長(zhǎng)雙歧桿菌抗生素初始微生物折點(diǎn)值制定及耐藥機(jī)制探討

趙芳，趙建新，張灝,2，陳衛(wèi)，陸文偉,2*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué)(揚(yáng)州)食品生物技術(shù)研究所，江蘇 揚(yáng)州，225004)

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是首批定殖于人體腸道的微生物，與宿主健康密切相關(guān)[1]。人體腸道中雙歧桿菌的種類(lèi)和數(shù)量隨著年齡的增長(zhǎng)而變化，是嬰兒和成人胃腸道的優(yōu)勢(shì)菌群[2]。長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)是人體腸道雙歧桿菌的優(yōu)勢(shì)菌種，占34.30%，在各個(gè)年齡段都存在，尤其是在中青年、老人和長(zhǎng)壽老人中豐度最高[3]。B.longum具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡[4]、抑制致病菌生長(zhǎng)[5]、調(diào)節(jié)免疫[6]、緩解便秘[7]、降血脂[8]、預(yù)防肥胖和糖尿病[9]、抑制結(jié)直腸癌[10]等眾多益生特性，且B.longumsubsp.longum已被歐洲食品安全局(European Food Safety Agency，EFSA)列入安全資格認(rèn)定(qualified presumption of safety，QPS)清單[11]，因此B.longum已成為全球范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的益生菌之一。但有些雙歧桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和青霉素類(lèi)抗生素均表現(xiàn)出抗性，且其基因組中也鑒定到相關(guān)的抗性基因[12-14]?？股乜剐曰?antibiotic resistance genes，ARGs)作為一種新型環(huán)境污染物，可通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移到環(huán)境中進(jìn)行傳播和擴(kuò)散[15]。因此在潛在益生雙歧桿菌菌株商業(yè)化應(yīng)用時(shí)，應(yīng)對(duì)其抗生素耐藥進(jìn)行安全性評(píng)估。

目前人們多聚焦于致病菌耐藥性研究，對(duì)潛在益生雙歧桿菌菌株抗生素耐藥性缺乏監(jiān)測(cè)。特別是，不同種雙歧桿菌抗生素耐藥性判定普遍使用EFSA制定的雙歧桿菌屬水平微生物折點(diǎn)值(microbiological cut-off values，MCOFFs)[16]。MCOFFs的制定常基于細(xì)菌-抗生素組合的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)分布[17]，而MIC分布因細(xì)菌種類(lèi)、抗生素類(lèi)別和抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)方法的不同而變化[18]，因此最好制定細(xì)菌種水平MCOFFs。本研究旨在通過(guò)測(cè)定52株B.longum對(duì)6類(lèi)常見(jiàn)抗生素的MIC值，采用2種經(jīng)典統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行B.longum抗生素種特異性初始微生物折點(diǎn)值的制定，以用于區(qū)分敏感菌株與獲得性抗性菌株，并從分子基因?qū)用孢M(jìn)行固有耐藥和獲得性耐藥機(jī)制解析。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 測(cè)試菌株

實(shí)驗(yàn)所選的52株長(zhǎng)雙歧桿菌均保藏在江南大學(xué)食品生物技術(shù)菌種保藏中心，菌株分離信息見(jiàn)表1。

表1 52株長(zhǎng)雙歧桿菌菌株來(lái)源信息表

續(xù)表1

1.1.2 質(zhì)控菌株

本研究選用B.longumATCC 15707作為抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控菌株，為商業(yè)購(gòu)買(mǎi)菌株。

1.1.3 主要試劑

四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、氯霉素、萬(wàn)古霉素，購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 MRS培養(yǎng)基

菌株活化培養(yǎng)基(MRS-Cys)(g)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，葡萄糖20，Na2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO40.25，檸檬酸氫二銨2，KH2PO42.6，吐溫1 mL，1 L MRS培養(yǎng)基中添加0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽，pH調(diào)至6.8。

1.1.4.2 LSM培養(yǎng)基

抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基(LSM-Cys)：ISO-SENSITEST BROTH (OXOID，貨號(hào)CM0473B)和MRS培養(yǎng)基按照9∶1的體積比混合為L(zhǎng)SM培養(yǎng)基，1 L LSM培養(yǎng)基中添加0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽為L(zhǎng)SM-Cys培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(ME3002E)、pH計(jì)(FE-20)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(SX-500)，日本Tomy Digital Biology公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9123A)，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)(ZHJH-C1109B)，江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1800)，日本島津企業(yè)管理有限公司；厭氧工作站(Whitley DG250)，英國(guó)Don Whitley Scientific公司；全波長(zhǎng)自動(dòng)酶標(biāo)儀(MULTISCAN GO)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化

將測(cè)試菌株和質(zhì)控菌株按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種到MRS-Cys培養(yǎng)基中，置于厭氧工作站，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，活化2代。

1.3.2 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)

抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)方法為肉湯微量稀釋法，具體操作參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法ISO 10932(IDF 223:2010)[19]。

1.3.3 初始微生物折點(diǎn)值的制定

TMCOFFs的制定參照TURNIDGE等[20](T)和KRONVALL[21](K)兩種經(jīng)典統(tǒng)計(jì)方法。MIC值經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得MIC累積頻數(shù)分布表，按照相應(yīng)的方法說(shuō)明將頻數(shù)分布表分別導(dǎo)入ECOFFinder(T法)和Automatic_NRI-MIC_Win_V02beta(K法)2個(gè)數(shù)據(jù)表中。T法計(jì)算過(guò)程為：先將MIC分布進(jìn)行以2為底的對(duì)數(shù)正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的MIC分布進(jìn)行非線(xiàn)性最小二乘法回歸擬合，得到3個(gè)重要參數(shù)：菌株估計(jì)值、log2平均值(log2Mean)和log2標(biāo)準(zhǔn)差(log2SD)，然后從頻數(shù)分布最高或高于1個(gè)2倍濃度的MIC分布開(kāi)始迭代擬合，直至包含所有抗生素濃度。當(dāng)擬合估計(jì)值(N)與真值之差最小時(shí)，擬合度最佳，此時(shí)的MIC為最佳MIC值，基于最佳MIC下的log2平均值和log2標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得到微生物折點(diǎn)值真值。本文選取包含99%野生型菌群的折點(diǎn)值真值向上四舍五入至鄰近的2倍抗生素濃度即定義為T(mén)MCOFFs[22]。同樣地，K法計(jì)算過(guò)程為：將MIC分布導(dǎo)入數(shù)據(jù)表后，得到3個(gè)重要參數(shù)值：log2平均值(log2Mean)、log2標(biāo)準(zhǔn)差(log2SD)和平均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(Mean+2SD)；Mean+2SD向上四舍五入至鄰近的2倍抗生素濃度即定義為T(mén)MCOFFs。

1.3.4 耐藥基因的鑒定

將52株測(cè)試菌株的基因組序列與抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)(CARD)和可移動(dòng)耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)(ResFinder)比對(duì)，以氨基酸序列一致性≥30%和比對(duì)覆蓋度≥90%為閾值，篩選出推定的抗生素耐藥基因[23-24]。

1.3.5 可移動(dòng)耐藥基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)ResFinder數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定結(jié)果提取目的菌株中的可移動(dòng)耐藥基因序列,并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相應(yīng)的耐藥基因序列，兩者通過(guò)ClustalW(默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行多重比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建采用MEGA-X。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用HemI 1.0進(jìn)行可移動(dòng)耐藥基因的熱圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)雙歧桿菌抗生素敏感性評(píng)估

本研究測(cè)定了52株B.longum對(duì)四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、氯霉素和萬(wàn)古霉素的MIC值。由表2可知，在MIC分布上，B.longum對(duì)四環(huán)素的MIC分布范圍為0.125～64 μg/mL，菌株FGZ23I1M2的MIC值僅為0.125 μg/mL(表3)，而有8株B.longum的MIC高達(dá)64 μg/mL。紅霉素MIC分布范圍為0.032～>8 μg/mL，克林霉素MIC分布范圍為0.032～>16 μg/mL，分別覆蓋7和6個(gè)2倍抗生素濃度梯度。13株B.longum對(duì)紅霉素和克林霉素的MIC值均超出其測(cè)定的最大抗生素濃度范圍，并表現(xiàn)出同步抗性。在氨芐青霉素的MIC分布上，絕大多數(shù)B.longum的MIC≤4 μg/mL；而在氯霉素MIC分布上，除菌株FJSWXJ2M1的MIC<0.125 μg/mL外(表3)，剩下的B.longum菌株的MIC分布僅涵蓋4個(gè)濃度梯度。而對(duì)于萬(wàn)古霉素MIC分布，19%(10/52)B.longum菌株的MIC值明顯分離于正常敏感菌群。

表2 52株B. longum對(duì)6種抗生素的MIC分布

表3 52株B. longum對(duì)6種抗生素的MIC分布結(jié)果 單位:μg/mL

續(xù)表3

續(xù)表3

2.2 長(zhǎng)雙歧桿菌抗生素耐藥性微生物折點(diǎn)值制定

本文基于52株B.longum對(duì)6種抗生素的MIC頻數(shù)分布，采用Turnidge(T)和Kronvall(K)兩種經(jīng)典統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，進(jìn)行B.longum種特異性TMCOFFs的制定及耐藥率比較分析，并與已制定的雙歧桿菌屬水平折點(diǎn)值進(jìn)行比較。表4為2種統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算過(guò)程中得到的重要參數(shù)值：log2Mean、log2SD和基于前面2個(gè)參數(shù)計(jì)算得到的折點(diǎn)值真值，折點(diǎn)值真值向上四舍五入至鄰近的2倍抗生素濃度，即為T(mén)MCOFFs。由表5可知，采用T法制定的B.longum對(duì)四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、氯霉素和萬(wàn)古霉素的TMCOFFs依次為8、8、0.25、8、8和2 μg/mL；而基于K法計(jì)算得到的B.longum對(duì)這6種抗生素的TMCOFFs依次為8、8、0.25、2、8和2 μg/mL。2種不同統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)：除氨芐青霉素TMCOFFs相差2個(gè)抗生素濃度外，T法與K法計(jì)算得到的B.longum與剩下5種抗生素組合的TMCOFFs完全相等，這表明2種統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算結(jié)果的一致性非常高。因此本文初步制定的B.longum對(duì)給定抗生素的種特異性微生物折點(diǎn)值是可靠的。

表4 基于Turnidge和Kronvall方法下長(zhǎng)雙歧桿菌折點(diǎn)值的估計(jì)

表5 52株B. longum的初始微生物折點(diǎn)值和耐藥率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

種特異性折點(diǎn)值與EFSA屬水平折點(diǎn)值相比較發(fā)現(xiàn)：種水平和屬水平折點(diǎn)值之間既存在一致性又存在差異性；相較于屬水平折點(diǎn)值，基于種特異性折點(diǎn)值B.longum對(duì)四環(huán)素、紅霉素、克林霉素和萬(wàn)古霉素耐藥率水平相當(dāng)，為中度抗性；氨芐青霉素耐藥率水平均較低；而氯霉素耐藥率由13.46%降為0。

2.3 種特異性微生物折點(diǎn)值下長(zhǎng)雙歧桿菌多重耐藥性分析

基于種特異性微生物折點(diǎn)值進(jìn)行B.longum對(duì)給定抗生素表型抗性的鑒定，若菌株對(duì)3類(lèi)或3類(lèi)以上抗生素表現(xiàn)出抗性時(shí)，即定義為多重耐藥[25]。表6為52株長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)6種抗生素的多重耐藥性統(tǒng)計(jì)結(jié)果，由表6可知,21(40.4%)株菌為野生型，14株菌對(duì)1種抗生素有抗性，11株菌對(duì)2種抗生素具有抗性。5株菌對(duì)3種抗生素具有抗性，1株菌對(duì)5種抗生素具有抗性。6(11.5%)株菌為多重耐藥菌，其中FGSYC28M5是耐藥譜最廣的菌株，耐藥譜為四環(huán)素-紅霉素-克林霉素-氨芐青霉素-萬(wàn)古霉素(表3)?？傮w來(lái)看，基于B.longum種特異性微生物折點(diǎn)值對(duì)52株分離株與給定6種抗生素的多重耐藥分析，發(fā)現(xiàn)其多重耐藥情況較輕，為今后長(zhǎng)雙歧桿菌的安全性應(yīng)用提供參考。

表6 52株B. longum的多重耐藥性結(jié)果

2.4 長(zhǎng)雙歧桿菌抗生素耐藥性基因分析

表7為52株B.longum菌株基因組與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定的表型抗性相關(guān)的耐藥基因。由表7可知，52株測(cè)試菌株均比對(duì)到了四環(huán)素耐藥基因rpsJ和tetB(P)，紅霉素耐藥基因macB，克林霉素耐藥基因lmrB、lmrC和lmrD，而B(niǎo).longum對(duì)這3種抗生素的表型耐藥率依次為28.85%、25%和28.85%；故推測(cè)B.longum對(duì)這3種抗生素耐受可能由其他新的耐藥基因介導(dǎo)或需多個(gè)耐藥基因共同作用。但僅有17株菌株比對(duì)到四環(huán)素抗性基因tet(W)，且其序列一致性高達(dá)97%，其中13株菌株為四環(huán)素耐藥菌株；而且通過(guò)可移動(dòng)耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)ResFinder鑒定發(fā)現(xiàn)，13株四環(huán)素耐藥菌株中，可移動(dòng)耐藥基因tet(W)的檢出率高達(dá)92.31%(12/13)(圖1)，故推測(cè)基因tet(W)可提高長(zhǎng)雙歧桿菌四環(huán)素耐受性，且該基因具有水平基因轉(zhuǎn)移至其他致病菌的風(fēng)險(xiǎn)。有13株B.longum菌株同時(shí)表現(xiàn)出紅霉素和克林霉素抗性，其中10株菌株基因組中均存在可移動(dòng)抗性基因erm(X)(圖1)，推測(cè)B.longum對(duì)紅霉素和克林霉素共同抗性是由可移動(dòng)耐藥基因erm(X)介導(dǎo)，這與MARTíNEZ等[26]的研究結(jié)果一致；而菌株FJSWXJ41M1和FSDLZ50M2均含有erm(X)，但其對(duì)紅霉素和克林霉素均敏感，因此推測(cè)其基因erm(X)可能為沉默基因。所有菌株均未比對(duì)到β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因，這與B.longum對(duì)氨芐青霉素表型敏感率吻合程度高達(dá)92.31%。51株菌均比對(duì)到了多重耐藥基因CIPa，1株菌比對(duì)到了clbB，而B(niǎo).longum的多重耐藥率僅為11.5%，故推測(cè)CIPa和clbB可能為沉默基因或需與多個(gè)耐藥基因共同作用。B.longum基因組中比對(duì)到的糖肽類(lèi)抗性基因有vanB、vanD、vanRO、vanSO、vanRI和vanRA；WEI等[27]在B.longumJDM301中鑒定到推定的萬(wàn)古霉素抗性基因有vanD、vanU、vanH、vanSB、vanSD5和vanSc3，而本文中10株萬(wàn)古霉素耐藥菌株基因組中均只存在vanD基因，故推測(cè)該基因是部分B.longum糖肽類(lèi)抗生素耐受的關(guān)鍵抗性基因。

表7 52株B. longum中表型抗性相關(guān)耐藥基因的鑒定結(jié)果

圖1 52株長(zhǎng)雙歧桿菌菌株基因組中可移動(dòng)耐藥基因tet(W)和erm(X)的分布結(jié)果

2.5 可移動(dòng)耐藥基因tet(W)和erm(X)的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將含有可移動(dòng)耐藥基因的B.longum菌株的tet(W)和erm(X)耐藥基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的11個(gè)tet(W)和4個(gè)erm(X)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并采用MEGA-X中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2和圖3。

圖3 長(zhǎng)雙歧桿菌中可移動(dòng)耐藥基因erm(X)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖2 長(zhǎng)雙歧桿菌中可移動(dòng)耐藥基因tet(W)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

由圖2可知，15株B.longum菌株分布在2個(gè)分支上，其中的13株B.longum菌株與NCBI庫(kù)下載的長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種(Bifidobacteriumlongumsubsp.longum)和嬰兒亞種(B.longumbv.infantis)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、假小鏈雙歧桿菌(B.pseudocatenulatum)、動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)、杰氏棒桿菌(Corynebacteriumjeikeium)和Parasutterellaexcrementihominis在同一分支上，其序列相似度高，推測(cè)可能來(lái)源于同一耐藥基因；而菌株FGDLZ19M5、FGDLZ8M1和FJSNT32M4與NCBI下載的短雙歧桿菌(B.breve)和長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)位于另一分支上，且各基因間的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，可能來(lái)源于不同供體。

由圖3可知，13株B.longum菌株分布在2個(gè)大分支上，說(shuō)明不同B.longum菌株的erm(X)基因序列具有顯著的變異。其中6株B.longum菌株FXJWS49M9、HUB225、FXJWS23M7、FHeNJZ44M8、FYNLJ22M3和FGSYC28M5與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的3種棒狀桿菌(Corynebacterium)菌株和化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)菌株的erm(X)基因序列同源性較高，推測(cè)B.longum菌株中的erm(X)基因可能是由其他細(xì)菌水平轉(zhuǎn)移耐藥基因所獲得。此外，第2個(gè)分支上分離自同一地區(qū)菌株FSDLZ50M2、FSDLZ51M1、FJSWXJ41M1、FJSNT32M4、FJSWXJ41M1的erm(X)基因序列相似度達(dá)到100%。

3 結(jié)論

本研究基于長(zhǎng)雙歧桿菌與6種抗生素組合的MIC分布，初步制定B.longum對(duì)四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、氯霉素和萬(wàn)古霉素的種特異性微生物折點(diǎn)值分別為8、8、0.25、8/2(T/K)、8和2 μg/mL，其可用于區(qū)分敏感菌株與獲得性抗性菌株。25%的B.longum菌株同時(shí)表現(xiàn)出紅霉素和克林霉素抗性，其抗性是由可移動(dòng)耐藥基因erm(X)介導(dǎo)；可移動(dòng)耐藥基因基因tet(W)介導(dǎo)B.longum四環(huán)素表型抗性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明長(zhǎng)雙歧桿菌耐藥基因tet(W)和erm(X)來(lái)源于不同宿主，同一地區(qū)分離菌株的耐藥基因具有高度同源性。益生菌菌株的耐藥性判定關(guān)系到食品安全，本文通過(guò)制定長(zhǎng)雙歧桿菌的耐藥性折點(diǎn)值，對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌在食品中的安全性應(yīng)用具有指導(dǎo)價(jià)值。