他汀類藥物代謝相關ApoE基因多態(tài)性與冠狀動脈介入術后再狹窄的相關性研究

范春煜，蘇昊，付強，蘇琦，夏霏，劉海濤

經皮冠狀動脈介入治療（PCI）是目前臨床上最重要的血運重建的一線治療方案，大大降低了冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊叩乃劳雎蔥1]，尤其是近幾年藥物涂層支架的廣泛使用，更是將術后再狹窄率控制在10%以內[2]，但術后支架內再狹窄（ISR）仍然是影響患者長期預后最關鍵的因素。因此，盡早預測PCI后ISR，并在術前積極輔以阿司匹林和氯吡格雷雙聯抗血小板藥物，以及強化他汀類降血脂藥物對于預防PCI圍手術期不良心血管事件的發(fā)生尤為重要。目前普遍認為，高膽固醇血癥是PCI后再狹窄的主要危險因素之一[3]。因此，從遺傳學角度尋找血脂代謝相關基因對于解釋PCI后發(fā)生ISR個體差異性提供了新的思路[4]。載脂蛋白E（ApoE）基因是調節(jié)血脂代謝的關鍵基因，其含有三個等位基因（ε2、ε3和ε4）和六種表型（ε2/2、ε3/3、ε4/4和ε2/3、ε2/4、ε3/4）[5]，但是，目前鮮少見有研究討論ApoE基因多態(tài)性與ISR發(fā)生的相關性。因此，筆者在漢族人群中進行了大樣本ApoE基因多態(tài)性研究，所有患者在首次入院時均進行他汀類藥物代謝相關基因檢測，分析PCI后患者再狹窄與ApoE基因多態(tài)性的關系，為PCI患者優(yōu)化他汀類藥物降脂治療提供一定的臨床依據?，F研究報告如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究選取2016年1月至2018年5月期間于遼寧省人民醫(yī)院心血管內科行PCI的615例患者為研究對象，其中男性429例，女性186例，年齡42～80歲，平均年齡（61.78±8.45）歲。入選標準：①在本地居住20年以上的漢族患者；②由2位介入專家進行冠狀動脈（冠脈）造影，所有患者均確診為急性冠脈綜合征（ACS），包括ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛；③行PCI的標準均為血管狹窄≥75%；④PCI前規(guī)范服用阿司匹林和氯吡格雷抗血小板藥物；⑤既往未接受過PCI治療；⑥所有患者均完成ApoE基因測序；⑦獲得患者及家屬對本項研究的知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①不符合上述納入標準的患者；②患者在治療前出現嚴重的意識障礙、心力衰竭、伴有嚴重的肝腎功能不全、惡性腫瘤、血液系統疾病、急慢性感染或伴有嚴重出血傾向者；③預計生存時間≤1年者；④相互間有血緣關系者；⑤精神障礙不能合作者、依從性差者、失訪者、自愿退出研究者等。本項研究獲本院倫理委員會批準。

1.2 方法 收集患者的一般臨床資料：包括年齡、性別、體質指數（BMI）、心率（HR）、平均收縮壓（SBP）、平均舒張壓（DBP）、疾病史、吸煙史等。所有患者視自身病情給予抗血小板藥物（阿司匹林和氯吡格雷）、硝酸酯類藥物、降壓藥物等常規(guī)治療。并于入院開始服用阿托伐他汀鈣（商品名立普妥，上海輝瑞制藥有限公司生產，10 mg/片）20 mg，1/d，睡前口服。持續(xù)治療12個月。

1.2.1 實驗分組 所有患者完成PCI術后隨訪1年，復查冠脈造影，根據國際Mehran標準[6]，判斷是否出現ISR。若支架內或支架兩端5 mm內的血管內徑狹窄≥50%，則判定為ISR。將所有患者分為ISR組和非ISR組，其中72例復查冠脈造影后確診為ISR，即為ISR組。其余543例為非ISR組。ISR組中男性44例，女性28例，年齡44～80歲，平均年齡（62.86±8.79）歲；非ISR組中男性385例，女性158例，年齡42～80歲，平均年齡（61.18±7.52）歲。

1.2.2 血液樣本采集 采集所有受試者清晨空腹時的外周靜脈血5 ml，其中1 ml置于含有依地酸二鈉（EDTA-Na）抗凝劑的采血管中，用于檢測生化指標；其余血液樣本于-70℃低溫保存，用于進行DNA提取。

1.2.3 血常規(guī)檢查 采用SYSMEX XS-800i全自動血液生化分析儀（日本希森美康公司）檢測血生化指標。嚴格按照儀器操作手冊進行操作，所有檢測在2 h內完成。包括三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），另外采用口服葡萄糖耐量試驗檢測空腹血糖值（FPG）。采用糖化血紅蛋白儀（美國Bia-rad 公司）測定糖化血紅蛋白（HbA1c）。

表1 兩組患者一般情況比較（n，%）

1.2.4 基因多態(tài)性檢測方法 ①采用Primer Express軟件（美國Applied Biosystems公司）設計引物和探針，由上海生工生物工程有限公司合成并提供。②外周血白細胞DNA提?。翰捎没蚪MDNA小量抽提試劑盒（由北京天根生物技術有限公司提供）。具體提取方法參照說明書進行。采用紫外分光光度法測定DNA質量和濃度。③進行PCR-RELP：取8 μl PCR擴增產物，加入2 μl 10×Buffer和1 μl特異性限制性內切酶（購自大連寶生生物工程有限公司），然后加入9 μl去離子水，于37℃反應12～14 h。④將PCR產物進行電泳檢測。⑤基因測序：將50 μl測序樣品送至上海生工生物工程有限公司進行純化測序；選擇ApoE基因的兩個脆性位點，即112位半胱氨酸TGC和158位精氨酸CGC。進行大批量擴增，電泳，酶切，確定基因型。根據魏法權等[7]學者提出的分類方法，將ApoE（*2，*4）各代謝表型分為三組，ApoE（*2）TT/ ApoE（*4）TT為他汀類藥物快代謝型，ApoE（*2）CC/ ApoE（*4）TT為正常代謝型，其余基因型為慢代謝型。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行處理分析。計量資料以均數±標準差（）表示，計量資料間兩組均數比較采用t檢驗。計數資料采用例數（構成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用多因素二元Logistic回歸分析計算優(yōu)勢比（OR）及其95%可信區(qū)間表示ISR的相對危險度。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床基線資料比較 隨訪1年后，將支架內或支架兩端5 mm內的血管內徑狹窄≥50%定義為ISR。ISR組患者血清LDL-C水平、糖尿病史及高脂血癥病史比例高于非ISR組患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組患者其他臨床資料和病理特征基本一致，未見統計學差異（P＞0.05）（表1）。

2.2 基因型分布 本項研究中，所有患者ApoE（*2，*4）位點基因型檢出率為100%。93例（15.1%）為快代謝型，482例（78.4%）為正常代謝型，40例（6.5%）為慢代謝型。ISR組有13例患者（18.1%）為慢代謝型，慢代謝型患者比例明顯高于非ISR組（5.0%）（P＜0.05）（表2）。

表1 患者的一般臨床資料、生化指標及病理特征分析[（），（n，%）]

表1 患者的一般臨床資料、生化指標及病理特征分析[（），（n，%）]

注：IRS：術后支架內再狹窄；BMI：體質指數；HR：心率；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；HbAlc：糖化血紅蛋白；FPG：空腹血糖；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

項目 IRS組（n=72）非IRS組（n=543）t/χ2值P值年齡/（歲） 62.86±8.79 61.18±7.52 1.745 0.082男性（n，%） 44（56.9） 385（71.5） 2.889 0.089 BMI（kg/m2） 23.11±0.72 22.98±0.68 1.514 0.131 HR（次/min） 70.15±9.13 68.32±9.04 1.612 0.107 SBP（mmHg） 145.18±15.33 140.91±18.02 1.920 0.055 DBP（mmHg） 95.21±7.46 93.85±6.41 1.658 0.098 HbAlc（%） 5.57±0.76 5.46±0.87 1.022 0.307 FPG（mmol/L） 6.19±1.24 6.14±1.17 0.338 0.735 TG（mmol/L） 1.92±0.41 1.87±0.35 1.115 0.265 TC（mmol/L） 4.60±1.43 4.41±1.28 1.167 0.244 HDL-C（mmol/L） 1.22±0.18 1.26±0.19 1.689 0.092 LDL-C（mmol/L） 2.79±0.73 2.61±0.61 2.296 0.022糖尿病史（n，%） 21（29.2） 103（19.0） 4.107 0.043高血壓史（n，%） 52（72.2） 347（63.9） 1.930 0.165高脂血癥史（n，%） 40（63.9） 235（43.3） 3.876 0.049吸煙史（n，%） 10（13.9）c 51（9.4) 1.439 0.230血管狹窄支數（n，%） 1.911 0.385單支 27（37.5） 205（37.8） - -雙支 29（40.3） 181（33.3） - -≥3支 16（22.2） 157（28.9） - -支架數量 1.78±0.64 1.65±0.60 1.714 0.087支架直徑（mm） 2.75±0.42 2.71±0.49 0.661 0.509術前狹窄程度（%） 84.90±5.17 83.75±5.36 1.718 0.086

2.3 代謝基因多態(tài)性與血脂變化的關系研究 所有患者服用阿托伐他汀鈣12 w后，復查血脂指標?？齑x型、正常代謝型和慢代謝型患者TG、TC和LDL-C較基線值均有不同程度的下降，而慢代謝型患者TC和LDL-C下降幅度最低，與其他兩組患者比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。而快代謝組患者TG、TC和LDL-C下降幅度與正常代謝組患者相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。三組患者HDL-C較基線值有所上升，但是三組之間差異無統計學意義（P＞0.05）（表3）。

2.4 基因型對再狹窄發(fā)生的影響 以ISR（無=0，有=1）作為因變量，基因型（快代謝型=1，正常代謝型=2，慢代謝型=3）作為自變量，以LDL-C（正常=0，異常=1）、糖尿病史（無=0，有=1）、高脂血癥史（無=0，有=1）、支架直徑（＜3 mm=0，≥3 mm=1）為協變量，進行二分類Logistic回歸分析，探討基因表型對再狹窄發(fā)生的影響。將慢代謝型為參考標準，快代謝為基因表型（1），正常代謝型為基因表型（2）。結果顯示，快代謝型的患者發(fā)生再狹窄的危險性是慢代謝型的0.142倍，正常代謝型的患者發(fā)生再狹窄的危險性是慢代謝型的0.214倍。即相對于慢代謝型來說，快代謝型和正常代謝型可能是再狹窄發(fā)生的獨立保護因素，且快代謝型的危險性低于正常代謝型。同樣，LDL-C、糖尿病史、高脂血癥史、支架直徑都可能是支架內再狹窄發(fā)生的獨立影響因素（表4）。

表2 受試對象的等位基因和基因型分布（n，%）

表3 不同代謝型患者血脂水平較基線值變化

表3 不同代謝型患者血脂水平較基線值變化

注：TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；與快代謝組比較，aP＜0.05；與正常代謝組比較，bP＜0.05

項目 快代謝（n=93）正常代謝（n=482）慢代謝（n=40）F值 P值TG（mmol/L） -0.31±0.24 -0.31±0.27 -0.29±0.26 0.11 0.899 TC（mmol/L） -1.87±0.49 -1.82±0.47 -1.38±0.37ab 21.22 0.000 HDL-C（mmol/L） 0.14±0.20 0.11±0.19 0.10±0.16 1.09 0.337 LDL-C（mmol/L） -1.48±0.17 -1.45±0.15 -1.19±0.20ab 54.80 0.000

表4 二分類Logistic回歸分析結果

3 討論

冠心病死亡率和致殘率較高，病因復雜，給患者家庭增加了極大的經濟負擔。而急性冠脈綜合征是導致冠心病患者死亡的重要原因之一，與冠脈不穩(wěn)定斑塊破裂迅速形成血栓密切相關[8]。斑塊一旦破裂，血小板迅速聚集并大量黏附纖維蛋白形成血栓[9]。目前對于ACS患者的治療，首先需盡快恢復冠脈血流灌注，除常規(guī)藥物治療外，PCI已成為冠心病領域干預不穩(wěn)定斑塊最主要的措施之一[10]。近幾年，隨著醫(yī)療水平的飛速發(fā)展，PCI的適應癥越來越廣泛，尤其是藥物洗脫支架和生物可吸收支架的出現，進一步改善了患者預后，但是依舊無法從根本上逆轉心肌缺血性損傷，部分患者仍可能發(fā)生支架內再狹窄。因此早預測、早干預對于改善患者PCI的預后具有重要的臨床價值。

目前，關于ISR形成機制尚不明確，Hey等[11]學者認為支架內血栓形成是導致ISR的重要因素。因此，研究支架內血栓形成的相關因素對于減少支架再狹窄的發(fā)生風險具有積極的意義。除已發(fā)現的一些炎性分子以外，從遺傳學角度分析ISR發(fā)生的個體差異性成為近幾年醫(yī)學界探討的熱點。血脂代謝異常，特別是血清TC、LDL-C水平升高與支架內血栓形成密切相關[12]。因此，血脂管理是PCI后防止ISR發(fā)生的重要措施。他汀類藥物屬于羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，可明顯降低外周血TC和LDL-C水平，是PCI前廣泛使用的調脂藥物之一[13]，因此，患者對于他汀類藥物的反應性是否良好是影響ISR的發(fā)生風險的重要環(huán)節(jié)。早在上個世紀末，就有學者提出，ApoE基因多態(tài)性與血脂代謝密切相關[14]，但是直到近兩年，才逐漸有研究證實，ApoE基因是參與他汀類藥物代謝的關鍵基因，并且與調控外周血TC和LDL-C水平有關。Liang等[15]觀察ApoE不同等位基因攜帶者的血脂水平，發(fā)現存在差異，推測ApoE可能是影響血脂水平的關鍵基因。Wu等[16]則選取了85歲以上的人群進行觀察研究，研究發(fā)現，ApoE基因多態(tài)性對心腦血管事件的發(fā)生有影響。根據氨基酸的不同，ApoE基因可分為ApoE2、ApoE3、ApoE4三個亞型，雖然每個亞型之間僅僅存在一個氨基酸的差異，但是功能卻相差甚遠。其中ε3等位基因的分布頻率最高，而ε2和ε4卻屬于脆性位點，與血脂代謝密切相關。ε2和ε4屬于功能相反的等位基因，ε2可明顯降低TC水平，而ε4與高TC、高HDL-C水平有關，可抑制血栓的形成[17]。

本項研究共納入了資料完整的615例患者作為受試對象，所有患者均因急性冠脈綜合征接受PCI。隨訪1年后，根據冠脈造影結果，將患者分為ISR組和非ISR組。其中ISR組慢代謝型患者比例高于非ISR組，而慢代謝型患者服用阿托伐他汀治療3個月后，血清TC和LDL-C下降幅度較快代謝型和正常代謝型患者低，其發(fā)生原因目前尚未有明確解釋，據推測，可能與不同的ApoE 基因亞型與脂蛋白受體的結合能力存在差異有關。魏法權等[7]學者曾明確證實，ApoE基因多態(tài)性與他汀類藥物的治療效果密切相關，尤其是ε2等位基因攜帶者預后更佳。并且通過藥物分層分析發(fā)現，口服等劑量阿托伐他汀后，ε2等位基因攜帶者LDL-C和TC水平降低更為明顯。但是，國外有學者卻發(fā)現，ε4等位基因和ε2等位基因對血脂水平的影響正好相反[18]，且ApoE4基因與脂蛋白受體的結合能力相對更高[19]。ε2等位基因攜帶者的TC、LDL-C最低，ε4等位基因攜帶者TC、LDL-C最高。從機制方面分析，可能是由于ApoE4優(yōu)先與極低密度脂蛋白受體結合，這與N端112位的Cys-Arg的置換有關；可使血清中極低密度脂蛋白水平降低，反饋性調節(jié)LDL受體數目，減緩LDL-C分解代謝，促使血清LDL-C水平升高；而ApoE2優(yōu)先與HDL受體結合，促使膽固醇清除，從而降低血清TC水平[20]。因此，本項研究初步得出的結論為快代謝型患者PCI后再狹窄發(fā)生率最低，而慢代謝型患者PCI后再狹窄發(fā)生率最高。通過多因素二分類Logistic回歸分析結果顯示，相對于慢代謝型來說，快代謝型和正常代謝型可能是再狹窄發(fā)生的獨立保護因素，且快代謝型的危險性低于正常代謝型。

綜上所述，對于服用他汀類藥物治療的PCI患者，其他汀類藥物代謝相關基因多態(tài)性與患者術后發(fā)生支架內再狹窄的風險密切相關，通過常規(guī)檢測ApoE基因分型，進而調整用藥方案（如加大用藥量，換用其他類型調血脂藥物）有可能改善預后，減少支架內再狹窄的發(fā)生。