一株嗜鹽反硝化弧菌的耐鹽能力和降解能力研究

孫文妮， 田鳳蓉， 王開春， 徐軍， 王強， 張璐璐

（中藍連海設(shè)計研究院有限公司， 江蘇 連云港 222004）

生物法被廣泛地用于高鹽度廢水的處理中［1］。但是， 由于高鹽環(huán)境下的鹽析作用， 普通微生物的脫氫酶活性會降低， 高滲透壓易使微生物細胞脫水引起細胞原生質(zhì)分離， 從而導致微生物細胞破裂死亡［2］。 基于上述現(xiàn)象， 工程技術(shù)人員提出了利用嗜鹽耐鹽菌， 采用物化－生化耦合工藝技術(shù)處理高鹽廢 水 的 建 議［3－5］。 該 技 術(shù) 的 關(guān) 鍵 是 獲 取 耐 鹽 能 力、污染物降解能力、 抗鹽度沖擊能力等綜合性能較好的嗜鹽菌， 現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于嗜鹽菌株尤其是同時具有反硝化脫氮能力的菌株報道較少， 特別是耐鹽度超過10%以上的菌株。

本研究的嗜鹽菌株YL5－2 是從高鹽環(huán)境樣品中篩選分離得到弧菌屬菌種， 通過對菌株的生長條件、 耐鹽能力和降解能力的研究表明： 該菌株能夠耐受超高鹽度， 耐鹽范圍廣， 利用該菌株在高鹽度條件下進行反硝化脫氮取得了良好的效果， 特別是在10% 以上鹽度條件下反硝化脫氮效果顯著， 為該菌株在高鹽含氮廢水的直接生化處理方面提供了技術(shù)支撐和工程化應用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

YL5－2 菌株是從青海格爾木察爾汗鹽湖的環(huán)境樣品， 經(jīng)20% 左右鹽度分離篩選出來， 鑒定為嗜鹽弧菌屬菌種。 經(jīng)生理生化鑒定該菌株屬于兼性厭氧菌， 在好氧條件下可利用乙酸生長， 在厭氧條件下利用硝酸鹽生長， 為一株嗜鹽反硝化菌， 該嗜鹽菌株可利用乙酸、 丙酸和溴代琥珀酸為唯一碳源。

1.2 試驗試劑

葡萄糖、 乙酸鈉、 檸檬酸三鈉、 甘油、 甲醇、甲胺、 乙酸、 丙酸、 磷酸氫二鉀、 磷酸二氫鉀、 硫酸 銨、 氯 化 銨、 硝 酸 鉀、 MgSO4、 CaCl2、 NaCl、Na2HPO4、 NaH2PO4、 Na2CO3、 NaHCO3， 以 上 試 劑均為分析純。

生化試劑為酵母粉、 蛋白胨、 牛肉膏、 瓊脂粉。 純度為96%的溴代琥珀酸。

1.3 培養(yǎng)基

（1） 菌株耐鹽試驗培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基成分為甘油50 mg／L， 葡萄糖25 mg／L， 甲醇50 mg／L， 甲胺20 mg／L， 乙酸鈉25 mg／L， 檸檬酸三鈉25 mg／L，酵母粉10 mg／L， 蛋白胨20 mg／L， 牛肉膏20 mg／L， NaCl 0 ～340 g／L， 固體培養(yǎng)基再添加瓊脂20 g／L。 pH 值為7.5。

（2） 菌株生長溫度試驗培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基成分為甘油500 mg／L， 葡萄糖250 mg／L， 甲醇500 mg／L， 甲胺200 mg／L， NaCl 150 g／L， 乙酸鈉250 mg／L， 檸檬酸三鈉250 mg／L， 酵母粉100 mg／L， 蛋白胨200 mg／L， 牛肉膏200 mg／L， 微量元素少量。pH 值為7.5。

（3） 菌株生長pH 值試驗培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基成分為 甘 油500 mg／L， 葡 萄 糖250 mg／L， 甲 醇500 mg／L， 甲胺200 mg／L， NaCl 150 g／L， 乙酸鈉250 mg／L， 檸檬酸三鈉250 mg／L， 酵母粉100 mg／L，蛋白胨200 mg／L， 牛肉膏200 mg／L， 微量元素少量。 以Na2HPO4／NaH2PO4（pH 值 為5.0 ～7.0）、Na2CO3／NaHCO3（pH 值為8.0 ～12.0）為緩沖液調(diào)節(jié)設(shè)定培養(yǎng)基pH 值。

（4） 菌株有機酸降解培養(yǎng)基。 乙酸降解培養(yǎng)基： 乙酸2 000 mg／L， 磷酸二氫鉀、 MgSO4、 CaCl2各100 mg／L， 氯化銨、 尿素各250 mg／L， NaCl 質(zhì)量分數(shù)3%～30%。 緩沖液調(diào)節(jié)pH 值至7.5 ～8.0。

丙酸降解培養(yǎng)基： 丙酸2 000 mg／L， 磷酸二氫鉀、 MgSO4、 CaCl2各100 mg／L， 氯化銨、 尿素各250 mg／L， NaCl 質(zhì)量分數(shù)3%～30%。 緩沖液調(diào)節(jié)pH 值至7.5 ～8.0。

溴代琥珀酸降解培養(yǎng)基： 溴代琥珀酸2 000 mg／L， 磷酸二氫鉀、 MgSO4、 CaCl2各100 mg／L，氯化銨、 尿素各250 mg／L， NaCl 質(zhì)量分數(shù)3% ～30%。 緩沖液調(diào)節(jié)pH 值至7.5 ～8.0。

（5） 菌株反硝化脫氮培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基成分為乙酸2 000 mg／L、 蛋白胨20 mg／L、 牛肉膏20 mg／L，NO3-－N 100 mg／L， NaCl 質(zhì)量分數(shù)3%～30%。 緩沖液調(diào)節(jié)pH 值至7.5 ～8.0。

1.4 儀器設(shè)備

生物安全柜、 超凈工作臺、 熒光顯微鏡、 電子天平、 高壓蒸汽滅菌器、 隔水式恒溫培養(yǎng)箱、 生化培養(yǎng)箱、 恒溫搖床、 干燥箱、 手持式pH 計、 GE總有機碳分析儀、 UV754N 紫外分光光度計、 氣相分子吸收光譜儀等。

1.5 試驗方法

（1） 菌株YL5－2 耐鹽能力試驗。 將活化的新鮮菌苔劃線于不同鹽度（0 ～34% 飽和鹽度）的耐鹽試驗固體平板培養(yǎng)基上， 封口膜封口防止培養(yǎng)基水分流失增加鹽度， 于35 ～37 ℃培養(yǎng)， 考察各鹽度下培養(yǎng)基能否長出新的菌苔及生長速度， 評價菌株YL5－2 的耐鹽能力。

（2） 菌株YL5－2 適宜生長溫度范圍。 根據(jù)菌株耐鹽試驗情況， 在最適生長鹽度， pH 值為7.2左右的條件下， 比較不同溫度下（4 ～50 ℃）菌體的生長量， 以O(shè)D600值來間接衡量， 繪制生長曲線，根據(jù)生長趨勢， 判定菌株適宜生長溫度。

（3） 菌株YL5－2 適宜生長pH 范圍。 在菌株最適溫度和最適鹽度條件下， 比較不同pH 值（5 ～11）下菌體生長量， 以O(shè)D600值來間接衡量， 繪制生長曲線， 根據(jù)生長趨勢， 判定菌株適宜生長pH 范圍。

（4） 菌株YL5－2 的降解能力。 有機酸降解試驗： 設(shè)置3%～30%鹽度梯度， 將活化的菌株分別轉(zhuǎn)接到乙酸、 丙酸和溴代琥珀酸初始質(zhì)量濃度為2 000 mg／L、 初始pH 值為7.5 ～8.0 的降解培養(yǎng)基中， 在35 ℃、 160 r／min 條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h， 每24 h 取樣測TOC， 通過考察TOC 去除情況反映有機酸降解效果。

反硝化脫氮試驗： 設(shè)置3%～30% 鹽度梯度，將活化的菌株分別轉(zhuǎn)接到NO3-－N 初始質(zhì)量濃度為100 mg／L、 碳源充足、 初始pH 值為7.5 ～8.0 的反硝化脫氮培養(yǎng)基中， 在35 ℃、 60 r／min 條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h， 每24 h 取樣測定出水NO3-－N、 NO2-－N和TOC 濃度， 同時關(guān)注pH 值變化， 及時調(diào)節(jié)pH 值在初始濃度范圍內(nèi)。 考察菌株的反硝化脫氮能力。

1.6 分析方法

COD 采用硝酸銀沉淀氯離子重鉻酸鉀氧化法（GB／T 11914—89）， TOC 采用燃燒氧化－非分散紅外吸收法（HJ 501—2009）， pH 值采用便攜式pH 計法，NO2-－N 采用氣相分子吸收光譜法（HJ／T197—2005），NO3-－N 采用氣相分子吸收光譜法（HJ／T 198—2005），總鹽采用全鹽量的測定 重量法（HJ／T 51－1999）， Cl－采用氯化物的測定 硝酸銀滴定法（GB／T 11896—1989）， OD600采用紫外分光光度計法。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株耐鹽能力

根據(jù)菌株的篩選過程中的培養(yǎng)基鹽度（20% 鹽度）初步判定該菌為中度以上嗜鹽耐鹽菌， 為考察菌株嗜鹽耐鹽范圍， 試驗設(shè)定0 ～34% 飽和鹽度的廣泛鹽度范圍， 進一步考察菌株在高鹽廢水中的應用潛力， 結(jié)果如表1 所示。

表1 菌株在不同鹽濃度培養(yǎng)基上的生長情況Tab. 1 Growth of strains on mediums with different salinities

培養(yǎng)基配制過程中， 34%鹽度已經(jīng)飽和， 但是，試驗過程中發(fā)現(xiàn)32%鹽度的培養(yǎng)基冷卻后有少量鹽晶體析出， 接種劃線時， 沿著劃線軌跡出現(xiàn)鹽晶體， 說明32%鹽度已經(jīng)達到NaCl 的飽和鹽度。

由表1 可知， 在0 ～2% 鹽度培養(yǎng)基中無菌苔長出， 在3%～30% 鹽度培養(yǎng)基中3 d 內(nèi)可以明顯觀察到新長出的菌苔， 在8% ～28% 鹽度培養(yǎng)基中， 2 d 內(nèi)就可以明顯觀察到新長出菌苔， 在32%飽和鹽度培養(yǎng)基中生長7 d 以上才能長出肉眼可見菌苔。 從試驗結(jié)果可以看出， YL5－2 菌株耐鹽范圍為3%～32% 飽和鹽度， 適宜生長鹽度為3% ～30%， 最適生長鹽度為8%～28%， 為一株極端嗜鹽菌［6］。 利用該類型的嗜鹽微生物修復污染的天然鹽環(huán)境或者處理高鹽度污染廢水， 具有重要的理論研究價值和廣闊的應用前景［7］。

2.2 菌株YL5－2 適宜生長溫度

根據(jù)菌株耐鹽能力， 選擇菌株生長狀況良好的15% 鹽度作為溫度試驗的鹽度指標， 在pH 值為7.2 左右條件下， 通過測定不同溫度下菌株YL5－2菌液的OD600值， 反映菌體的濃度以及它的生長情況， 菌液OD600值越大則表明菌體的濃度越高、 生長狀況越好。 試驗結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下菌體生長曲線Fig.1 Growth curves of strains under different culture temperatures

由圖1 可知， 在15 ～45 ℃溫度范圍生長趨勢明顯； 4 ～10 ℃菌體濃度幾乎沒有增長趨勢， 說明溫度低于一定值時， 細胞膜呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)， 營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運輸受阻［8］， 影響了細胞的生長繁殖； 30 ～35 ℃時， 菌體濃度增長迅速， 12 h 基本達到對數(shù)生長期， 相比其他溫度下長勢更加明顯。 綜合以上分析， 認為YL5－2 菌種適宜的生長溫度范圍為15 ～45 ℃， 最適生長溫度范圍為30 ～35 ℃。

2.3 菌株YL5－2 適宜生長pH 值

在15% 鹽度， 溫度為35 ℃條件下， 設(shè)定pH值為5.0 ～11.0， 考察菌株適宜的pH 范圍， 為其批量擴增和應用提供參考， 試驗結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同pH 值條件下菌體生長曲線Fig. 2 Growth curves of strains under different pH conditions

由圖2 可知， 菌株YL5－2 在pH 值為5.0 ～6.0范圍， 菌體濃度幾乎不增長； 在pH 值為6.5 ～11.0的范圍均有一定的生長趨勢； 在pH 值為7.5 ～8.0范圍， 菌體濃度增長迅速， 相比其他pH 值范圍，菌體濃度長勢更加明顯。 環(huán)境pH 值的變化可引起細胞膜電荷和膜通透性的變化， 從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收， 影響代謝過程中酶的活性［9］， 改變微生物的形態(tài)， 甚至可導致微生物生長受到抑制甚 至 死 亡。 Shen 等［8］研 究 表 明 在 厭 氧 或 好 氧 的 膜生物反應器中， 能去除99.9% 以上的硝酸鹽且沒有亞硝酸鹽積累的最佳pH 值范圍是7.5 ～8.5。 pH值過高或過低均會抑制反硝化作用， 且反應的最終產(chǎn)物往往是NO2-－N 或N2O［10］。 由于反硝化產(chǎn)堿［11］，因此篩選出的菌株若能適應較廣泛pH 值， 那么其應用范圍會更加廣闊。

綜合以上分析， 菌株YL5－2 適宜生長的pH 值范圍為6.5 ～11， 最適生長pH 值范圍為7.5 ～8.0，表明該菌株能適應較廣泛的pH 值范圍， 在工程應用上有一定的優(yōu)勢。

2.4 嗜鹽菌株YL5－2 對有機酸的降解

對菌株YL5－2 進行有機酸降解試驗， 以乙酸、丙酸、 溴代琥珀酸3 種可被菌株用作唯一碳源的有機酸為降解底物進行試驗， 設(shè)置NaCl 鹽度梯度為3%、 5%、 8%、 10%、 12%、 15%、 18%、 20%、25%、 30% 等10 個菌株適宜生長鹽度條件， 在最適溫度35 ℃， 最適宜pH 值為7.5 ～8.0 條件下，通過72 h 培養(yǎng)， 檢測培養(yǎng)液TOC 濃度變化， 反映菌株對乙酸、 丙酸、 溴代琥珀酸3 種有機酸的降解能力， 結(jié)果如圖3 以及表2 所示。

圖3 不同鹽度下菌株對乙酸、 丙酸、 溴代琥珀酸的降解曲線Fig. 3 Degradation curves of acetic acid, propionic acid bromosuccinic acid by strains under different salinity conditions

表2 72 h 內(nèi)在鹽度下菌株對3 種有機酸的去除率Tab. 2 Removal rates of three kinds of organic acid by strains in 72 h under different salinity conditions

由圖3 以及表2 可知， 在鹽度為10% ～25%范圍內(nèi)， 菌株對乙酸的降解速率和去除率最高， 其中15% 鹽度為最適鹽度， 72 h 對乙酸TOC 的去除率高達96% 以上； 在鹽度為10%～25% 范圍內(nèi)菌株對丙酸的降解速率和去除率最高， 其中12% 鹽度為最適鹽度， 菌株在72 h 對丙酸TOC 的去除率高達94% 以上； 在鹽度為10%～20% 范圍內(nèi)， 菌株對溴代琥珀酸的降解速率和去除率最高， 其中12% 鹽度為最適鹽度， 72 h 對溴代琥珀酸TOC 的去除率達87%以上。

綜上得出， 菌株最適降解的有機酸碳源為乙酸， 最適NaCl 鹽度為15%， 乙酸去除率高達96%以上。 即使在30%的接近飽和鹽度條件下， 對乙酸的去除率仍可以達到79%， 也說明菌株在高鹽環(huán)境下表現(xiàn)出了極強的抗鹽度沖擊的能力。

表3 72 h NO3--N 去除情況以及NO2--N 富集情況Tab. 3 NO3--N removal and NO2--N enrichment in 72 h

2.5 嗜鹽菌YL5－2 反硝化脫氮能力

以乙酸為碳源， 在鹽度分別為3%、 5%、 8%、10%、 12%、 15%、 18%、 20%、 25%、 30% 的條件下培養(yǎng)72 h， 每24 h 取樣測定培養(yǎng)液NO3-－N、NO2-－N 濃度， 按照各時間點減少的NO3-－N 濃度與總投加NO3-－N 濃度的比值， 計算NO3-－N 轉(zhuǎn)化率；按照各時間點NO2-－N 富集濃度與總投加NO3-－N濃度的比值計算NO2-－N 的富集率。 試驗結(jié)果如表3 所示。

由表3 可知， 菌株在鹽度為3%～8%和25%～30%條件下都有一定反硝化作用， 但存在NO2-－N累積， 反應不徹底； 在10% ～20% 鹽度范圍內(nèi)，對NO3-－N 去除率達95% 以上， 且NO2-－N 富集率低甚至零富集。 結(jié)合該嗜鹽菌株的耐鹽能力試驗可知， 該菌株脫氮能力與它最適的生長鹽度環(huán)境有密切關(guān)系， 菌株在其最適生長的鹽度下， 脫氮效果也最佳。 這與王偉偉［12］研究的嗜鹽菌的嗜鹽機理相類似， 嗜鹽菌中嗜鹽酶要在一定鹽濃度下才能保證酶活性及穩(wěn)定性。

由試驗結(jié)果可知， 該嗜鹽菌株反硝化脫氮最佳NaCl 鹽度范圍為10%～20%， 這與一般情況下反硝化菌的耐鹽能力不同。 一般研究表明， 在鹽度不超過2% 的條件下， 反硝化系統(tǒng)可以保持良好的脫氮性能， 反硝化菌更具競爭優(yōu)勢， 但是， 在更高鹽度條件下， 往往反硝化速率會出現(xiàn)大幅下降， 甚至產(chǎn)生細胞層面的不可逆的影響［13－14］。 Wang 等［15］對反硝化顆粒污泥進行耐鹽能力的考察， 結(jié)果表明NaCl和Na2SO4這2 種無機鹽對微生物的半抑制質(zhì)量濃度分別為11.46 和21.72 g／L， 半致死質(zhì)量濃度分別為77.35 和100.58 g／L。 也有一些通過篩選嗜鹽反硝化菌進行高鹽脫氮的研究， 如郭艷麗等［16］篩選的菌株YL－1 能在鹽度為0 ～10%的培養(yǎng)液中生長， 有很好的反硝化效果； 焦點等［17］分離篩選得到的反硝化菌株DN2， 適合NaCl 鹽度為3%～10%環(huán)境的反硝化。 但是超過10%鹽度的反硝化脫氮鮮有報道。

同時， 試驗過程中觀察到， 在8%～25% 鹽度試驗組液面均明顯可見氣泡產(chǎn)生， 同時伴有少量絮凝菌體上浮， 說明該鹽度范圍明顯有N2生成， 反硝化作用效果良好， 這與劉超等［18］分析的反硝化反應產(chǎn)生N2導致污泥上浮現(xiàn)象一致。 在15% 鹽度時， 試驗組菌體絮凝性較好， 培養(yǎng)液澄清， 說明該菌株在一定鹽度條件下絮凝性能良好， 具有進一步研究的工程化應用潛力。

3 結(jié)論

（1） 通過耐鹽能力試驗， 得出菌株YL5－2 為一株極端嗜鹽菌。

（2） 嗜鹽菌YL5－2 的耐鹽能力極強， 最適生長NaCl 鹽度范圍為8%～28%， 最適生長溫度范圍為30 ～35 ℃， 最適生長pH 值范圍為7.5 ～8.0。

（3） 嗜鹽菌YL5－2 可降解乙酸、 丙酸、 溴代琥珀酸3 種有機酸， 其中乙酸為該嗜鹽菌株的最適碳源， 在NaCl 鹽度為10%～25% 范圍內(nèi)， 對乙酸去除率可達96%以上。

（4） 嗜鹽菌YL5－2 在35 ℃、 pH 值為7.5 ～8.0的厭氧環(huán)境下， 在NaCl 鹽度為3%～30%范圍內(nèi)對NO3-－N 進行反硝化脫氮， 最適鹽度范圍為10%～20%， 72 h 對質(zhì)量濃度為100 mg／L 的NO3-－N 去除率達95%以上， 且NO2-－N 富集率低， 甚至零富集。

（5） 嗜鹽菌株YL5－2 具有廣泛的耐鹽范圍，良好的有機酸降解能力和對NO3-－N、 NO2-－N 的反硝化脫氮能力， 在高鹽廢水特別鹽度高于10% 的廢水脫氮處理方面， 有著良好的應用潛力， 有望在腌制品、 海產(chǎn)品加工廢水， 高鹽硝酸鹽、 亞硝酸鹽化工廢水的反滲透濃水以及高鹽高有機酸型廢水的生化處理方面得到應用。