陶融型大曲培養(yǎng)貯存過(guò)程生化指標(biāo)變化規(guī)律及相關(guān)性研究

陳蒙恩，韓素娜，侯建光，李建民，陳偉平，李華，鄧杰，胡曉龍

1(河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南 三門(mén)峽，472400) 2(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢，643000) 3(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州，450002)

大曲是一種富含微生物菌群、菌系及復(fù)合曲香的微生態(tài)制品，具有糖化、發(fā)酵、生香等功能，是中國(guó)曲酒的主要糖化發(fā)酵劑和生香劑，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣會(huì)對(duì)白酒釀造過(guò)程中的出酒率、酒質(zhì)、風(fēng)格等造成直接影響[1-3]。優(yōu)質(zhì)大曲曲香味突出，功能微生物數(shù)量能達(dá)到曲酒工藝生產(chǎn)所需的數(shù)量級(jí)，且具有適宜的理化指標(biāo)。目前，對(duì)大曲的研究多趨向于某些特定指標(biāo)，如感官指標(biāo)、理化指標(biāo)以及微生物指標(biāo)等[4]，而對(duì)微生物與相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)性以及如何在制曲工藝中全面提升大曲品質(zhì)的研究較少。

陶融型大曲是在仰韶地區(qū)自然環(huán)境、生產(chǎn)原料、釀造工藝等因素的前提下，以小麥、大麥、豌豆為原料，經(jīng)自然接種、陶屋培養(yǎng)發(fā)酵而成的陶融型白酒專(zhuān)用大曲[5]。大曲中所富含的細(xì)菌、霉菌、酵母菌等是釀造陶融型白酒不可缺少的微生物資源，這些微生物能夠利用原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖代謝，分泌陶融型白酒釀造過(guò)程中所需的糖化酶、淀粉酶等各種酶系。釀酒原料中的淀粉等大分子物質(zhì)在生物酶和特定條件下，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)而產(chǎn)生種類(lèi)眾多的芳香類(lèi)物質(zhì)，這些芳香類(lèi)物質(zhì)對(duì)大曲酒特有香味成分起著重要貢獻(xiàn)作用[6-7]。本研究以陶融型白酒釀造專(zhuān)用大曲為樣本，對(duì)不同階段的大曲微生物指標(biāo)及理化指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)分析[8-9]，對(duì)大曲不同生化指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行研究，為制定陶融型大曲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，改良制曲工藝，提高優(yōu)質(zhì)曲率提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 樣品

樣品取自河南仰韶酒業(yè)有限公司制曲車(chē)間。

1.1.2 主要試劑

HCl、甲醛，洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4，成都市科龍化工試劑廠；酒石酸鉀鈉，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；NaOH、MgSO4·7H2O、Na2HPO4、無(wú)水乙醇、葡萄糖，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。以上各試劑均為分析純。干酪素(化學(xué)純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制

細(xì)菌培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，胰蛋白胨5，牛肉膏5，NaCl 5，納他霉素1，瓊脂粉12，pH 7.0；酵母培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，豆芽200，氨芐青霉素1，瓊脂粉12，pH 6.0；霉菌培養(yǎng)基(g/L)：去皮馬鈴薯200，葡萄糖20，蛋白胨0.5，KH2PO45，MgSO4·7H2O 3，VB10.1，瓊脂粉12，氨芐青霉素1，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-VS2型超凈工作臺(tái)，無(wú)錫易純凈化設(shè)備有限公司；DHP 9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱、MJ-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱、DHG-9123A型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；HYG-B型全溫?fù)u瓶柜，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LPZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠； HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取樣方法

選取河南仰韶酒業(yè)有限公司夏季同時(shí)入房的5房曲，安曲后在第1、3、5、7、9、15、30天取樣，大曲培養(yǎng)時(shí)間為30 d，將成品大曲放置于通風(fēng)、干燥、常溫環(huán)境中貯存，同時(shí)對(duì)貯存期60、90、120 d的5房曲進(jìn)行跟蹤取樣。每房大曲所選樣品事先用紅布條進(jìn)行標(biāo)記，在大曲翻曲、并房、打攏、貯存階段仍將其放入指定位置，以便樣品能代表整房曲；每房曲均采用四點(diǎn)中心法進(jìn)行取樣，樣品粉碎后過(guò)40目篩，四分法濃縮至150 g，裝于無(wú)菌袋內(nèi)，4 ℃貯存?zhèn)溆谩４笄囵B(yǎng)過(guò)程和貯存過(guò)程溫度的采集：將溫度計(jì)事先插入成型后大曲的曲心處，采用四點(diǎn)中心法測(cè)量大曲溫度。

1.3.2 水分、酸度測(cè)定

水分、酸度的測(cè)定方法參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[10-11]。水分含量及酸度分別按公式(1)、(2)計(jì)算：

(1)

式中：X，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/100 g；m1，烘干前稱(chēng)量瓶加試樣的質(zhì)量，g；m2，烘干后稱(chēng)量瓶加試樣的質(zhì)量，g；m，稱(chēng)量瓶的質(zhì)量，g。

(2)

式中：Y，酸度，mmol/10 g；c，NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mo1/L；V1，滴定試樣時(shí)，消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V0，空白試驗(yàn)時(shí)，消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；200，試樣稀釋體積，mL；20，取樣液進(jìn)行滴定的體積，mL。

1.3.3 氨態(tài)氮、還原糖、淀粉含量測(cè)定

通過(guò)NaOH滴定法對(duì)氨態(tài)氮含量進(jìn)行測(cè)定[12-13]；通過(guò)3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)比色法對(duì)大曲中還原糖含量進(jìn)行測(cè)定[14-15]；采用體積比1∶4的 HCl 進(jìn)行加熱回流水解，用斐林試劑測(cè)定生成的糖[16]。

1.3.4 糖化力、液化力測(cè)定

采用DNS法對(duì)大曲糖化力進(jìn)行測(cè)定，糖化酶活力定義：1 g大曲在35 ℃、pH 4.6條件下，1 h水解淀粉生成1 mg葡萄糖為1個(gè)糖化力單位，以U/g表示[16]。參照QB/T 4257—2011對(duì)大曲液化力進(jìn)行測(cè)定，液化酶活力定義：1 g大曲在35 ℃、pH 4.6條件下1 h能液化淀粉1g為1個(gè)液化力單位，以U/g表示[17-18]。

1.3.5 發(fā)酵力、酯化力測(cè)定

發(fā)酵力以1 g曲樣在25 ℃糖化液中發(fā)酵48 h失去的質(zhì)量(U/g)計(jì)算[19]；酯化力以1 g絕干曲在30 ℃條件下反應(yīng)72 h催化己酸和乙醇合成己酸乙酯質(zhì)量計(jì)算(U/g)[14]。

1.3.6 蛋白酶活力測(cè)定

蛋白酶酶活力測(cè)定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》[20]。酶活定義：1 g大曲在40 ℃，pH 3.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酸性蛋白酶活力單位，以U/g表示；1 g大曲在40 ℃，pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)中性蛋白酶活力單位，以U/g表示。

1.3.7 大曲微生物含量檢測(cè)

采用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法對(duì)不同大曲樣品的細(xì)菌、霉菌、酵母、芽孢的含量進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)粉碎后的樣品1 g溶于99 mL無(wú)菌生理鹽水中，搖床振蕩30 min使曲粉充分振蕩均勻。采用梯度稀釋法，將預(yù)培養(yǎng)樣品分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，吸取10-5梯度樣品200 μL涂布于霉菌培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后計(jì)數(shù)[25]；分別吸取10-7梯度樣品200 μL涂布于酵母和細(xì)菌培養(yǎng)基，酵母培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后計(jì)數(shù)[24-25]，細(xì)菌培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d后計(jì)數(shù)[21-22]；芽孢桿菌要先在80 ℃水浴30 min，對(duì)非芽孢桿菌進(jìn)行預(yù)處理，再選擇牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37 ℃下培養(yǎng)1～2 d后計(jì)數(shù)[23]。

1.3.8 理化指標(biāo)與微生物指標(biāo)相關(guān)性分析[9,26]

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件和Origin 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、繪圖和相關(guān)性分析，顯著性水平設(shè)定在5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)分析結(jié)果

對(duì)大曲培養(yǎng)及貯存過(guò)程中溫度、水分等理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖2。隨著安曲時(shí)間的增長(zhǎng)，氨態(tài)氮、酯化力呈上升趨勢(shì)，且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)其上升幅度逐漸減?。惶腔?、發(fā)酵力、蛋白酶活力呈先增后降趨勢(shì)，最后又略微上升直至恒定狀態(tài)；水分、淀粉含量隨時(shí)間的增長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì)，且遞減幅度逐漸減?。凰岫瘸氏壬蠼第厔?shì)。這主要是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，微生物數(shù)量快速增長(zhǎng)，致使氨態(tài)氮等指標(biāo)呈上升趨勢(shì)，隨著微生物繁殖代謝的持續(xù)進(jìn)行，大曲溫度急劇上升，低溫微生物大量死亡，糖化力等指標(biāo)快速下降；隨后一些耐熱芽孢桿菌大量繁殖，造成酸度等指標(biāo)的波動(dòng)性變化。

圖1 發(fā)酵時(shí)間與溫度的關(guān)系

由圖2可知，大曲培養(yǎng)結(jié)束出房時(shí)(30 d),酸度在0.3～1.5 mmol/10 g，水分含量<14%，貯存至120 d時(shí)糖化力仍在700 U/g以上，滿(mǎn)足我國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4259—2011對(duì)優(yōu)質(zhì)大曲理化指標(biāo)的要求。大曲的糖化力與溫度變化成一定的負(fù)相關(guān)性，在曲溫較低時(shí)酶活力較高，說(shuō)明大曲中淀粉酶主要靠低溫微生物產(chǎn)生，這與傳統(tǒng)研究結(jié)果相一致。蛋白酶活力呈先增后降再增趨勢(shì)，這與大曲培養(yǎng)過(guò)程中品溫變化有關(guān)。溫度過(guò)高使已形成的蛋白酶失活，在后期品溫降低過(guò)程中，部分產(chǎn)蛋白酶的微生物再次復(fù)活，致使最終蛋白酶活力達(dá)到一定高度。在120 d時(shí)，大曲蛋白酶活力仍保持在35 U/g左右，滿(mǎn)足優(yōu)質(zhì)大曲標(biāo)準(zhǔn)。蛋白酶能通過(guò)美拉德反應(yīng)，將大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)換為曲香形成的前體物質(zhì)[27]，因此，蛋白酶活力的高低往往決定了大曲風(fēng)味物質(zhì)的含量。

圖2 時(shí)間與理化指標(biāo)的關(guān)系

2.2 大曲培養(yǎng)及貯存過(guò)程微生物指標(biāo)變化

采用平板分離法對(duì)大曲微生物進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。入房前3 d，細(xì)菌、霉菌、酵母、芽孢數(shù)量都急劇增加,隨著發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)、曲溫升高，低溫微生物數(shù)量下降,曲溫升至50 ℃左右時(shí)，大部分真菌已死亡，耐高溫芽孢桿菌大量繁殖。細(xì)菌數(shù)量在5 d時(shí)處于最大值，可能此時(shí)品溫最適合高溫細(xì)菌生長(zhǎng)；5 d后細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始下降，可能是由于溫度過(guò)高，一些芽孢桿菌開(kāi)始進(jìn)入芽孢休眠狀態(tài)。大曲培養(yǎng)過(guò)程中酵母菌數(shù)量一直變化不大，可能是由于大曲入房溫度過(guò)高，且培養(yǎng)過(guò)程中升溫過(guò)快，超過(guò)了酵母菌生長(zhǎng)繁殖的最佳溫度所致。成品大曲入庫(kù)后，由于大曲水分較低，無(wú)法滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)代謝對(duì)水分的需求，致使各種微生物含量基本處于恒定狀態(tài)。從整個(gè)大曲微生物區(qū)系分析，在培菌期(0～10 d)，大曲微生物以細(xì)菌和霉菌為主；培菌期后以耐熱芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌和芽孢為主；成品大曲中，細(xì)菌、霉菌、芽孢含量相差不大，酵母含量較低。

圖3和圖4結(jié)果表明，在大曲培養(yǎng)初期(0～7d)酵母含量略有上升，之后迅速下降至培養(yǎng)初期數(shù)量，120 d時(shí)其含量在1.9×105CFU/g左右。大曲中的有益霉菌，如曲霉、根霉，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生多種復(fù)合酶類(lèi)，在白酒釀造過(guò)程中主要起糖化水解作用。霉菌數(shù)量在培菌后期雖然有下降，但在大曲中仍占一定比例，在貯存至120 d時(shí)其含量在1.6×105CFU/g左右，這也是成品大曲糖化力最終保持在700 U/g以上的原因。細(xì)菌是白酒釀造微生物的重要組成部分，芽孢桿菌在一定程度上對(duì)白酒的風(fēng)味和質(zhì)量起關(guān)鍵作用。大曲在培養(yǎng)至第10天時(shí)，芽孢數(shù)量有所下降，可能是因?yàn)榈?0天翻曲，曲房及大曲品溫下降，致使部分芽孢從休眠中復(fù)蘇所致。在大曲貯存至120 d時(shí)，細(xì)菌含量保持在1.4×107CFU/g左右，芽孢含量在5.6×107CFU/g左右，芽孢含量仍處于較高數(shù)量級(jí)，可滿(mǎn)足生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)白酒所需。

圖3 時(shí)間與微生物指標(biāo)的關(guān)系

圖4 大曲培養(yǎng)及貯存過(guò)程不同類(lèi)型微生物數(shù)量占比

2.3 相關(guān)性分析

大曲發(fā)酵和貯存過(guò)程中，其生化指標(biāo)之間存在一定的相關(guān)性。如表1所示，酸度與細(xì)菌數(shù)量、糖化力與霉菌數(shù)量、發(fā)酵力與酵母數(shù)量、蛋白酶活力與酯化力、還原糖與水分含量、水分含量與淀粉含量等指標(biāo)之間呈顯著正相關(guān)性，水分含量與時(shí)間、淀粉含量與時(shí)間、水分含量與氨態(tài)氮、液化力與還原糖、氨態(tài)氮與淀粉含量等指標(biāo)之間呈顯著負(fù)相關(guān)性，這與楊勇等[9]對(duì)中高溫大曲指標(biāo)的研究結(jié)果一致。表1結(jié)果表明，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，大曲中淀粉含量逐漸被消耗，水分含量逐漸降低；發(fā)酵初期糖化力和發(fā)酵力呈快速上升趨勢(shì)，這與霉菌和酵母數(shù)量的變化呈一致性，說(shuō)明此時(shí)的曲溫處在霉菌及酵母菌最佳的生長(zhǎng)范圍內(nèi)；隨著曲溫的進(jìn)一步升高，霉菌和酵母數(shù)量的增殖受到影響，致使糖化力和發(fā)酵力總體呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明發(fā)酵力主要由酵母提供，糖化力主要霉菌提供，這與王世寬等[28]的研究結(jié)果一致；酯化力和酸性蛋白酶活力顯著正相關(guān)，說(shuō)明大曲中相關(guān)微生物新陳代謝所產(chǎn)生的有機(jī)酸促進(jìn)了蛋白酶的合成[29]，同時(shí)，有機(jī)酸的產(chǎn)生也為后續(xù)的酯化反應(yīng)提供了前體物質(zhì)。

表1 大曲生化指標(biāo)的相關(guān)性

3 結(jié)論

本文以陶融型大曲為研究對(duì)象，對(duì)其培養(yǎng)及貯存過(guò)程中生化指標(biāo)變化規(guī)律及相關(guān)性進(jìn)行深入分析，結(jié)果表明，陶融型大曲生化指標(biāo)在其培養(yǎng)及貯存過(guò)程中呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，且不同指標(biāo)之間具有一定的相關(guān)性。在發(fā)酵初期(0～7 d)，酵母、霉菌、細(xì)菌大量繁殖，發(fā)酵力、糖化力、蛋白酶活力、酸度等指標(biāo)急劇上升，水分、淀粉含量則快速下降；發(fā)酵中期(8～15 d)，霉菌、酵母數(shù)量速降，一些耐熱的芽孢桿菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)，糖化力、發(fā)酵力等指標(biāo)急速下降，酸度持續(xù)上升，且酸度、蛋白酶活力在發(fā)酵中期達(dá)到峰值；發(fā)酵末期(16～30 d)，大曲中微生物以細(xì)菌、芽孢桿菌占主導(dǎo)地位，酸度、淀粉含量、酯化力、蛋白酶活力等指標(biāo)下降至穩(wěn)定狀態(tài)。貯存至120 d時(shí)，大曲糖化力保持在700 U/g以上，液化力在0.8 U/g左右，發(fā)酵力在0.8 U/g左右，蛋白酶活力在40 U/g以上，酯化力在20 U/g以上，細(xì)菌數(shù)量在1.4×107CFU/g左右，酵母數(shù)量在1.9×105CFU/g左右，霉菌數(shù)量在1.6×105CFU/g左右，芽孢數(shù)量在5.6×107CFU/g左右。相關(guān)性分析結(jié)果表明，酸度與細(xì)菌數(shù)量、糖化力與霉菌數(shù)量、發(fā)酵力與酵母數(shù)量、蛋白酶活力與酯化力、還原糖與水分含量、水分含量與淀粉含量等指標(biāo)之間呈顯著正相關(guān)性，水分含量與時(shí)間、淀粉含量與時(shí)間、水分含量與氨態(tài)氮、液化力與還原糖、氨態(tài)氮與淀粉含量等指標(biāo)之間呈顯著負(fù)相關(guān)性。

陶融型白酒在生產(chǎn)中采用陳曲釀酒，大曲貯存時(shí)間為3～6個(gè)月。隨著貯存期的增加，雖然大曲的一些生化指標(biāo)會(huì)有所下降，但貯存期的延長(zhǎng)，卻使得大曲曲香更加濃郁，釀出的酒質(zhì)也更加柔和。本文雖然對(duì)陶融型大曲相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了多方位多因素研究，但大曲微生物群落及其多酶體系的演變機(jī)理尚不清楚，后續(xù)將通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合，對(duì)陶融型大曲生化功能的形成進(jìn)行解析，為改良制曲工藝及指導(dǎo)后期釀酒提供理論參考。