不同發(fā)酵方式對蘿卜泡菜理化特性和風(fēng)味的影響

云琳，毛丙永，崔樹茂，唐鑫，趙建新，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫,214122)

四川泡菜作為中國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品的典型代表，因其風(fēng)味獨特深受消費者青睞，根據(jù)制作方式主要分為鹵水泡菜和鹽水泡菜[1]。泡菜腌制過程主要依靠蔬菜表面乳酸菌的發(fā)酵作用[2]，優(yōu)勢菌群主要是乳桿菌屬與明串珠菌屬[3-4]，其中植物乳桿菌和腸膜明串珠菌被報道較多[5-7]。彭飛[8]研究了四川泡菜中微生物變化和代謝特性，發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌可以啟動泡菜發(fā)酵，植物乳桿菌在發(fā)酵后期生長較快，且產(chǎn)酸能力優(yōu)于腸膜明串珠菌。JUNG等[9]利用焦磷酸測序和核磁共振技術(shù)研究了腸膜明串珠菌在泡菜發(fā)酵過程中對菌群和代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)以腸膜明串珠菌作為發(fā)酵劑可以產(chǎn)生更多的乳酸與甘露醇，甘露醇可賦予泡菜甘甜清爽的味道[10]。

泡菜的風(fēng)味包括非揮發(fā)性與揮發(fā)性物質(zhì)，主要來源于蔬菜、調(diào)味料及微生物代謝[11]。非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要包括有機(jī)酸、氨基酸、糖類等，為泡菜提供酸、甜、苦、咸、鮮等滋味，而揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)則賦予泡菜更多的香氣(如果香、花香、青草香等)，這些滋味物質(zhì)與香氣物質(zhì)使泡菜具有了獨特的風(fēng)味[12]。

本文以自然發(fā)酵泡菜(未接菌)作為對照，以植物乳桿菌和腸膜明串珠菌作為發(fā)酵劑制作接種發(fā)酵泡菜，同時制作鹵水泡菜，研究3種不同發(fā)酵方式泡菜的理化特征與風(fēng)味物質(zhì)，為將來以發(fā)酵劑發(fā)酵泡菜取代自然泡菜和鹵水泡菜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮的白蘿卜、香辛料，購于江蘇省無錫市歐尚超市。

泡菜鹵水：采集于蘇州市某泡菜廠，使用時間1年左右(pH 3.55，總酸質(zhì)量濃度為4.2 g/L，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41 g/L，乳酸菌數(shù)為1.7×106CFU/mL)。

1.2 菌種

植物乳桿菌DJXSRYG2-L1、腸膜明串珠菌JXJ4-12，由江南大學(xué)食品生物技術(shù)菌種保藏中心提供。

1.3 試劑

吡啶、核糖醇、甲氧胺鹽酸鹽、N-甲基-N-(三甲基硅烷基) -三氟乙酰胺、庚酸甲酯，美國Sigma公司。

1.4 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母5，檸檬酸氫二銨2，乙酸鈉5，K2HPO42，MgSO40.58，MnSO40.25，吐溫80 1 mL/L，pH 6.2～6.4。

1.5 儀器與設(shè)備

GR60DA型滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；ST3100X型pH計，奧豪斯儀器(常州)有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；Thermo Trace 1310氣質(zhì)聯(lián)用儀、Thermo TSQ 8000 Evo質(zhì)譜儀，美國Thermo公司。

1.6 試驗方法

1.6.1 泡菜發(fā)酵工藝

自然發(fā)酵泡菜制備：將白蘿卜整理洗凈并去除表皮雜質(zhì)，用無菌水清洗3遍，切成約1 cm×1 cm×1 cm塊狀，并加入40 g/L鹽水和香辛料，裝壇密封發(fā)酵。

接種發(fā)酵泡菜制備：將植物乳桿菌DJXSRYG2-L1和腸膜明串珠菌JXJ4-12在MRS培養(yǎng)基中活化3代，離心得到菌體,用生理鹽水洗滌3遍，等比例加入2種菌，終濃度約為107CFU/mL，其他工藝同自然發(fā)酵法。

鹵水泡菜制備：將鹽水替換為等量鹵水，其他工藝同自然發(fā)酵泡菜制備流程。

所有泡菜樣品均發(fā)酵120 h，從腌制之日起每24 h進(jìn)行取樣，測定相應(yīng)指標(biāo)。

1.6.2 pH的測定

取5 mL泡菜液，用pH計測定各樣品的pH值。

1.6.3 總酸的測定

參考國標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。

1.6.4 乳酸菌總數(shù)的測定

取1 mL泡菜液，對泡菜中的乳酸菌總數(shù)進(jìn)行計數(shù)，計數(shù)方法依據(jù)GB 4789.35—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》。

1.6.5 感官評定

參照陳功[13]的方法并略作修改。對泡菜的色澤、香氣、質(zhì)地和滋味進(jìn)行評價，評分細(xì)則見表1。

表1 泡菜感官評價評分細(xì)則

續(xù)表1

1.6.6 非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

取5 g泡菜加入10 mL蒸餾水，勻漿過濾，取1 mL汁液采用10 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)行衍生化處理后采用氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技術(shù)進(jìn)行測定，具體衍生化方法和測定方法參照毛丙永等[14]的方法。

1.6.7 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

稱5 g泡菜樣品加入20 mL螺口進(jìn)樣瓶中，加入內(nèi)標(biāo)1 μL 庚酸甲酯(20 mg/mL)，利用固相微萃取法(solid phase micro extraction, SPME)提取泡菜樣品的揮發(fā)性成分，采用GC-MS進(jìn)行測定，具體提取和測定方法參照毛丙永等[14]的方法。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用ANOVA進(jìn)行顯著性分析，顯著水平P<0.05，以不同字母表示，用Graphpad Prism 7.0處理作圖，所有實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 泡菜發(fā)酵過程中pH和酸度的變化

泡菜發(fā)酵過程中pH的變化如圖1-a所示。接種發(fā)酵泡菜與自然發(fā)酵泡菜初始pH均在5.0左右，發(fā)酵24 h后，接種發(fā)酵泡菜的pH降低至3.5左右，96 h趨于穩(wěn)定(約3.3)，而自然發(fā)酵泡菜pH下降速率較慢，96 h后降，至3.5。鹵水泡菜初始pH較低,在3.7左右，這可能是鹵水循環(huán)使用積累乳酸的結(jié)果，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，鹵水泡菜pH變化不明顯。

泡菜發(fā)酵過程中總酸的變化如圖1-b所示。與pH測定結(jié)果相對應(yīng)，鹵水泡菜初始的總酸質(zhì)量濃度最高，約4 g/L，發(fā)酵至96 h，接種發(fā)酵和自然發(fā)酵泡菜總酸的質(zhì)量濃度達(dá)到5 g/L，鹵水泡菜總酸質(zhì)量濃度增加到8 g/L，96～120 h，3種發(fā)酵方式泡菜的總酸質(zhì)量濃度均略有下降，推測可能是因為在發(fā)酵后期一些生物胺(表2)的積累所致。

a-泡菜pH的變化;b-泡菜總酸質(zhì)量濃度的變化

2.2 泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌總數(shù)的變化

泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌總數(shù)的變化如圖2所示。

圖2 不同泡菜樣品在發(fā)酵過程種乳酸菌總數(shù)的變化

接種發(fā)酵泡菜、鹵水泡菜和自然發(fā)酵泡菜的初始乳酸菌總數(shù)分別約為107、106和105CFU/mL。隨著發(fā)酵時間的增加，接種發(fā)酵泡菜與自然發(fā)酵泡菜中的乳酸菌總數(shù)在24 h達(dá)到最大，分別為8.0和7.3 lgCFU/mL，而鹵水泡菜中的乳酸菌數(shù)在24 h后迅速下降，這可能是因為鹵水泡菜的總酸質(zhì)量濃度在24 h內(nèi)增長較快(約7.5 g/L)，一些耐酸能力較差的乳酸菌難以存活，導(dǎo)致乳酸菌數(shù)下降，同時乳酸菌在整個發(fā)酵期間生長較慢，在72 h才達(dá)到最大值(6.3 lgCFU/mL)，這可能與鹵水泡菜的高酸環(huán)境有關(guān)，在96 h總酸質(zhì)量濃度已積累至10 g/L左右，遠(yuǎn)超過接種發(fā)酵泡菜和自然發(fā)酵泡菜，抑制了部分不耐酸的乳酸菌生長[15]，甚至導(dǎo)致乳酸菌的消亡。

2.3 泡菜的感官評定

發(fā)酵終點泡菜各感官屬性如圖3所示。泡菜的顏色和質(zhì)構(gòu)2個感官屬性無顯著差異；在氣味和滋味方面，接種發(fā)酵泡菜和鹵水泡菜之間無顯著差異，均與自然發(fā)酵泡菜存在顯著差異(P<0.05)；在總分方面，接種發(fā)酵泡菜顯著高于自然發(fā)酵泡菜；在氣味、滋味與總分評價屬性方面，接種發(fā)酵泡菜評分均最高。由感官評價總分可知，接種發(fā)酵泡菜與鹵水泡菜品質(zhì)更優(yōu)于自然發(fā)酵泡菜。

圖3 泡菜樣品的感官評分值

2.4 泡菜中非揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)的分析

為明確泡菜的滋味物質(zhì)，采用GC-MS共測得49種非揮發(fā)性物質(zhì)，其中有機(jī)酸類最多(16種)，其次為氨基酸類(12種)、醇類(7種)和糖類(7種)，此外還檢出4種胺類、1種酰胺類、甘油醛和卟吩。由表2可知，泡菜中醇類物質(zhì)主要是丙二醇、甘油、肌醇、甘露醇和山梨醇。醇類是泡菜中重要的甜味物質(zhì)，丙二醇、甘油和甘露醇在鹵水泡菜中含量均高于接種發(fā)酵泡菜和自然發(fā)酵泡菜。有研究表明[16]，鹵水中除乳酸菌外還有豐富的酵母菌，蔬菜泡制初期酵母菌含量較少，隨著鹵水循環(huán)使用，酵母菌數(shù)量增多，可發(fā)酵泡菜中的碳水化合物產(chǎn)生一些醇類物質(zhì)，其中甘露醇是泡菜的特征性風(fēng)味物質(zhì)，具有清爽的甜味，主要由異型發(fā)酵菌株利用果糖產(chǎn)生[10]。

有機(jī)酸是泡菜中重要的呈酸滋味物質(zhì)，以乳酸最為重要，主要由乳酸菌代謝產(chǎn)生[17]。由表2可知，鹵水泡菜中乳酸含量最高，其次為接種發(fā)酵泡菜，自然發(fā)酵泡菜中乳酸含量最低。接種發(fā)酵泡菜中接種了腸膜明串珠菌和植物乳桿菌，腸膜明串珠菌可快速啟動發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸、乙酸等風(fēng)味物質(zhì)，植物乳桿菌作為同型發(fā)酵菌株在發(fā)酵中后期可以更快地利用泡菜中的營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)酸，這也與總酸質(zhì)量濃度的測定結(jié)果一致。此外，草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等賦予泡菜更柔和的酸味，草酸、蘋果酸和檸檬酸主要來自于蔬菜，一些乳酸菌可以代謝有機(jī)酸產(chǎn)生風(fēng)味成分[17]，如利用檸檬酸生成乙酸和草酰乙酸，草酰乙酸在酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為琥珀酸或乳酸。

泡菜中糖類物質(zhì)主要有果糖、塔格糖、葡萄糖和蔗糖，接種發(fā)酵泡菜中的果糖含量最高，鹵水泡菜中最少，塔格糖和葡萄糖在3種泡菜中的含量與果糖具有相同的規(guī)律。蔗糖在3種泡菜中的含量均較低，乳酸菌對蔗糖的利用主要是先通過透性酶或磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)將蔗糖轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而分解為葡萄糖和果糖被乳酸菌利用[8]。

由表2可知，從泡菜中共測出13種氨基酸。不同的氨基酸具有不同的風(fēng)味特征，如纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸具有甜味，蘇氨酸有甜鮮味，天門冬氨酸具有鮮酸風(fēng)味，而亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸具有苦味[18]。除亮氨酸外，其他氨基酸在鹵水泡菜中的含量均比其他2種泡菜高，這可能是鹵水泡菜風(fēng)味獨特的重要原因之一。泡菜中微生物(主要是乳酸菌)種類不同，一些乳酸菌可利用某些代謝途徑如脫羧反應(yīng)、轉(zhuǎn)氨反應(yīng)及裂解反應(yīng)生成酮類、醛類、酸類和醇類等對風(fēng)味形成有重要作用的物質(zhì)[19]。

表2 泡菜中非揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)的種類與含量

續(xù)表2

2.5 泡菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

采用SPME/GC-MS測定3種泡菜中的香氣物質(zhì)，共測得51種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中烯烴類物質(zhì)最多(11種)，其次為酯類(7種)、含硫化合物(7種)和酮類(6種)，此外還有酸類(5種)和醇類(5種)等。風(fēng)味物質(zhì)主要有3個來源，1是蔬菜本身(如蘿卜中的萜類物質(zhì)[20]和大蒜中的含硫化合物[21])；2是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生(如乙酸、乙醇、乙酸己酯等[22])；3是通過酵母菌等發(fā)酵產(chǎn)生[23]。香氣強(qiáng)度不僅與香氣物質(zhì)的含量有關(guān)，還與其閾值有關(guān)。利用氣味活度值(odor activity value, OAV)可較準(zhǔn)確地表征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的香氣強(qiáng)度，OAV>1的物質(zhì)稱為香氣活性物質(zhì)，且OAV值越大對整體香氣的貢獻(xiàn)度也越大。根據(jù)文獻(xiàn)[24-25]報道的閾值與GC-MS定量結(jié)果，計算OAV值，如表3所示，OAV>1的香氣物質(zhì)共有8種，分別為二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、檸檬烯、β-金合歡烯、2-壬酮、2-十一烷酮、芳樟醇和桉油精。

表3 不同泡菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量和香氣閾值

續(xù)表3

二甲基二硫醚和二甲基三硫醚是泡菜主要的香氣活性物質(zhì)，二甲基二硫醚在鹵水泡菜中含量最高，在接種發(fā)酵泡菜中最低，而二甲基三硫醚在自然發(fā)酵泡菜中含量最高，在鹵水泡菜中最低，這可能與泡菜中微生物區(qū)系有關(guān)。自然發(fā)酵泡菜依賴原料、器皿表面的微生物進(jìn)行發(fā)酵，除乳酸菌外，還存在其他雜菌；經(jīng)過長期的篩選作用，鹵水泡菜菌群相對穩(wěn)定；接種發(fā)酵泡菜中2種乳酸菌迅速成為優(yōu)勢菌群，抑制雜菌生長；這些微生物組成的差異造成對含硫化合物的代謝能力不同，使得3種泡菜中含量各不相同。二甲基三硫醚在所有香氣活性物質(zhì)中OAV值最高，表明該物質(zhì)是3種泡菜中對香氣強(qiáng)度貢獻(xiàn)度最大的化合物，與陳功[26]等研究結(jié)果一致。

檸檬烯具有柑橘香氣及檸檬香氣，在鹵水泡菜中的OAV值最高；β-金合歡烯具有香脂香氣，但其閾值較高，只在接種發(fā)酵泡菜中對風(fēng)味具有一定的貢獻(xiàn)，在其他2種泡菜中貢獻(xiàn)較低。2-壬酮和2-十一烷酮具有水果、花香等香氣，只在接種發(fā)酵泡菜中檢出。芳樟醇也是泡菜中重要的香氣活性物質(zhì)，具有綠茶清香與玫瑰花香，在3種泡菜中含量相差不大。桉油精是一種揮發(fā)性的萜類物質(zhì)，具有清涼的桉葉香氣，在接種發(fā)酵泡菜中含量最高。其他香氣物質(zhì)如酸類、酯類和部分醇類物質(zhì)，由于閾值過高或化合物含量較低，對泡菜風(fēng)味的影響很小。

這些對香氣強(qiáng)度貢獻(xiàn)較大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在接種發(fā)酵泡菜和鹵水泡菜中含量更高，其原因可能是自然發(fā)酵泡菜發(fā)酵速度慢，在96 h總酸質(zhì)量濃度才達(dá)到5 g/L，而鹵水泡菜和接種發(fā)酵泡菜發(fā)酵速度快，微生物代謝活動旺盛，香氣物質(zhì)可更快產(chǎn)生，響應(yīng)值更高。

3 結(jié)論

鹵水泡菜初始pH最低，在3.6左右，接種發(fā)酵泡菜在24 h內(nèi)pH降到3.5左右，且在24 h乳酸菌數(shù)達(dá)到最高，約108CFU/mL。在感官評價方面，接種發(fā)酵泡菜與鹵水泡菜間感官評價差異不顯著，評分均比自然發(fā)酵泡菜高，表明植物乳桿菌與腸膜明串珠菌復(fù)配發(fā)酵泡菜具有同鹵水泡菜一樣良好的品質(zhì)。

經(jīng)過GC-MS分析，鹵水泡菜中丙二醇、甘油和甘露醇等醇類物質(zhì)，氨基酸和乳酸含量更高，接種發(fā)酵泡菜中果糖、塔格糖和蔗糖等糖類物質(zhì)含量較高，自然發(fā)酵泡菜中非揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)的含量介于鹵水泡菜和接種發(fā)酵泡菜之間。

通過SPME/GC-MS分析，主要的香氣活性物質(zhì)共8種，分別為二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、檸檬烯、β-金合歡烯、2-壬酮、2-十一烷酮、芳樟醇和桉油精，其中二甲基三硫醚是3種泡菜中對香氣強(qiáng)度貢獻(xiàn)度最大的化合物。這些主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類在接種發(fā)酵泡菜中最豐富，但接種發(fā)酵泡菜與鹵水泡菜之間代謝物種類與含量存在差異的原因與機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。