酶法制備含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的國(guó)際研究進(jìn)展

Dilay Sen，Derya Kahveci

（土耳其伊斯坦布爾科技大學(xué) 化學(xué)與冶金工程學(xué)院 食品工程系，土耳其 伊斯坦布爾 34469）

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是一類重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)靠近脂肪酸分子甲基端的第一個(gè)雙鍵的位置，多不飽和脂肪酸主要分為ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸。ω-3多不飽和脂肪酸主要是α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA，C18:3），ω-6多不飽和脂肪酸主要是亞油酸（linolenic acid，LA，C18:2）。這兩種脂肪酸（FAs）都不能在體內(nèi)合成，因而是必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被稱為必需脂肪酸。ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸在代謝過(guò)程中使用相同的酶，因此，ALA和LA的相對(duì)含量會(huì)影響彼此的代謝效率[1]。

目前研究表明，ω-3多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA，C20:5）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，C22:6）對(duì)人體健康有益。在成人體內(nèi)只有不到8%的ALA轉(zhuǎn)化為EPA，而ALA向DHA的轉(zhuǎn)化則可忽略不計(jì)（＜0.02%～4%）。因此，EPA和DHA都應(yīng)通過(guò)飲食攝入進(jìn)行補(bǔ)充。ω-3多不飽和脂肪酸的主要來(lái)源是海產(chǎn)品，由浮游植物和藻類合成，經(jīng)食物鏈進(jìn)入魚(yú)類和海洋哺乳動(dòng)物的脂質(zhì)中[2]。為了充分發(fā)揮ω-3多不飽和脂肪酸對(duì)人體健康的益處，建議將此類必需脂肪酸引入食品和油脂中，而非食用魚(yú)類。Ward和Singh[3]指出，每天攝入1 g EPA和DHA需要食用60～135 g鮭魚(yú)，這引起了人們對(duì)富含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的興趣。

可以通過(guò)化學(xué)酯交換或酶促酯交換的方法進(jìn)行油脂改性，其工藝過(guò)程如圖1所示。由于ω-3多不飽和脂肪酸的高不飽和度，特別易于氧化，因此需要在高溫下進(jìn)行的化學(xué)酯交換不適用于此類油脂。此外，ω-3多不飽和脂肪酸在甘油骨架上的位置對(duì)其在體內(nèi)的消化吸收有重要影響。ω-3多不飽和脂肪酸位于甘油骨架的sn-2位上時(shí)可有效防止氧化[4]，而且以2-單?；视停?-monoacylglycerol，2-MAG）的形式更利于吸收利用[5]。因此，具有特異選擇性的酶法酯交換更適合制備富含ω-3多不飽和脂肪酸的油脂。

本文將簡(jiǎn)要介紹含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的營(yíng)養(yǎng)特性，并重點(diǎn)評(píng)述2015—2019年酶法制備含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的國(guó)際研究進(jìn)展。

圖1 化學(xué)酯交換和酶促酯交換反應(yīng)過(guò)程流程圖（改編自參考文獻(xiàn)6）。

1 ω-3多不飽和脂肪酸的營(yíng)養(yǎng)功效

20世紀(jì)70年代以來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)格陵蘭愛(ài)斯基摩人的低冠心病發(fā)病率與他們對(duì)多脂魚(yú)類的高攝入量有關(guān)[7]，因此，人們開(kāi)始關(guān)注ω-3多不飽和脂肪酸對(duì)健康的影響。ω-3多不飽和脂肪酸主要是通過(guò)改變細(xì)胞膜脂組成、細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控基因表達(dá)而發(fā)揮作用，它們可以調(diào)控肝臟、心臟、脂肪組織和大腦中的基因表達(dá)[8]。根據(jù)現(xiàn)有的研究，ω-3多不飽和脂肪酸在預(yù)防和治療心血管疾病、高血壓、糖尿病、關(guān)節(jié)炎和其它炎癥性及自身免疫性疾病和癌癥方面發(fā)揮著重要作用，對(duì)正常的生長(zhǎng)發(fā)育，尤其是大腦和視網(wǎng)膜的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。

1.1 對(duì)心血管疾病的功效

心血管疾病是所有影響心臟和循環(huán)系統(tǒng)的疾病的通稱。它是西方社會(huì)人群的主要死亡原因，并且與西方飲食中常見(jiàn)的高脂肪攝入，尤其是飽和脂肪的攝入有關(guān)。經(jīng)常食用含ω-3多不飽和脂肪酸的魚(yú)或魚(yú)油可降低冠心病的發(fā)病率和死亡率[9]，這已被流行病學(xué)研究充分證實(shí)[10]，然而，為了預(yù)防心血管疾病而食用的ω-3多不飽和脂肪酸補(bǔ)充劑的作用，至今仍存在爭(zhēng)議[11]。研究表明，魚(yú)對(duì)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的有益影響是源于魚(yú)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的協(xié)同作用，而不僅僅是ω-3多不飽和脂肪酸的作用。

1.2 對(duì)癌癥的功效

癌癥一詞涵蓋了100多種疾病。ω-3多不飽和脂肪酸已被證實(shí)具有抗癌作用，特別是對(duì)乳腺癌[12]、結(jié)腸癌[13]和前列腺癌[14]。此外，ω-3多不飽和脂肪酸可能會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)療法的敏感性，從而提升常規(guī)療法的功效，特別是對(duì)治療耐藥癌癥的療效[15]。

1.3 對(duì)糖尿病的功效

胰島素在細(xì)胞水平參與脂肪酸代謝的各個(gè)方面，這也與糖尿病相關(guān)。大量人群實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，ω-3多不飽和脂肪酸對(duì)高甘油三酯血癥具有積極作用且可改變膽固醇的分布，因此，建議對(duì)糖尿病患者使用ω-3多不飽和脂肪酸[16]。其中一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，愛(ài)斯基摩人胰島素抵抗和葡萄糖不耐癥的發(fā)病率迅速增加，這與從食用含高ω-3多不飽和脂肪酸和低飽和脂肪酸（saturated FAs，SFA）的天然魚(yú)類和海洋哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)變?yōu)槭秤玫挺?3多不飽和脂肪酸和高飽和脂肪酸的食品有關(guān)[17]。

1.4 對(duì)炎癥性疾病的功效

炎癥是一系列急性和慢性人類疾病的組成部分，其特征是炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生?；ㄉ南┧幔╝rachidonic acid，AA，C20:4）的衍生物類花生酸具有促炎效應(yīng)。另一方面，ω-3多不飽和脂肪酸代謝產(chǎn)生了消炎介質(zhì)[18-19]，稱為消退素、保護(hù)素和巨噬細(xì)胞消炎素。它們既有直接作用（例如，通過(guò)代替AA作為類花生酸底物并抑制AA代謝），又有間接作用（例如，通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子激活改變炎癥基因的表達(dá)）[18，20-21]。此外，食用富油魚(yú)類也可有效預(yù)防兒童哮喘[22]。

1.5 對(duì)神經(jīng)組織發(fā)育的功效

ω-3多不飽和脂肪酸，尤其是DHA，是人腦的重要組成部分，腦內(nèi)約三分之一的脂質(zhì)由ω-3多不飽和脂肪酸組成。大腦發(fā)育中DHA的減少與動(dòng)物體內(nèi)神經(jīng)元再生的減少、神經(jīng)遞質(zhì)代謝的不足、學(xué)習(xí)和視覺(jué)功能以及運(yùn)動(dòng)技能的改變有關(guān)[23]。此外，流行病學(xué)研究表明，孕婦DHA水平低與其嬰兒神經(jīng)和視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育不良風(fēng)險(xiǎn)增加之間存在關(guān)聯(lián)[24-26]。孕婦飲食中包含EPA和DHA對(duì)于確保她們的脂肪組織中含有這些必需脂肪酸，以供發(fā)育中的胎兒和母乳喂養(yǎng)的新生兒成長(zhǎng)發(fā)育是非常重要的[27]。ω-3多不飽和脂肪酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的另一個(gè)作用是預(yù)防精神疾病。盡管這些疾病的病因還不完全清楚，但目前的研究表明，食用ω-3多不飽和脂肪酸可降低抑郁的風(fēng)險(xiǎn)[25，28-29]，并改善慢性患者的抑郁癥狀[30]?；加袉蜗嘁钟舭Y、季節(jié)性冬季情感障礙或社交焦慮障礙患者，紅細(xì)胞膜和血漿中的EPA濃度[31]和DHA濃度[31-32]含量較低[25]。

1.6 對(duì)其他疾病的功效

其他報(bào)道的ω-3多不飽和脂肪酸的作用包括增強(qiáng)體重減輕對(duì)超重患者血脂血糖和胰島素水平的影響[33-34]、降低血壓[35]、減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)肌肉痛、炎癥性腸病、痛經(jīng)[36-37]、減少更年期婦女的潮熱[38]等。

輕度消化不良和打嗝是食用魚(yú)油的主要不良反應(yīng)。汞和多氯聯(lián)苯等環(huán)境毒素可能污染魚(yú)類等海洋產(chǎn)品，并對(duì)人類造成潛在危害[39]。

2 含有ω-3多不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)

結(jié)構(gòu)脂質(zhì)（structured lipids，SLs）是具有特殊功能或營(yíng)養(yǎng)特性的重組甘油三酯（triacylglycerols，TAGs）。結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的制備是通過(guò)化學(xué)或酶法改變甘油三酯的脂肪酸組成或脂肪酸位置分布。

sn-1和sn-3位置含有中碳鏈脂肪酸（M）和sn-2位置含有ω-3多不飽和脂肪酸（L）的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)因其營(yíng)養(yǎng)特性而備受關(guān)注。這種脂質(zhì)被稱為MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，綜合了不同鏈長(zhǎng)脂肪酸的營(yíng)養(yǎng)功能，并在體內(nèi)消化代謝過(guò)程中發(fā)揮健康效應(yīng)。攝入后，甘油三酯通過(guò)舌、胃，更主要是通過(guò)胰脂肪酶水解為2-單?；视停?-MAG）和2個(gè)脂肪酸。對(duì)于MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，消化產(chǎn)物是富含ω-3多不飽和脂肪酸的2-MAG和中碳鏈游離脂肪酸（medium-chain free fatty acids，MCFFA），后者具有更高的血漿清除率、更高的氧化速率、更好的氮平衡作用和更少沉積在脂肪組織中的傾向。因此，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)適合為吸收不良患者、短腸綜合征患者、燒傷后的恢復(fù)患者以及早產(chǎn)兒快速提供能量。但是，富含中碳鏈脂肪酸的油脂往往缺乏必需的ω-3多不飽和脂肪酸。將ω-3多不飽和脂肪酸結(jié)合到甘油骨架的sn-2位置，可以更好地防止氧化[4]以及更好地以2-MAG形式被吸收[5]。MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)對(duì)免疫功能、氮平衡和血液中的脂質(zhì)清除具有積極作用，不僅可以作為消化不良和脂質(zhì)吸收不良患者的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，而且還可以作為老年人的高附加值保健品[40]。

酶法合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)主要有三種方法：（1）富含ω-3多不飽和脂肪酸的甘油三酯與中碳鏈脂肪酸的酸解反應(yīng)，其目的是用中碳鏈脂肪酸取代sn-1，3位置的脂肪酸、保留sn-2位置的ω-3多不飽和脂肪酸，反應(yīng)結(jié)束后，游離脂肪酸可經(jīng)蒸餾或堿提后除去。（2）分別富含ω-3多不飽和脂肪酸和中碳鏈脂肪酸的兩個(gè)甘油三酯進(jìn)行酯交換反應(yīng)。如果可以抑制水解反應(yīng)，則產(chǎn)物將只有重組甘油三酯，通過(guò)去除催化劑即可回收產(chǎn)物。然而，產(chǎn)生的重組甘油三酯將包括MLM型結(jié)構(gòu)脂以及其它重組甘油三酯。因此，此方法不適合制備純MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。（3）兩步法，首先是甘油三酯醇解反應(yīng)生成富含ω-3多不飽和脂肪酸的2-MAG，再與中碳鏈游離脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)制得。醇解反應(yīng)后分離除去副產(chǎn)物，因此，該方法是合成高純度結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的最適宜路線。sn-1，3特異性脂肪酶，尤其是來(lái)源于Rhizomucormiehei和Thermomyceslanuginosus的固定化脂肪酶，應(yīng)用廣泛。表1總結(jié)2015—2019年該主題的研究進(jìn)展，更早的研究已經(jīng)在其它文獻(xiàn)中進(jìn)行了綜述[48-49]。

表1 2015—2019年酶法制備含ω-3多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的國(guó)際文獻(xiàn)匯總

產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度取決于所用脂肪酶的特異選擇性。例如，來(lái)源于Candida rugosa的脂肪酶由于具有脂肪酸特異性而不適合催化富含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的酸解反應(yīng)制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)[50-51]。研究表明，Candida rugosa脂肪酶不僅能特異識(shí)別甘油三酯的脂肪酸，而且可以識(shí)別整個(gè)甘油三酯分子[52-53]。Candida rugosa脂肪酶催化的水解反應(yīng)分為兩步：不含DHA的甘油三酯分子首先被水解，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，含有DHA的甘油三酯分子也被水解。由于甘油三酯的酸解反應(yīng)是連續(xù)的水解與酯化反應(yīng)，因此，Candida rugosa脂肪酶催化的富含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的酸解反應(yīng)產(chǎn)率較低。此外，脂肪酶的位置特異性對(duì)結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的產(chǎn)量和純度也有影響。與不具有位置特異性的Candida antarctica脂肪酶B和Psueodomonassp.脂肪酶相比，sn-1，3位置特異性Rhizomucormiehei脂肪酶在催化月桂酸和海豹油酸解制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中最為有效[54]。

含ω-3多不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的氧化穩(wěn)定性是一個(gè)有待解決的主要問(wèn)題[55]。近年來(lái)，富含多不飽和脂肪酸油脂體系中乳液模板化油凝膠的氧化穩(wěn)定性引起了科研人員的關(guān)注。為了提高富含ω-3多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的氧化穩(wěn)定性，進(jìn)行了油凝膠微膠囊的研究。以β-谷甾醇/γ-谷維素的植物甾醇混合物或蔗糖硬脂酸酯/抗壞血酸棕櫚酸酯的混合物作為油凝膠劑，以鯡魚(yú)魚(yú)油或鯡魚(yú)魚(yú)油與辛酸和/或硬脂酸制得的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)作為脂質(zhì)相制備了油凝膠。結(jié)果顯示，油凝膠及其微膠囊改善了脂質(zhì)的氧化穩(wěn)定性[56]。之前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，即內(nèi)部結(jié)構(gòu)（油凝膠）和外部涂層（微膠囊）都提高了油脂氧化穩(wěn)定性，原因是它們都對(duì)油脂進(jìn)行了氧暴露的防護(hù)，而氧暴露是導(dǎo)致脂質(zhì)氧化的主要因素[57]。研究表明，與液態(tài)油相比，由茶多酚棕櫚酸酯顆粒和柑橘果膠構(gòu)成的茶油（富含油酸）凝膠具有更高的氧化穩(wěn)定性，這可能是茶多酚棕櫚酸酯及其形成的凝膠都具有抗氧化功能的結(jié)果[58]。

3 酯交換法制備富含ω-3多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)

將ω-3多不飽和脂肪酸引入到長(zhǎng)碳鏈脂肪酸油脂中，可以改善其營(yíng)養(yǎng)特性。此類脂質(zhì)的典型案例就是母乳脂替代品（human milk fat substitutes，HMFS）。母乳脂成分獨(dú)特，其sn-2位置主要是棕櫚酸（約占sn-2脂肪酸總量的60%）。研究表明，在母乳脂中，sn-2位置大量的棕櫚酸能提高嬰兒對(duì)脂肪和鈣的吸收，并防止鈣皂的形成。嬰兒期和幼兒期的大腦發(fā)育需要飲食中含有充足和均衡的ω-3多不飽和脂肪酸，其中，DHA對(duì)嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育尤為重要。多項(xiàng)研究表明，血液DHA水平與認(rèn)知和視覺(jué)功能的提升呈正相關(guān)，這種影響一直持續(xù)到幼兒時(shí)期[59]。嬰兒出生后，母乳是嬰兒ω-3多不飽和脂肪酸的唯一來(lái)源，其含量取決于母親的飲食。如果母親患有ω-3多不飽和脂肪酸缺乏癥和/或無(wú)法進(jìn)行母乳喂養(yǎng)，則應(yīng)通過(guò)配方奶粉補(bǔ)充ω-3多不飽和脂肪酸。制備母乳脂替代品最常用的方法是用三棕櫚酸甘油酯或sn-2位富含棕櫚酸的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)與各種來(lái)源的游離脂肪酸進(jìn)行酸解反應(yīng)。除純油酸外，還使用了從不同植物油（如橄欖油、榛子油、葵花籽油、大豆油、紅花油、菜籽油、魚(yú)油或微生物油脂）中獲得的可以作為ω-3多不飽和脂肪酸（主要是DHA和AA）來(lái)源的其它游離脂肪酸[60-61]。當(dāng)前的研究熱點(diǎn)聚焦于DHA和ARA在母乳脂替代品甘油三酯特定位點(diǎn)的引入，因此，篩選能夠催化制備具有特定功能結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的脂肪酶的研究大幅增加[62-63]。

除了母乳脂替代品外，其他食用油也經(jīng)過(guò)酶催化，引入ω-3多不飽和脂肪酸以提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。2001—2009年期間的研究主要有三油酸甘油酯[64-65]、榛子油[66]、橄欖油[67]、大豆油[68]和棕櫚油[69-70]與ω-3多不飽和脂肪酸的酸解反應(yīng)，鯡魚(yú)魚(yú)油與松脂酸[71]、雞肉脂肪游離脂肪酸[72]和共軛亞油酸[73]的酸解反應(yīng)，富含DHA的2-MAG與油酸的酯化反應(yīng)[74]，棕櫚仁油[75]與棕櫚油硬脂、硬脂酸乙酯（EE是乙酯的縮寫(xiě)，硬脂酸乙酯縮寫(xiě)應(yīng)該是SAEE）[76]與富含ω-3多不飽和脂肪酸甘油三酯的酯交換反應(yīng)。

4 酶法制備ω-3多不飽和脂肪酸濃縮液

濃縮液可提供更高濃度的ω-3多不飽和脂肪酸，同時(shí)減少飽和與單不飽和脂肪酸、以及總脂肪的攝入量。此外，魚(yú)類消費(fèi)負(fù)面影響的主要關(guān)注點(diǎn)[77]為汞含量，商品魚(yú)油膠囊的汞含量從未檢出，可以忽略不記[78]。

ω-3多不飽和脂肪酸的主要濃縮方法有色譜分離、分餾或分子蒸餾、低溫結(jié)晶、超臨界流體萃取和尿素絡(luò)合法等。酶法與上述方法相比有許多優(yōu)點(diǎn)。酶法不涉及極端pH值和溫度，從而避免因氧化、順?lè)串悩?gòu)化或雙鍵遷移而部分破壞ω-3多不飽和脂肪酸的天然全順式結(jié)構(gòu)。同時(shí)，溫和的反應(yīng)條件也降低了工藝成本。酶法的特征之一是，由于脂肪酶的底物和位置特異性，其產(chǎn)物也是定向可控的。

脂肪酶催化水解、醇解和酯化反應(yīng)均可用于制備ω-3多不飽和脂肪酸濃縮液。2015—2019年脂肪酶催化水解制備ω-3多不飽和脂肪酸濃縮液的國(guó)際研究情況見(jiàn)表2。水解反應(yīng)的底物是脂質(zhì)和水，方法簡(jiǎn)單且環(huán)境友好。水解反應(yīng)的產(chǎn)物可以簡(jiǎn)單地通過(guò)沉降或離心進(jìn)行分離。反應(yīng)通常在攪拌反應(yīng)釜中進(jìn)行，由于是間歇工藝，無(wú)法實(shí)現(xiàn)在線去除副產(chǎn)物（游離脂肪酸），而游離脂肪酸的積累會(huì)促使水解反應(yīng)速率逐漸降低?？梢酝ㄟ^(guò)皂化或蒸餾的方式從產(chǎn)物中脫除游離脂肪酸。

表2 2015-2019年脂肪酶催化水解制備ω-3多不飽和脂肪酸濃縮液的國(guó)際文獻(xiàn)匯總

在富含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的醇解反應(yīng)中，乙醇是首選。與水解反應(yīng)相比，在不含水的無(wú)溶劑環(huán)境中進(jìn)行的濃縮ω-3多不飽和脂肪酸的醇解反應(yīng)大大減小了設(shè)備體積，并且可以應(yīng)用于填充床反應(yīng)器等連續(xù)工藝。此外，與水解反應(yīng)相比，基質(zhì)混合得更加均勻，并且通過(guò)蒸餾更容易從油相中分離脂肪酸乙酯。近幾年的研究表明，乙醇解工藝已應(yīng)用于生產(chǎn)富含ω-3多不飽和脂肪酸的偏甘油酯[87-88]和乙酯[89-90]。富含ω-3多不飽和脂肪酸的乙酯可作為藥物制劑使用。從營(yíng)養(yǎng)角度來(lái)看，偏甘油酯比乙酯更適合作為乙醇解反應(yīng)的最終產(chǎn)物，因?yàn)槠视王ゾ哂懈玫纳锢寐蔥91]。此外，偏甘油酯作為“天然”產(chǎn)品被推廣。

在醇解反應(yīng)中，可用甘油代替乙醇，以生產(chǎn)富含ω-3多不飽和脂肪酸的偏甘油酯。甘油解反應(yīng)可以產(chǎn)生不同的甘油酯，且沒(méi)有脂肪酸損失，之后可以從反應(yīng)混合物中提取目標(biāo)脂質(zhì)。近5年的研究表明，作為有前景的食品組分，具有高ω-3多不飽和脂肪酸含量的甘油二酯（Diacylglycerols，DAG）[92-93]和甘油一酯（monoacylglycerols，MAG）[93-95]可以由脂肪酶催化甘油解反應(yīng)來(lái)制備。甘油酯混合物也可以通過(guò)相同的酶法制備[96]，脂肪酸形式的ω-3多不飽和脂肪酸與甘油直接酯化可用于制備富含ω-3多不飽和脂肪酸的甘油酯[97-98]。Halldorsson[99]等通過(guò)甘油選擇性酯化將EPA和DHA分離，因?yàn)镋PA與甘油反應(yīng)的同時(shí)DHA仍處于游離脂肪酸混合物中。

5 ω-3多不飽和脂肪酸磷脂

富含ω-3多不飽和脂肪酸磷脂（phospholipids，PL）的制備受到了關(guān)注，因?yàn)榇祟惲字瑩碛谐硕嗖伙柡椭舅岜旧砉δ芤酝獾男鹿δ躘100]。位于磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）sn-2位置的DHA具有更強(qiáng)的細(xì)胞通透性、抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性。另一方面，含有EPA的磷脂可以降低大鼠脂肪組織的重量。催化制備磷脂的酶主要有脂肪酶和磷脂酶。磷脂sn-1位脂肪酸的改性可由磷脂的酸解或酯交換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。磷脂酶A1（Phospholipase A1，PLA1）催化卵磷脂與EPA、DPA和DHA混合物的酸解反應(yīng)生成富含多不飽和脂肪酸的卵磷脂，其中35%的脂肪酸為多不飽和脂肪酸[101]。加水可以降低多不飽和脂肪酸的引入量，盡管結(jié)果尚未正式報(bào)道，但體系中的水預(yù)計(jì)會(huì)降低產(chǎn)物得率。即使不加水，水解反應(yīng)也不可避免，產(chǎn)物中溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）的含量為13.7%。不同作者的相似研究得到了同樣的結(jié)果[102]。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)6 h時(shí)，酸解使多不飽和脂肪酸在磷脂酰膽堿中的含量增加，在24 h內(nèi)從21%增加到28%，但水解程度的增加導(dǎo)致了磷脂酰膽堿產(chǎn)率顯著降低。考慮到磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿水平以及多不飽和脂肪酸的引入，確定了固定化磷脂酶A1催化磷脂酰膽堿酸解反應(yīng)的最佳水活度為0.65[103]。除了磷脂酶A1，脂肪酶也可以用于制備富含多不飽和脂肪酸的磷脂。EPA和DHA與溶血磷脂可在脂肪酶的催化下發(fā)生區(qū)域選擇性酯化反應(yīng)制備磷脂酰膽堿，產(chǎn)率達(dá)30%以上[104]。固定化Candida antarctica脂肪酶B是引入DHA的唯一有效酶，而EPA則可以通過(guò)固定化Candida antarctica脂肪酶B或者固定化Rhizopusarrhizus脂肪酶引入。Peng[105]等比較了脂肪酶催化酸解反應(yīng)將不同脂肪酸引入大豆磷脂的結(jié)合率。共軛亞油酸和辛酸的結(jié)合率相似，但EPA和DHA的結(jié)合率相對(duì)較低。

2016年，Li等[106]通過(guò)固定化磷脂酶A1在無(wú)溶劑體系中催化磷脂酰膽堿與富含DHA/EPA的乙酯進(jìn)行酯交換反應(yīng)，成功合成了富含DHA/EPA的磷脂酰膽堿。在溫度55.7 ℃，加水量1.1wt%，底物質(zhì)量比（乙酯/磷脂酰膽堿）6.8∶1的條件下，最大結(jié)合率為19.09%（24 h）。當(dāng)加水量大于0.5wt%時(shí)，固定化磷脂酶A1的活性更高。24 h的真空處理顯著增加了DHA/EPA的結(jié)合率和富含DHA/EPA磷脂酰膽堿的含量，72 h DHA/EPA的結(jié)合率最高（30.31%），富含DHA/EPA磷脂酰膽堿的產(chǎn)率為47.2%[106]。2019年，Wang等[107]研究表明，固定化來(lái)源于海洋Streptomyces sp.菌株W007的脂肪酶（MAS1）可在無(wú)溶劑體系中催化富含ω-3多不飽和脂肪酸的乙酯與磷脂酰膽堿進(jìn)行酯交換反應(yīng)。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，24 h內(nèi)，ω-3多不飽和脂肪酸最大結(jié)合率為33.5%，表面固定化MAS1脂肪酶是一種具有較高催化活性的磷脂改性生物催化劑[107]。磷脂酶A2（PLA2）專一催化多不飽和脂肪酸酯化至磷脂的sn-2位。磷脂酶A2催化磷脂酰膽堿與EPA乙酯在多種有機(jī)溶劑中進(jìn)行酯交換反應(yīng)[108]，甲苯中EPA的結(jié)合率最高，水通過(guò)可逆水解反應(yīng)形成溶血磷脂酰膽堿而影響反應(yīng)的產(chǎn)率，含EPA磷脂酰膽堿的最高產(chǎn)率為14.3%。

6 結(jié)語(yǔ)

ω-3多不飽和脂肪酸對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其對(duì)加工條件的敏感性，引起了人們對(duì)溫和加工技術(shù)如酶催化工藝的高度關(guān)注。對(duì)于魚(yú)油或任何其它油脂中ω-3多不飽和脂肪酸的富集，無(wú)論水解、酸解、醇解、酯交換還是酯化反應(yīng)，所有酶促反應(yīng)均可在室溫、常壓和氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。因此，與傳統(tǒng)方法相比，脂肪酶催化魚(yú)油制備長(zhǎng)碳鏈ω-3多不飽和脂肪酸的將更安全、高效。