過表達(dá)TPL2蛋白PK-15細(xì)胞系的建立及其功能驗(yàn)證

郝軍紅，閆鳴昊，張大俊,張學(xué)剛，申超超，徐國偉，李國麗，張克山，鄭海學(xué)，劉湘濤

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

TPL2是絲氨酸/蘇氨酸激酶，最初被鑒定為原癌基因并在造血和非造血功能區(qū)表達(dá)[1]。全長的TPL2的開放閱讀框會編碼含467個氨基酸(amino acid，簡稱aa)的胞質(zhì)蛋白，由于mRNA上存在2個翻譯起始位點(diǎn)甲硫氨酸1(Methionine1，簡稱M1)和M30，TPL2 mRNA會編碼58 000和52 000大小的2種蛋白[2]。TPL2信號傳導(dǎo)在先天性和適應(yīng)性免疫以及癌癥中作為潛在的原癌基因發(fā)揮重要作用[3]。在未受刺激的細(xì)胞中，TPL2與NF-κB1p105組成性相關(guān)，這種相互作用對于TPL2穩(wěn)定性是必需的，但阻斷TPL2激酶活性[4]。IKKβ對p105的磷酸化導(dǎo)致TPL2釋放[5]。IKKβ還介導(dǎo)TPL2在T290和S400的磷酸化，其調(diào)節(jié)TPL2激酶活性[5-8]。一旦被磷酸化，TPL2瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，但不穩(wěn)定，快速通過蛋白酶體降解[4,9]?；罨腡PL2直接磷酸化MEK1/2，其然后激活ERK1/2[10-11]。除了這個主要功能，TPL2也涉及MAPK8(JNK)，MAPK14(P38)的活化，和轉(zhuǎn)錄因子NFAT和NF-κB[12-15]。此外，TPL2在先天免疫中的作用研究僅限于細(xì)菌感染模型，目前還缺乏病毒病原體方面的研究。TPL2在病毒感染期間以IRF7依賴性方式被誘導(dǎo)和激活，活化后的TPL2可抑制IRF3的轉(zhuǎn)錄活性，同時促進(jìn)IRF3：IRF7二聚體的形成和激活ERK途徑。缺乏TPL2導(dǎo)致抗病毒轉(zhuǎn)錄組的改變，最終增加細(xì)胞對病毒的易感性[16]。前期研究報(bào)道在TPL2缺陷的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中水泡性口炎病毒(VSV)的復(fù)制增加[16]，因此，通過整合先天性和適應(yīng)性抗病毒免疫應(yīng)答，在流感病毒感染期間，TPL2限制病毒復(fù)制并促進(jìn)宿主保護(hù)。

為獲得穩(wěn)定表達(dá)TPL2的PK-15/TPL2細(xì)胞系，用于對抗病毒如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和豬塞內(nèi)加谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)進(jìn)行評價，本試驗(yàn)擬構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)TPL2的細(xì)胞模型，不僅為抗病毒研究TPL2的生物學(xué)活性機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，也為FMDV或SVV病毒所致疾病的疫苗制備提供模型。

1 材料與方法

1.1 材料豬腎傳代細(xì)胞PK-15由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；10%胎牛血清(BI)，DMEM培養(yǎng)基(Thermo fisher scientific)，Opti-MEM、雙抗(青霉素和鏈霉素溶液)(GIBICO)，0.25% EDTA胰酶 (Gibco)，PBS(Hy-Clone)；Trizol(TaKaRa)；口蹄疫毒株A/GDMM/CHA/2013，SVV毒株由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供；LipofectamineTM 3000(Invitrogen)；5×Golden RT MasterMix (with dsDNase)，20×Oligo dT(25)&Random Primer，Rnase Free H2O(HaiGene)。

1.2 儀器激光共聚焦顯微鏡(德國LEICA公司)，GLOMAX化學(xué)發(fā)光檢測儀(PROMEGA公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海一恒儀器公司)，5804R高速冷凍離心機(jī)、小型高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，制冰機(jī)(FOCUSUN公司)，紫外可見分光光度計(jì)(上海昂拉儀器公司)，DYY-12型穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器廠)，生物安全柜(蘇州蘇凈集團(tuán))，96孔板搖床(其林貝爾公司)，ABI梯度PCR儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱、QuanStudio5定量PCR儀，700系列-80℃冰箱(美國Thermo公司)，實(shí)時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1重組慢病毒載體Lv-TPL2的構(gòu)建 利用化學(xué)合成法重組慢病毒載體Lv-TPL2載體構(gòu)建：合成Sus scrofa (pig) TPL2基因，序列見NCBI上XM_021064737.1；兩段酶切位點(diǎn)為：XbaⅠ和BamHⅠ，酶切重連插入到慢病毒載體Lv-PCDH的MCS區(qū)。

1.3.2定量引物設(shè)計(jì)與合成 引物序列見表1。

表1 試驗(yàn)引物序列

1.3.3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和接毒 實(shí)時定量PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)的有關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量。包括總RNA的提取、RNA的逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量RT-PCR。具體方法參照文獻(xiàn)[17]。

1.3.4間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、毒價測定 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、毒價測定實(shí)驗(yàn)檢測病毒的復(fù)制。具體方法參照文獻(xiàn)[18]。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體Lv-TPL2的構(gòu)建對TPL2 mRNA在PK細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行測定結(jié)果顯示，與pCDH- PK-15細(xì)胞株相比，試驗(yàn)組PK-15/TPL2細(xì)胞株中TPL2 mRNA表達(dá)明顯升高，表達(dá)量為pCDH- PK-15細(xì)胞株的250倍，差異極顯著(P<0.01)(圖1)。表明Lv- TPL2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞能轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，外源基因已整合到 PK-15細(xì)胞基因組。qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)束后，利用核酸電泳實(shí)驗(yàn)對qRT-PCR的產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，對于β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶一致時，PK-15/TPL2細(xì)胞株TPL2基因與pCDH-PK-15細(xì)胞株相比，差異明顯(圖 2)。

圖1 qRT-PCR驗(yàn)證TPL2蛋白在PK-15/PCDH、PK-15/TPL2細(xì)胞表達(dá)

圖2 核酸電泳試驗(yàn)驗(yàn)證TPL2的qRT-PCR產(chǎn)物

2.2 qRT-PCR鑒定接毒FMDV后對PK-15/TPL2細(xì)胞株中TPL2 mRNA的表達(dá)進(jìn)行測定， qRT-PCR結(jié)果表明，與PK-15/ PCDH細(xì)胞株相比，在接毒FMDV后，試驗(yàn)組PK-15/TPL2細(xì)胞株中TPL2mRNA表達(dá)明顯升高，差異極顯著(圖3)。

圖3 PK-15/TPL2細(xì)胞接FMDV后實(shí)時定量檢測TPL2mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化 注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。下同

2.3 qRT-PCR/IFA鑒定接毒FMDV后在PK-15/TPL2細(xì)胞株抑制FMDV病毒的復(fù)制在接毒后8，16 h時收取的樣品中，PK-15/TPL2細(xì)胞中FMDV的mRNA表達(dá)量均低于野生型PK-15細(xì)胞中FMDV的mRNA表達(dá)量(圖4)。也就是說PK-15/TPL2細(xì)胞與野生型PK-15相比在接毒后8，16 h均能抑制FMDV的復(fù)制。這是因?yàn)镻K-15/TPL2細(xì)胞在病毒刺激下過量表達(dá)TPL2，進(jìn)而抑制了FMDV病毒的復(fù)制。在接毒后16 h時的樣品中，PK-15/TPL2細(xì)胞中的病變程度均遠(yuǎn)低于野生型PK-15細(xì)胞的病變程度(圖5)。這表明PK-15/TPL2細(xì)胞可以通過過量表達(dá)TPL2進(jìn)而抑制FMDV病毒的復(fù)制。

圖4 PK-15/TPL2細(xì)胞系通過qRT-PCR驗(yàn)證顯著抑制FMDV的復(fù)制

圖5 PK-15/TPL2細(xì)胞系通過IFA顯著抑制FMDV的復(fù)制(63×) A.感染FMDV 16 h的PK-15；B.感染FMDV 16 h的PK-15/TPL2

2.4 qRT-PCR/IFA鑒定接毒SVV后在PK-15/TPL2細(xì)胞株抑制SVV病毒的復(fù)制結(jié)果顯示，在接毒后8，16 h時的樣品中，PK-15/TPL2細(xì)胞中SVV的mRNA表達(dá)量低于野生型PK-15細(xì)胞中SVV的相對表達(dá)量(圖6)。在接毒后16 h時的樣品中，PK-15/TPL2細(xì)胞中的病變程度均遠(yuǎn)低于野生型PK-15細(xì)胞的病變程度(圖7)。說明與野生型PK-15相比，PK-15/TPL2細(xì)胞抑制SVV的復(fù)制。

圖6 PK-15/TPL2細(xì)胞系通過qRT-PCR顯著抑制SVV的復(fù)制

圖7 PK-15/TPL2細(xì)胞系通過IFA顯著抑制SVV的復(fù)制(63×) A.感染SVV 16 h的PK-15；B.感染SVV 16 h的PK-15/TPL2

2.5 FMDV/SVV病毒在細(xì)胞株P(guān)K-15/TPL2中TCID50的測定按Reed-Muench法計(jì)算FMDV病毒的TCID50，PK-15細(xì)胞的TCID50為10-5.8/mL，PK-15/TPL2細(xì)胞系的TCID50測定結(jié)果為10-4.4/mL。按Reed-Muench法測定SVV病毒的TCID50，PK-15細(xì)胞的TCID50為10-8.5/mL。PK-15/TPL2細(xì)胞系的TCID50測定結(jié)果為10-5.5/mL。結(jié)果表明細(xì)胞株P(guān)K-15/TPL2明顯抑制FMDV/SVV病毒的復(fù)制。

3 討論

FMDV結(jié)構(gòu)蛋白包括VP1、VP2、VP3和VP4，一般認(rèn)為VP1起著重要的抗原作用，其21-40肽促能進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)[19]，而141-160肽能引起機(jī)體的體液免疫反應(yīng)[20]。由于FMDV的RGD序列可以通過天然免疫受體感染細(xì)胞，且具有抗體依賴增強(qiáng)作用[21]，說明FMDV等小RNA病毒受外界條件變化時(連續(xù)傳代，免疫壓力等)會產(chǎn)生不同的抗原變異株[22]，導(dǎo)致疫苗的免疫力減弱，很難通過疫苗手段進(jìn)行控制與根除。因此，科學(xué)家們在研究病毒變異和疫苗的基礎(chǔ)上開始關(guān)注病毒與宿主之間的關(guān)系。從病毒和感染細(xì)胞之間的相互作用來看，多種病毒可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡完成病毒自我增殖[23-24]。MAP3K8又稱TPL2，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在不同的組織中都有著廣泛的表達(dá)。TPL2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在先天性和適應(yīng)性免疫以及在癌癥中作為潛在的原癌基因起著重要作用[3]。TPL2已被認(rèn)為是I型(IFN-α/β)和II型(IFN-γ)IFN的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是多種病毒感染途徑的重要組成部分。TPL2以細(xì)胞類型特異性方式差異調(diào)節(jié)IFN-α/β和IFN-λ的誘導(dǎo)。盡管TPL2在IFNα/β和IFNλ的調(diào)節(jié)中都很重要，但只有IFNλ在體外和體內(nèi)流感病毒感染期間需要TPL2誘導(dǎo)[25]。研究報(bào)道在TPL2缺陷的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中水泡性口炎病毒(VSV)的復(fù)制增加[16]。

本試驗(yàn)通過激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、TCID50以及實(shí)時熒光定量等手段分別從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平等驗(yàn)證已成功構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)TPL2的PK-15/TPL2細(xì)胞株。該細(xì)胞系連續(xù)傳代TPL2蛋白不丟失，說明具有遺傳穩(wěn)定性。TPL2其蛋白主要表達(dá)于PK-15細(xì)胞質(zhì)，因此，通過整合先天性和適應(yīng)性抗病毒免疫應(yīng)答，在流感病毒感染期間，TPL2限制病毒復(fù)制并促進(jìn)宿主保護(hù)。PK-15/TPL2細(xì)胞株接種FMDV、SVV后，與正常PK-15細(xì)胞相比，細(xì)胞病變效應(yīng)減弱。RT-PCR分析時，PK-15/TPL2細(xì)胞中FMDV、SVV相對表達(dá)量明顯降低。由此說明整合在細(xì)胞上的TPL2成功獲得表達(dá)(圖1)，從圖4～7中也可以看出TPL2的表達(dá)使得FMDV、SVV病毒復(fù)制效果減弱。本試驗(yàn)采用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)和基因合成技術(shù)建立一種可以降低FMDV、SVV復(fù)制的工具，慢病毒表達(dá)載體，包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，它通過感染細(xì)胞，并隨著宿主細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的表達(dá)的目標(biāo)，與瞬時轉(zhuǎn)染相比，慢病毒轉(zhuǎn)染能夠達(dá)到轉(zhuǎn)染效果更穩(wěn)定，目標(biāo)更準(zhǔn)確[26]，同時包裝的慢病毒可以感染各種類型細(xì)胞，從而為本試驗(yàn)的成功構(gòu)建提供有利途徑。上述數(shù)據(jù)已證實(shí)，本次構(gòu)建的細(xì)胞PK-15/TPL2細(xì)胞被穩(wěn)定整合，具有遺傳穩(wěn)定性。

基因合成技術(shù)是在目的DNA片段兩端插入酶切位點(diǎn)，TPL2基因5′端和3′端引入酶切位點(diǎn)XbaⅠ和BamHⅠ，酶切的基因和慢病毒載體Lv-PCDH載體后重連，得到重組慢病毒載體Lv-TPL2。高效、快速地將目的基因克隆到目的載體上，通過去除冗長的亞克隆步驟節(jié)省操作時間，不同于傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶方法，避免了目的片段內(nèi)存在切點(diǎn)的問題而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率。依靠基因合成技術(shù)，使目的基因TPL2轉(zhuǎn)移到了目標(biāo)載體中，成功構(gòu)建Lv-TPL2載體。本試驗(yàn)利用該技術(shù)通過重組高效、快速獲得表達(dá)骨架，構(gòu)建的PK-15/TPL2細(xì)胞與正常PK-15細(xì)胞相比，形態(tài)上稍有改變，經(jīng)細(xì)胞IFA實(shí)驗(yàn)、TCID50試驗(yàn)等一系列試驗(yàn)驗(yàn)證，其生物學(xué)特性沒有異常，所以無論科學(xué)研究還是生產(chǎn)疫苗，該P(yáng)K-15/TPL2細(xì)胞完全可以用于小批量或大規(guī)模生產(chǎn)使用。

本試驗(yàn)旨在通過慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功建立穩(wěn)定表達(dá)TPL2的PK-15/TPL2細(xì)胞株:該細(xì)胞株因穩(wěn)定表達(dá)TPL2蛋白具有明顯抑制FMDV、SVV病毒復(fù)制的功能。不僅可以從細(xì)胞模型水平闡明抑制FMDV、SVV復(fù)制的關(guān)鍵靶基因，該細(xì)胞系的建立也為病毒的分離和研究TPL2的生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。