基于“開-閉”環(huán)的鐵離子探針的合成及性能研究

李長江, 李晴, 張莉艷, 鄭玉船, 潘樂, 柯仲成, 李博文

1(黃山學院 化學化工學院，安徽 黃山，245041) 2(黃山學院 無機功能材料重點實驗室，安徽 黃山，245041) 3(安徽工業(yè)大學 化學與化工學院，安徽 馬鞍山，243032) 4(浙江大學 藥學院，浙江 杭州，310058)

鐵是維持生命和生長發(fā)育所必需的微量元素之一，占人體體重的0.006%，人體內(nèi)的鐵主要來源于食物，如豆類、蔬菜、水果、瘦肉、蛋黃、魚類、動物的肝臟和腎臟等[1]。鐵在人體內(nèi)許多生理過程中扮演著非常重要的角色，其中最重要的生物學功能是參與氧的運輸和造血過程[2]。機體內(nèi)鐵含量偏少或過量均會產(chǎn)生嚴重的毒副作用，引起生命體系的紊亂，有研究發(fā)現(xiàn)，許多疾病的產(chǎn)生與鐵含量正常與否有著密切關系，如阿爾茲海默癥、帕金森病和亨廷頓病等[3]。缺乏鐵會引起貧血，降低對抗感染的能力，損害精神活動和智力發(fā)展，但過量攝入鐵也會引起癌癥、心臟病、肝硬化、糖尿病以及腎衰竭等其他嚴重疾病，甚至死亡[4-6]。因此，快速準確地檢測出食品及生物體內(nèi)的Fe3+含量具有重要意義。然而，對于金屬離子的檢測，普遍使用的是傳統(tǒng)檢測方法，主要有電子耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法、電子耦合等離子體-質(zhì)譜法、原子吸收光譜法、循環(huán)伏安法以及分光光度測定方法等[7-10]。這些傳統(tǒng)檢測方法往往操作繁瑣、成本高，不易于應用在大批量和實時檢測中。熒光探針具有合成簡單、選擇性好、靈敏度高以及操作簡單的優(yōu)點，是一種簡易且高效的金屬離子檢測方法[11-12]。

羅丹明類熒光染料具有優(yōu)異的光學性能，其內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有“開-閉”環(huán)的特性，在處于螺環(huán)狀態(tài)時，表現(xiàn)為無色和無熒光的性質(zhì)，當其與特定的金屬離子結(jié)合后，便會處于開環(huán)狀態(tài)，從而表現(xiàn)出顏色變化和熒光特性，是一種非常好的金屬離子熒光探針的母體結(jié)構(gòu)，因而備受關注[13-14]。目前，已有不少羅丹明類探針分子被用于識別Cu2+、Al3+、Hg2+等，但用于識別Fe3+的報道較少，而且存在不足,例如靈敏度低、易受其他金屬離子的干擾等[15-20]。本文以羅丹明B、乙二胺和鄰香蘭素為原料，通過酰基化和醛胺縮合反應，合成了一種新型的羅丹明B類金屬離子探針R1。研究表明，R1對Fe3+具有很好的選擇識別能力，受其他金屬離子的干擾較小，靈敏度高，能高效地檢測出食品及環(huán)境中Fe3+的含量。同時其發(fā)光波長能有效的降低生物體自身的熒光干擾，生物相容性好，細胞毒性低，本研究為進一步進行生物體內(nèi)Fe3+的檢測提供了一種新方法。

1 材料與儀器

羅丹明B、乙二胺、鄰香蘭素、金屬鹽(除AgNO3外，其他的鹽均為氯化物),阿拉丁試劑(上海)有限公司;其他試劑,國藥集團試劑有限公司。所有試劑均為分析純。乙醇經(jīng)過除水處理。實驗用水為超純水。

AM-400 MHz核磁共振儀，德國Brucker公司；LCT Premier XE質(zhì)譜儀，美國Waters公司；UV-2450紫外可見分光光度計、RF-5301PC熒光光譜儀，日本Shimadzu公司；MK3酶標儀，美國Thermo公司；IX71倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

2 實驗內(nèi)容

2.1 探針R1的合成

探針R1的合成路線如圖1所示。

圖1 探針R1的合成路線

根據(jù)參考文獻[21]合成N-氨乙基-羅丹明B酰亞胺，稱取3.057 5 g羅丹明B于100 mL茄形燒瓶中，加入45 mL無水乙醇，加熱攪拌使其完全溶解，滴加4 mL乙二胺后115 ℃回流，薄層色譜(thin layer chromatography, TLC)跟蹤反應。反應結(jié)束后，將蒸餾濃縮后的反應液滴入劇烈攪拌的冰水中，有大量固體析出，抽濾并用乙醇洗滌，得淡粉色偏白的固體，干燥后得產(chǎn)物2.031 5 g，產(chǎn)率66%。柱層析進行純化，用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1的洗脫液洗脫，得N-氨乙基-羅丹明B酰亞胺白色粉末。

稱取N-氨乙基-羅丹明B酰亞胺0.524 2 g于50 mL茄型瓶中，加入20 mL無水乙醇，常溫攪拌使其溶解。再稱取鄰香蘭素0.154 1 g加入上述溶液中。110 ℃加熱回流，TLC跟蹤反應，待反應結(jié)束后濃縮反應液，抽濾并用少量無水乙醇洗滌，得亮黃色固體，用無水乙醇進行重結(jié)晶最終得針狀黃色晶體0.553 4 g，產(chǎn)率為83%。根據(jù)核磁共振譜圖(圖S1、圖S2)和質(zhì)譜圖(圖S3)可知：1H NMR(400 MHz，CDCl3，TMS)δ：13.55(1H，s)，8.06(1H, s)，7.93～7.91(1H，J=7.3，3.6 Hz，dd)，7.45～7.42(2H，J=5.8，3.0 Hz，dd)，7.1～7.08(1H，J=5.7，3.1 Hz，dd)，6.87～6.85(1H，J=7.6，1.5 Hz，dt)，6.77～6.71(2H，m)，6.45～6.43(2H，J=8.0 Hz，d)，6.40(2H，s)，6.27～6.24(2H，J=8.8，2.6 Hz，dd)，3.85(3H，s)，3.42～3.36(4H，m)，3.35～3.30(8H，J=16.7，9.6 Hz，dd)，1.18～1.14(12H，J=7.0 Hz，t)。13C NMR(100 MHz, CDCl3, TMS)δ：168.21，166.05，153.51，153.37，152.16，148.85，148.47，132.48，131.10，128.82，128.06，123.83，122.96，122.87，118.54，117.58，114.04，108.14，105.44，97.82，64.97，56.64，56.12，56.09，44.36，40.90，12.62。MS，m/z：619.328 9[M]+，理論計算值619.328 4。

2.2 溶液的配制

分別稱取NaCl、KCl、CaCl2、MnCl2、CuCl2、ZnCl2、CrCl3、FeCl3、NiCl2、PbCl2、BaCl2、CoCl2、HgCl2、AgNO3、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)，用2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES)緩沖溶液 (1 mol/L, pH 7.3)溶解配制成3 mmol/L的溶液，避光處放置備用。再用乙腈配制濃度為3 mmol/L的探針R1溶液。

2.3 探針離子選擇性的研究[22]

用移液槍分別往15根7 mL的離心管中加入2.9 mL乙腈水溶液[V(水)∶V(乙腈)=1∶4]和30 μL R1溶液，然后再向其中1根離心管中加入70 μL去離子水作為比對樣，剩下的14根離心管中分別加入70 μL配制好的3 mmol/L上述含有不同金屬離子的溶液。反應片刻后，觀察記錄溶液顏色和熒光的變化。并用紫外可見分光光度計和熒光光譜儀分別測量可見吸收和熒光發(fā)射光譜。

2.4 探針離子干擾性的研究[23]

通過離子選擇性的研究，得出R1對Fe3+具有較好的選擇性。在離子選擇性研究中，除含F(xiàn)e3+以外其余14根離心管中，用移液槍分別加入70 μL的FeCl3溶液，反應片刻，用紫外可見分光光度計和熒光光譜儀分別測量可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。

2.5 探針靈敏度的研究[24]

取16根離心管，用移液槍分別加入30 μL的R1溶液，并以10 μL為梯度，分別加入從0到150 μL的FeCl3溶液，為保證總體積為3 mL，乙腈水溶液相對應的從2.97 mL調(diào)整到2.82 mL，反應片刻，分別測量可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。

2.6 探針與Fe3+反應機理的研究[25]

在2.4中加入FeCl3溶液的離心管里，滴加2倍體積EDTA溶液，并用紫外可見分光光度計測量溶液于530 nm處的吸光度。接著用移液槍分別向11根離心管中加入2.7 mL的乙腈水溶液，然后同時加入R1溶液和FeCl3溶液，保持R1和FeCl3溶液的體積之和為300 μL，以30 μL為1個梯度，F(xiàn)eCl3溶液加入體積從0 μL到300 μL，R1的體積則相反，從300 μL到0 μL。反應片刻，用紫外可見分光光度計分別測量530 nm處的吸光度。

2.7 探針細胞毒性的研究[26]

在37 ℃，體積分數(shù)5% CO2的氣氛下，待96孔板中HeLa細胞密度達到5 000個/孔時，加入不同濃度的R1、Fe3+或R1+Fe3+進行孵育，以未經(jīng)處理的細胞作為對照組。孵育48 h后，取出培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖溶液(phesphate buffer saline, PBS)洗滌3次，然后加入含有0.5 mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT)的改良依格爾培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)孵育4 h。待孵育完畢，96孔板中每個孔加入150 μL的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)并用酶標儀在530 nm處記錄吸光度。

2.8 探針細胞成像的研究[26]

在37 ℃，體積分數(shù)5% CO2的氣氛下，在6孔板上用添加質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進行HeLa細胞的培養(yǎng)(80 000個/孔)，培養(yǎng)24 h，直到細胞密度達到50%～60%。然后用5 μmol/L探針孵育6 h，取出培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次后，再將探針處理過的細胞與10 μmol/L Fe3+進行孵育，孵育2 h后取出培養(yǎng)基并用PBS洗滌孵育后的細胞3次，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針的離子選擇性

加入不同離子的R1溶液出現(xiàn)了肉眼可見的變化，如圖2-a所示，加入Fe3+的R1溶液顏色出現(xiàn)了橘紅色，其他離子均未使R1溶液的顏色發(fā)生改變。如圖2-b所示，在365 nm紫外光照射下，加入Fe3+的R1溶液呈現(xiàn)出明亮的橘黃色熒光信號。加入其他離子的R1溶液均未發(fā)生明顯的熒光信號變化。

a-在可見光下；b-在365 nm紫外光照射下

通過光譜的測量分析，加入Fe3+的R1溶液在530 nm出現(xiàn)最強吸收峰，在550 nm出現(xiàn)了最大熒光發(fā)射峰，而其他離子在530 nm(圖3-a)和550 nm(圖3-b)處沒有出現(xiàn)明顯的吸收峰。表明R1對Fe3+表現(xiàn)出明顯的響應，對其他離子沒有響應，說明其對Fe3+具有高效的選擇性和專一性。

a-可見吸收光譜；b-熒光發(fā)射光譜

3.2 探針的離子干擾性

為進一步說明R1對Fe3+具有高效的選擇性和專一性，在離子選擇性實驗的基礎上，往含有不同離子的體系中加入等量的Fe3+，反應片刻后，各體系均呈現(xiàn)出明顯的顏色和熒光變化。由圖4可以看出，在其他離子共存的情況下，混合體系在530和555 nm處均出現(xiàn)相近的峰值，說明其他離子的存在不影響R1對Fe3+的響應，探針具有很好的抗干擾性。

圖4 R1在Fe3+與其他金屬離子共存情況下的可見吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)。

3.3 探針的靈敏度

如圖5所示，當Fe3+濃度從0 μmol/L逐漸增加至150 μmol/L時，530 nm處的可見吸收峰也逐漸增高，通過最高點峰值圖的繪制，可以看出當Fe3+濃度在60～150 μmol/L的范圍內(nèi)，具有良好的線性關系，對此區(qū)間進行線性擬合，得到回歸方程Y=1.037×10-2X-0.587，R2值為0.998 73。

圖5 R1在不同F(xiàn)e3+濃度下的可見吸收光譜(a)和R1在530 nm處吸光度的線性擬合(b)

從圖6可以看出，隨著Fe3+濃度逐漸增大(0～150 μmol/L)，555 nm處的熒光發(fā)射強度也逐漸增強，繪制不同濃度下對應的最高點峰值圖，可以看出在50～140 μmol/L的Fe3+濃度范圍內(nèi)，圖線具有良好的線性關系，對此區(qū)間進行線性擬合，得到回歸方程Y=9.64X-403.063，R2值為0.998 98。

圖6 R1在不同F(xiàn)e3+濃度下的熒光光譜(a)和R1在555 nm處熒光發(fā)射的線性擬合(b)

結(jié)合上述實驗所得的線性回歸方程，根據(jù)公式(1)計算Fe3+檢出限：

LOD=3σ/k

(1)

式中：σ,空白樣測量的標準差;k,線性回歸方程的斜率。

該體系中Fe3+的LOD分別為146 nmol/L(可見分光光度法)和129 nmol/L(熒光光譜法)，遠低于中國飲用水標準中Fe3+的含量值0.3 mg/L[27](535 7 nmol/L)，說明R1可以很好地應用于食品安全等領域中Fe3+含量的檢測。

3.4 探針與Fe3+反應機理

一般來說，探針對金屬離子的選擇性，取決于探針結(jié)構(gòu)中具有孤對電子如N、O等的配體與金屬離子的結(jié)合動力學。因此為了探討R1與Fe3+之間的相互作用，選擇了EDTA作為絡合劑,如圖7所示。

圖7 R1在Fe3+以及含EDTA的Fe3+存在下的可見吸收光譜

當R1和Fe3+發(fā)生作用，溶液出現(xiàn)顏色，530 nm處出現(xiàn)紫外吸收峰，由于EDTA對金屬離子的結(jié)合能力強于其他絡合劑，所以加入EDTA溶液后，溶液顏色逐漸褪去，530 nm處的紫外吸收峰也隨之消失，并且這一過程是可逆的。可以推斷R1與Fe3+之間的作用與羅丹明母體結(jié)構(gòu)中酰亞胺環(huán)的“開-閉”有密切聯(lián)系。R1具有螺環(huán)和開環(huán)形式，當處于螺環(huán)形式時為無色，但當Fe3+加入后，由于配位作用，螺環(huán)結(jié)構(gòu)打開，伴隨著明顯的顏色和熒光變化，從而達到檢測Fe3+的目的。

為進一步確定R1與Fe3+之間的結(jié)合系數(shù)，采用等物質(zhì)的量連續(xù)變化法(Job’s plot)來測試，由圖8可知，當Fe3+的摩爾分數(shù)接近0.5時(即加入的Fe3+和R1等量)，溶液在530 nm處出現(xiàn)最大的可見吸收峰，表明R1和Fe3+是以1∶1的絡合比進行作用的，推斷R1與Fe3+作用的反應機理如圖9所示。

圖8 R1與Fe3+作用的結(jié)合比例

圖9 R1與Fe3+的反應機理

3.5 探針的細胞毒性

為評價R1、Fe3+以及R1+ Fe3+的生物相容性，采用MTT法來考察其對HeLa細胞存活率的影響。如圖10所示，R1、Fe3+以及R1+ Fe3+加入HeLa細胞進行培養(yǎng)，當濃度低于10 μmol/L時，細胞的存活率達到90%以上；待濃度提高至100 μmol/L，細胞仍然保持了較高的存活率，其IC50>100 μmol/L。表明R1具有較低的細胞毒性，體現(xiàn)出良好的生物相容性，為其在細胞內(nèi)進行有效檢測提供了有力的實驗依據(jù)。

圖10 R1、Fe3+和R1+Fe3+對細胞活力的影響

3.6 探針的細胞成像

為了證明熒光探針R1能夠在細胞中檢測 Fe3+， 采用熒光成像技術對所制備的熒光探針R1在細胞內(nèi)的檢測能力進行了考察。如圖11所示， 以HeLa細胞作為研究對象， 當5 μmol/L R1加入到細胞中培養(yǎng)6 h，再加入10 μmol/L Fe3+處理2 h后，可以明顯地觀察到R1與Fe3+作用所產(chǎn)生的紅色熒光，這直接說明了R1可以迅速被HeLa細胞攝取，同時在HeLa細胞內(nèi)被Fe3+激活，并釋放出具有熒光信號的配合物R1-Fe3+。

a-R1相位對比圖像；b-R1熒光顯微圖像；c-a與b重疊圖像；d-R1+Fe3+相位對比圖像；e-R1+Fe3+熒光顯微圖像；f-d與e重疊圖像

4 結(jié)論

本文用羅丹明B、乙二胺和鄰香蘭素合成了化合物R1，并對其進行了結(jié)構(gòu)和離子選擇性、反應絡合比、靈敏度等探針性能的表征。實驗結(jié)果表明，R1對Fe3+具有很好的響應，當加入Fe3+時，溶液出現(xiàn)明顯的顏色變化，同時產(chǎn)生熒光，LOD分別為146 nmol/L(分光光度法)和129 nmol/L(熒光光譜法)，證明R1是一種可視化的Fe3+熒光探針。R1與Fe3+通過絡合，使得結(jié)構(gòu)中的酰亞胺發(fā)生了“開-閉”環(huán)，Job’s plot曲線顯示絡合比為1∶1。R1具有良好的生物相容性，可以在活細胞中成像。因此探針R1在檢測食品、環(huán)境、生物等領域中Fe3+含量有潛在的應用前景。