分布，尚未見報道。Prugniuad(Pru)株弓形蟲感染小鼠70 d后，大腦也可見明顯的病理損傷(炎性細胞浸潤)[11]。弓形蟲慢性感染階段，可改變或顛覆宿主神經(jīng)元的活性，從而永久性的影響宿主行為[12]。這些結(jié)果說明，弓形蟲慢性感染期對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)有損傷，并推測影響其神經(jīng)功能。本課題組在日常管理弓形蟲慢性感染的小鼠過程中，發(fā)現(xiàn)其存活期明顯低于健康小鼠(P<0.05)。因人類抵抗弓形蟲免疫反應(yīng)與小鼠完全不同，因此弓形蟲慢性感染期是否引起人和其他動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理損傷，還不確定。但對自然感染弓形蟲的黑猩猩研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲可改變其行為[13]。而且，流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，弓形蟲血清陽性患者與患精神分裂癥和躁郁癥存在相關(guān)性[14]。Chinese1型弓形蟲是我國人和動物的優(yōu)勢蟲株，其慢性感染期潛在的危害尚需更多的客觀評價。

根據(jù)對照組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)未見明顯損傷，以及試驗組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷周圍可見弓形蟲包囊分布這一特點，說明這些損傷和炎癥反應(yīng)是弓形蟲感染引起的。大腦皮質(zhì)的弓形蟲包囊數(shù)量和損傷程度均處于較高水平，而小腦半球的弓形蟲包囊分布最少(P<0.05)。這一結(jié)果提示，臨床病理診斷弓形蟲腦炎時，大腦皮質(zhì)是理想的檢查部位。綿羊弓形病急性感染時，也發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)和視交叉的損傷程度最重，弓形蟲蟲體分布最多[15]。弓形蟲感染后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病原分布和損傷特點推測弓形蟲可影響宿主的認知功能和視野缺損，表現(xiàn)在不能集中注意力進行觀察和思考問題、健忘、情緒波動和視力障礙。

弓形蟲速殖子腹腔注射感染小鼠，弓形蟲可經(jīng)淋巴和血液循環(huán)擴散至腦部中樞神經(jīng)。弓形蟲速殖子進入大腦血管內(nèi)皮細胞，并在大量復(fù)制后裂解內(nèi)皮細胞，從而攻破血腦屏障，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[16]。速殖子主要進入神經(jīng)元和神經(jīng)干細胞進行復(fù)制，活化小膠質(zhì)細胞，并導(dǎo)致腦組織的損傷[17]。但弓形蟲嗜中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機制，還不清晰。

該研究豐富了我國Chinese1型弓形蟲蟲株對宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷特征研究，展示了小鼠感染Chinese1型弓形蟲慢性感染期中樞神經(jīng)系統(tǒng)包囊的分布和炎癥反應(yīng)程度，為探討人和動物的慢性弓形蟲病的神經(jīng)系統(tǒng)致病機理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。