MiRNA-146a與不穩(wěn)定型心絞痛冠狀動(dòng)脈病變程度的相關(guān)研究

張琳赟，薛同能，何雅文，李斌斌，朱紅，潘德鋒

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┦切难芟到y(tǒng)最常見(jiàn)的致死原因，其高死亡率及高致殘率嚴(yán)重影響人們的生活。不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）是冠心病中不可忽視的一部分，其主要機(jī)制是炎癥反應(yīng)、血管痙攣、不穩(wěn)定斑塊破裂、血小板活化和血管內(nèi)皮損傷等。UAP冠狀動(dòng)脈（冠脈）病變多，臨床預(yù)后差，探討其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及尋求更敏感的標(biāo)記物已成為目前研究的熱點(diǎn)之一[1]。

血清微RNAs（miRNAs）是一類(lèi)短的非編碼RNA，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。大量證據(jù)[2]表明，miRNA通過(guò)控制內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等主要細(xì)胞參與者的功能來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA序列中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）或它們的結(jié)合位點(diǎn)可能影響miRNA介導(dǎo)的調(diào)控，從而影響多種疾病如冠心病等的發(fā)生和發(fā)展。

miR-146（包括miRNA-146a和miR-146b）是較早被研究的有關(guān)炎癥反應(yīng)的miRNA之一，在自身免疫疾病和腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[4,5]。目前有學(xué)者報(bào)道，miRNA-146a介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也參與了冠心病的發(fā)生發(fā)展。Oerleman等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在急性冠脈綜合征中，miRNA-146a表達(dá)水平明顯增高，表明miRNA-146a介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與急性冠脈綜合征的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究觀察了正常人群與UAP患者血液中miRNA-146a基因多態(tài)性的分布情況，并評(píng)估UAP患者miRNA-146a表達(dá)水平與冠脈Gensini評(píng)分的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 入選于2018年6月至12月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科就診確診為UAP的患者100例（UAP組），入選標(biāo)準(zhǔn)[7]：在至少一個(gè)主要血管或其主要分支中冠脈狹窄≥50%，并伴有勞力性心絞痛加重或靜息時(shí)心絞痛的新發(fā)作，而無(wú)心電圖ST段抬高或心肌壞死的標(biāo)志物升高。所有入選患者均行冠脈造影評(píng)估冠脈病變嚴(yán)重程度。同期納入行經(jīng)冠脈造影檢查結(jié)果正常的100例患者作為正常對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肌酶升高、肺動(dòng)脈高壓、嚴(yán)重肺心病、急慢性感染性疾病、嚴(yán)重瓣膜病、先天性心臟病、重度心功能不全、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、結(jié)締組織或自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、近期有外傷史及既往行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）、冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)（CABG）史的患者。

1.2 臨床資料采集 收集受試者的年齡、高血壓、糖尿病、身高、體重、吸煙史等一般資料。并記錄患者入院時(shí)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白A（apoA）、載脂蛋白B（apoB）、脂蛋白a[LP（a）]等指標(biāo)。

1.3 冠脈病變嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)方法 采用Gensini 評(píng)分系統(tǒng)[8]評(píng)估UAP患者冠脈病變嚴(yán)重程度。根據(jù)美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)（AHA）規(guī)定的冠脈血管圖像分段評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每支冠脈血管狹窄程度進(jìn)行定量評(píng)分[9]。

具體標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)任何異常發(fā)現(xiàn)為0分；狹窄＜25%為1分；25%～49%為2分；50%～74%為4分；75%～89%為8分；90%～99%為16分；完全閉塞為32分。不同節(jié)段冠脈評(píng)分系數(shù)為：左主干×5.0；前降支近段×2.5，中段×1.5，遠(yuǎn)段×1.0；回旋支近段×2.5，中段、遠(yuǎn)段均×1.0；右冠近段、中段及遠(yuǎn)段均×1.0；小分支×0.5。每例患者冠脈病變程度的最終積分為各支積分相加之和。

1.4 分組 UAP患者根據(jù)各自的Gensini評(píng)分，從小到大排列，按四分位數(shù)法，分為4個(gè)亞組：Q1組（Gensini評(píng)分＜19.75）、Q2組（Gensini評(píng)分＜32.5）、Q3組（Gensini評(píng)分＜46.5）、Q4組（Gensini評(píng)分＞46.5）。

1.5 樣本采集及處理方法 所有入選患者在入院禁食過(guò)夜后收集血樣標(biāo)本送檢常規(guī)生化、血常規(guī)等，且每個(gè)受試者另抽取4 ml靜脈血樣，分別裝入2個(gè)含有EDTA抗凝管中。從1管血液樣品中吸取1 ml全血血漿至單獨(dú)的無(wú)DNA酶/RNA酶凍存管中，加入1 ml紅細(xì)胞裂解劑充分混勻并靜置5 min，放入高速冷凍離心機(jī)中以12 000 r/min離心1 min，棄上層清液后，再加入1 ml TRIzol RNA提取劑使樣本沉淀重懸，并儲(chǔ)存于-80℃冰箱中凍存，用于檢測(cè)miRNA-146a的表達(dá)量。另一管血液樣品貯存在-20℃用于DNA提取，檢測(cè)rs2910164的基因型。

基因多態(tài)性分析：采用快速裂解法提取基因組DNA。在 PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×PCR Mix 25 μl；上游引物（10 μM）1 μl；下游引物（10 μM）1 μl；模板DNA 2 μl；補(bǔ)水至50 μl，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min，然后以94℃變性30 s，55℃退火50 s，72℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和延伸反應(yīng)后，進(jìn)行SNP分型。

RNA提取及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：應(yīng)用 RnaExTM Total RNA Isolation Solution提取總 RNA，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（KR118，天根生化）。RT-PCR中，選擇hsa-miRNA-146a-5p行定量PCR。采用比較閾值周期法（Ct）評(píng)價(jià)表達(dá)的相對(duì)變化，miRNA-146a的倍數(shù)變化計(jì)算采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分?jǐn)?shù)）形式，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用（）形式表示，兩組之間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不滿足方差齊性的采用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney檢驗(yàn)法并進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料 UAP組在年齡、高密度脂蛋白、apoA、LP（a）、體質(zhì)指數(shù)（BMI）上明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相比于正常人群組，UAP組在高血壓、糖尿病和吸煙上占更高的比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。入院血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示LDL、TG、TC、apoB、WBC、CRP在兩組中差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 研究人群的基線資料

表1 研究人群的基線資料

注： UAP：不穩(wěn)定型心絞痛；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；apoA：載脂蛋白A；apoB：載脂蛋白B；LP（a）：脂蛋白a；BMI：體質(zhì)指數(shù)；CRP：C-反應(yīng)蛋白

項(xiàng)目 UAP組（n=100）正常對(duì)照組（n=100）F/χ2值P值年齡（歲） 65.17±10.38 53.65±12.91 6.912 ＜0.001 HDL-C（mmol/L） 1.10±0.26 1.24±0.30 3.527 ＜0.001 LDL-C（mmol/L） 2.69±0.99 2.81±0.78 0.952 0.342 TC（mmol/L） 4.29±1.21 4.59±0.95 1.950 0.0526 TG（mmol/L） 1.55±0.85 1.40±0.84 1.255 0.211白細(xì)胞計(jì)數(shù)（109/L） 6.19±1.64 5.93±1.76 1.081 0.281 apoA（g/L） 1.02±0.19 1.10±0.20 2.900 0.042 apoB（g/L） 0.87±0.26 0.88±0.20 0.356 0.761 LP（a）（mg/L） 283.17±241.66 222.92±173.01 2.027 0.044 BMI（kg/m2） 25.18±3.15 23.31±4.64 3.334 0.001 CRP（mg/L） 7.44±13.17 15.52±68.22 1.163 0.246高血壓（n，%） 58（58.0） 34（34.0） 10.648 0.001糖尿病（n，%） 29（29.0） 9（9.0） 11.728 0.001吸煙（n，%） 31（31.0） 11（11.0） 10.880 0.001

2.2 血液中miRNA-146a基因型在兩組人群中分布不同 本研究證實(shí)miRNA-146a基因型在2組人群中分布存在差異，UAP組患者中CC、GC、GG基因型為22、64、14例，占比為22%、64%、14%。而正常對(duì)照組CC、GC、GG基因型分別為20、52、28例，占比為20%、52%、28%。CC、CG和GG基因型在兩組人群中存在差異（P＜0.05），表明miRNA-146a rs2910164基因多態(tài)性在人群中分布有差異。將基因組合比較，與正常對(duì)照組相比，基因型CC+CG在UAP患者中表現(xiàn)出更高的頻數(shù)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)也說(shuō)明攜帶CG+CC基因型的人群比非攜帶者罹患不穩(wěn)定型心絞痛的風(fēng)險(xiǎn)高2.389倍（χ2=5.093，P=0.024，OR=2.389，95%CI：1.170～4.878）（表2）。

2.3 血液中miRNA-146a表達(dá)水平在兩組人群中的差異 采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)，miRNA-146a表達(dá)水平在UAP患者和正常人群中存在差異；UAP組中miRNA-146a表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（圖1），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z= 8.664，P＜0.001）。

表2 miRNA-146a基因型在人群中分布不同

2.4 UAP患者血液中miRNA-146a表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈病變狹窄嚴(yán)重程度的關(guān)系 為研究miRNA-146a表達(dá)水平在冠心病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的功能效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究UAP組患者血液中miRNA-146a表達(dá)水平與冠脈病變狹窄嚴(yán)重程度的相關(guān)性。根據(jù)Gensini評(píng)分以四分位法將UAP患者進(jìn)行分組，觀察各組患者miRNA-146a表達(dá)水平及Gensini評(píng)分的關(guān)系（表3）。隨著miRNA-146a表達(dá)水平的升高，Gensini評(píng)分也逐漸升高，其趨勢(shì)是顯著的（P=0.023）。結(jié)果說(shuō)明miRNA-146a的高表達(dá)水平與UAP患者冠脈病變狹窄的嚴(yán)重程度相關(guān)。

圖1 UAP組和正常對(duì)照組miRNA-146a表達(dá)水平的差異

表3 UAP患者血液中miRNA-146a表達(dá)水平與Gensini評(píng)分的關(guān)系

表3 UAP患者血液中miRNA-146a表達(dá)水平與Gensini評(píng)分的關(guān)系

3 討論

根據(jù)2018年《中國(guó)心血管病報(bào)告》[10]，我國(guó)心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，2016年心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病，冠心病死亡率自2012年以來(lái)持續(xù)增長(zhǎng)。冠心病的高死亡率及高致殘率，嚴(yán)重影響人們的生活。研究冠心病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找反映冠心病患者冠脈狹窄程度的新標(biāo)志物，是目前研究的熱點(diǎn)，對(duì)冠心病的診斷及治療有指導(dǎo)意義。

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病、腦梗死、外周血管疾病的主要原因，是一種慢性炎癥性血管疾病，特征是由脂肪豐富的斑塊生長(zhǎng)引起的血管狹窄。miRNAs是近年來(lái)在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種非編碼小RNA，其通過(guò)控制動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中主要細(xì)胞參與者（包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的功能來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。miRNAs廣泛參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后靶基因表達(dá)，參與多種疾病的生物學(xué)過(guò)程，越來(lái)越多的miRNAs，包括miRNA-181a，miRNA-30d，miRNA-126-5p，miRNA-221，miRNA-130a，miRNA-155，已顯示出作為心血管疾病生物標(biāo)志物的潛力[11-14]。miR-146 a是最早被發(fā)現(xiàn)的與炎癥反應(yīng)有關(guān)的miRNA之一，在自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。它位于LOC 285628基因的5q34上，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后形成非編碼小分子RNA：NR_132748.1[15]。成熟的miRNA-146a與靶基因mRNA結(jié)合，通過(guò)降低靶基因mRNA的表達(dá)和減少蛋白質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致目標(biāo)基因mRNA的降解或抑制其翻譯。目前已發(fā)現(xiàn)miRNA-146a與冠心病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但國(guó)內(nèi)較少關(guān)于miRNA-146a與冠心病患者冠脈狹窄嚴(yán)重程度相關(guān)性的報(bào)導(dǎo)。

本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-146a基因型與UAP易感性有關(guān)，CC、CG、GG基因型在兩組人群中有明顯差異，基因型CC+CG在組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miRNA-146a rs2910164多態(tài)性可能與UAP風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，攜帶GG+CC基因型的個(gè)體較GG攜帶者罹患UAP的風(fēng)險(xiǎn)增高。Bastami等[3]對(duì)伊朗300例冠心病患者進(jìn)行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-146a rs2910164基因多態(tài)性顯著地增加了冠心病的風(fēng)險(xiǎn)，攜帶C等位基因的人患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)很高。Xiong等[16]也發(fā)現(xiàn)攜帶CC、GC或GC+CC基因型的漢族受試者比攜帶GG基因型的受試者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)更高，這與我們的研究結(jié)果一致。但Ramkaran等[17]在年輕的南非印第安正常人和冠心病患者中，并未發(fā)現(xiàn)rs2910164基因型的頻率有明顯差異；Huang等[18]在研究miRNA-146a基因多態(tài)性對(duì)急性冠脈綜合征（ACS）風(fēng)險(xiǎn)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在722例ACS患者和721例正常人，rs2910164的CG基因型能降低罹患ACS的風(fēng)險(xiǎn)；Wang等[2]也未發(fā)現(xiàn)miRNA-146a rs2910164基因多態(tài)性與冠心病嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性。這些不一致的結(jié)果有可能與人群種族之間存在遺傳差異、不同研究之間樣本量上存在差異有關(guān)。

De Rosa等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CC+CG基因型更傾向于導(dǎo)致miRNA-146a高表達(dá)水平，miRNA-146a高表達(dá)水平促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，誘發(fā)炎癥反應(yīng)及導(dǎo)致了不穩(wěn)定斑塊的形成，加重了冠脈狹窄。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，UAP患者血液中miRNA-146a表達(dá)水平明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明miRNA-146a可能從易受損害的冠脈斑塊釋放到冠脈循環(huán)中，因此可能是一個(gè)可用于預(yù)測(cè)冠心病的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在UAP各組患者中miRNA-146a表達(dá)水平也存在明顯差異，隨著miRNA-146a表達(dá)水平升高，Gensini評(píng)分也逐漸升高，這與Quan等[20]研究結(jié)果一致，提示了由miRNA-146a介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與冠心病冠脈病變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)攜帶CC +GC基因型的人群罹患UAP的可能性更大，且UAP患者冠脈Gensini評(píng)分隨著血中miRNA-146a表達(dá)水平的升高而升高，miRNA-146a表達(dá)水平能反應(yīng)UAP患者冠脈狹窄嚴(yán)重程度，有望能成為新的生物標(biāo)記物，從而指導(dǎo)冠心病診治。