利用一種新型三肽酶制備低苦味大豆低聚肽及其功能研究

吳文煜，周婧，宗紅，陸信曜，諸葛斌*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122)

大豆低聚肽是以大豆蛋白為原料，經(jīng)生物技術(shù)酶處理獲得的小分子肽[1]，具有抗氧化、抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)[2]、增強(qiáng)免疫、延遲衰老[3]等功效，同時由于其溶解性高且易于被人體吸收，常被用作優(yōu)良的食品保健原料。目前大豆肽的制備多采用單酶水解[2]，即利用堿性蛋白酶[3]對大豆蛋白進(jìn)行水解，但該法制備的大豆肽仍含有一些大分子多肽，不利于人體吸收，且具有一定的苦味，造成口感較差。目前有采用雙酶水解的方法制備大豆低聚肽，以進(jìn)一步降低分子質(zhì)量，減少多肽的苦味。何東平等[4]采用堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配，得到的大豆多肽分子質(zhì)量均低于1 kDa。SCHMIDT等[5]分別用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白后，再利用風(fēng)味蛋白酶進(jìn)一步水解，獲得了具有低致敏性和低苦味的大豆多肽，表明雙酶法能更好地改善大豆多肽的功能。

有研究顯示，大豆多肽苦味的主要物質(zhì)是2～10肽等疏水性小肽，富含疏水性殘基[6]。ZHU等[7]從醬油中制備純化苦味疏水性肽，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量越小，對口感的影響越大，并且從苦味成分中分離了多個3肽，均顯示苦味和澀味。因此，采用內(nèi)肽酶結(jié)合外肽酶共同水解大豆蛋白是降低大豆多肽分子質(zhì)量、苦味及改善多肽功能的有效方法。課題組前期研究獲得了一種新型的外肽酶——三肽酶[8]，能夠有效地切割三肽等小分子多肽，尤其對酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸等疏水性殘基特異性較強(qiáng)。本研究采用堿性蛋白酶和三肽酶雙酶法制備低苦味大豆低聚肽，并對其溶解性、苦味鮮味、抗氧化和抗ACE等功能方面進(jìn)行研究，探究三肽酶在大豆低聚肽制備中的潛在能力，為大豆蛋白深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要實驗材料

大豆分離蛋白由江蘇全盈生物技術(shù)有限公司提供；三氯乙酸、Na2HPO4和葡萄糖等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、堿性蛋白酶(200 000 U/g)，北京索萊寶科技有限公司；馬尿酸組胺酰亮氨酸(hippurate histamine leucine, HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme, ACE),Sigma公司。

1.1.2 主要實驗設(shè)備

DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；UV 2000型分光光度計，美國尤尼柯公司；TG16-WS型臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；F-7000 熒光分光光度計，日立高新技術(shù)公司；Waters-1525液相色譜儀，美國沃特公司；TS-5000Z味覺分析系統(tǒng)(電子舌)，日本INSENT公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三肽酶和大豆低聚肽的制備

三肽酶的制備：利用本實驗室構(gòu)建的1株三肽酶重組枯草芽孢桿菌WB600表達(dá)菌株[8]，將其在TB培養(yǎng)基中發(fā)酵表達(dá)，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)發(fā)酵20～24 h。發(fā)酵液通過鹽析，Ni柱純化后得到三肽酶。

對大豆分離蛋白進(jìn)行酶解處理，先用堿性蛋白酶酶解，酶解時間1 h；酶解溫度50 ℃；底物質(zhì)量濃度70 mg/mL；酶底物比[E/S] 4∶100(質(zhì)量比)，然后于95 ℃水浴滅酶，冷卻至室溫后，樣品凍干得到大豆多肽ASPI。相同堿性蛋白酶酶解條件，再加入三肽酶進(jìn)行2次酶解，酶解時間1 h；酶解溫度40 ℃；酶底物比[E/S] 4∶100得到的樣品凍干后保存，得到大豆低聚肽。

工藝流程：堿性蛋白酶酶解→三肽酶酶解→冷凍干燥→大豆低聚肽

1.2.2 大豆肽分子質(zhì)量測定

采用Waters 1525高效液相色譜儀測定，參考文獻(xiàn)[9]。

色譜條件：色譜柱為UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm×2 μm。

流動相：0.1 mol/L NaNO3；流速：0.9 mL/min；柱溫：45 ℃。

1.2.3 溶解性和水解度(degree of hydrolysis, DH)測定

溶解性：準(zhǔn)確稱取1 g蛋白樣品，100 mL容量瓶定容，pH 7.0，混合振蕩2 h，轉(zhuǎn)速3 000×g離心15 min，取上清液[10]。

(1)

水解度是指蛋白裂解的肽鍵數(shù)與總肽鍵的比例，使用鄰苯二甲醛o-phthalaldehyde，OPA)法[11]。按公式(2)計算：

(2)

式中：SerNH2，1 g大豆分離蛋白的氨基當(dāng)量，mmol；α，常數(shù)，0.97；β，常數(shù)，0.34；htot，常數(shù)，7.80。

1.2.4 大豆低聚肽電子舌分析與感官評價

采用電子舌[12]測定大豆多肽的苦味、鮮味，將各樣品溶液倒入電子舌的專用燒杯中，蒸餾水用作清潔溶劑。采樣時間約為180 s，測量后清潔2～3 min。每1 s收集1次樣品數(shù)據(jù)，并將測量值的平均值用作每個樣品1次測量的數(shù)據(jù)。為了減小測量誤差，將每個平行測量重復(fù)4次，去除第1數(shù)據(jù)，并且將測量3次的每個傳感器的平均值作為1個樣本數(shù)據(jù)，用于隨后的數(shù)據(jù)分析。

采用排序檢驗法[13]對樣品的苦味、鮮味進(jìn)行排序，將樣品按照苦味鮮味最強(qiáng)到最弱排序。感官評定小組由9位20～30歲的小組成員組成(4男5女)，這些小組成員都對苦味和鮮味有很好的辨別能力。感官評定溫度控制在室溫(25±2)℃，不同樣品間用清水漱口以恢復(fù)原感覺能力[14]。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定

取2 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的樣品加入2 mL質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的DPPH 無水乙醇溶液，混合均勻避光反應(yīng)30 min，測其在波長517 nm處的吸光值(Ai)[15-16]; 空白對照是用2 mL無水乙醇溶液代替DPPH溶液，操作同上，測得吸光度值為Aj； 用2 mL無水乙醇代替樣品作為參比，操作同上，測得吸光度值A(chǔ)0。根據(jù)公式(3)計算樣品的DPPH自由基清除率：

(3)

1.2.6 羥基自由基(·OH)清除能力測定

取2 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的樣品，加2 mL濃度為6 mmol/L的FeSO4和2 mL濃度為6 mmol/L的H2O2，混勻靜置10 min，然后再加2 mL濃度為6 mmol/L的水楊酸，混勻靜置30 min，在波長510 nm處測定吸光值為Ai[17]；將去離子水代替水楊酸測定的吸光值定為Aj；將去離子水代替樣品測定的吸光值定為A0。根據(jù)公式(4)計算樣品的羥基自由基清除率：

(4)

(5)

1.2.8 還原力測定

取2 mg/mL樣品溶液、0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 6.6)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液各2 mL充分混合，于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% 的三氯乙酸終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)速3 000×g離心10 min，取2 mL上清液，去離子水作對照組，分別加入2 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液，充分混合，在50 ℃水浴下保溫10 min。在波長700 nm處測定吸光度，以吸光度表征還原力。

1.2.9 ACE抑制活性測定

取25 μL樣品，加入125 μL的馬尿酸組胺酰亮氨酸溶液(5 mmol/L)，在37 ℃水浴鍋中孵育5 min，加入20 μL的ACE(0.1 U/mL)，在37 ℃孵育1 h，然后加入350 μL的HCl溶液(1 mol/L)以終止反應(yīng)。然后加入1.7 mL乙酸乙酯萃取產(chǎn)生的馬尿酸，振蕩30 s，在3 000×g的條件下離心5 min，然后取上層液1 mL 在120 ℃烘箱內(nèi)烘干，冷卻后加入1 mL去離子水溶解，超聲5 min，在波長228 nm處測吸光值，去離子水作為空白[19]。根據(jù)公式(6)計算樣品的ACE抑制率：

(6)

式中：A，空白組(用緩沖液替代樣品)的吸光度；B，樣品的吸光度；C，失活組(先加入HCl，后加入ACE)的吸光度。

1.2.10 游離氨基酸測定

采用氨基酸專用高效液相色譜儀測定，參考文獻(xiàn)[20]。

1.2.11 統(tǒng)計分析方法

對感官排序樣品進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用Friedman檢驗[21]計算出統(tǒng)計量F來分析樣品之間的顯著性差異,同時利用Kramer檢定法[21]對樣品進(jìn)行分組。根據(jù)公式(7)計算樣品的統(tǒng)計量F:

(7)

式中：j，評價員數(shù)；p，樣品數(shù)量；R1、R2、…、Rp，各樣品的秩和。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆低聚肽的溶解性和水解度

大豆蛋白的溶解性是對其加工利用的重要性能之一，可能還會對后續(xù)加工處理產(chǎn)生影響，所以溶解性也是其品質(zhì)的一種體現(xiàn)[22]。水解度可以從側(cè)面反映小分子肽含量及其功能活性的變化,如圖1所示。

圖1 SPI、ASPI和TASPI的溶解性和水解度分析

大豆分離蛋白(soy protein isolates, SPI)的溶解度為32.9%，堿性蛋白酶水解制備得到的大豆多肽(soybean peptides，ASPI)溶解度為50.3%，水解度為6.1%；堿性蛋白酶復(fù)配三肽酶水解得到的大豆低聚肽(soybean oligopeptide，TASPI)溶解度為80.6%，水解度為7.9%，與單酶水解相比，分別提高了60.4%和29.5%。這是由于三肽酶可以將堿性蛋白酶水解獲得的部分多肽進(jìn)一步水解，得到分子質(zhì)量更小的肽，從而水解度提高，而且這些小分子肽更易溶解，溶解性亦相應(yīng)提高[23]。以上結(jié)果表明,堿性蛋白酶和三肽酶復(fù)配水解大豆蛋白可以有效地提高其溶解性和水解度，有利于其在溶液中發(fā)揮它的功能性質(zhì)。

2.2 大豆低聚肽分子質(zhì)量分布及游離氨基酸組成分析

大豆蛋白分子質(zhì)量是評價大豆蛋白產(chǎn)品的關(guān)鍵指標(biāo)，小分子的物質(zhì)易被人體吸收。如圖2所示，SPI中95%均是>5 kDa的組分，小分子質(zhì)量的組分很低。TASPI中<1 kDa的組分占81.8%，與ASPI(58.1%)相比提高了23.7%，表明三肽酶雙酶法制備小分子多肽優(yōu)于單酶法。低聚肽的主要分子質(zhì)量區(qū)間是0.2～1 kDa，TASPI中此組分含量占69.3%，與ASPI的48.5%相比，提高了20.8%；<0.2 kDa的部分主要是游離氨基酸，ASPI占比是9.6%，TASPI占比是12.4%，提高了2.8%，這與三肽酶的性質(zhì)相關(guān)，作為外切酶會釋放游離氨基酸。綜上所述，結(jié)合三肽酶雙酶法較單酶法可以更好地提高小分子肽含量，會使更多的大分子蛋白水解成小分子物質(zhì)，含有更多的低聚肽能夠更易被人體吸收，有利于大豆多肽發(fā)揮功能。

圖2 SPI、ASPI和TASPI的分子質(zhì)量分布

由表1可以看出，TASPI中游離氨基酸含量顯著高于ASPI，這是由酶的性質(zhì)所決定的，堿性蛋白酶屬于內(nèi)切酶，可將長的肽鏈切割成小的肽段，釋放的游離氨基酸較少，而三肽酶屬于外肽酶，能夠切割末端的氨基酸，故TASPI中游離氨基酸含量較高，其中Arg、Glu、Gly、Tyr含量明顯提高，這與三肽酶的酶切特性一致。另外，TASPI中含有呈鮮味氨基酸[24](Glu、Asp、Gly、Ala)約5.67 g/100 g，占總游離氨基酸的47.4%，呈苦味氨基酸[24-25](Leu、Ile、Tyr、Phe)約2.77 g/100 g，占總游離氨基酸的23.0%，與ASPI相比，呈鮮味氨基酸含量提高了24.7%，呈苦味氨基酸含量降低了12.2%，由此可以看出，三肽酶水解后可降低大豆肽的苦味。

表1 SPI、ASPI和TASPI中的游離氨基酸含量 單位：g/100 g

2.3 大豆低聚肽苦味、鮮味測定

苦味和鮮味是大豆多肽產(chǎn)品味覺的重要指標(biāo)，利用電子舌技術(shù)將樣品的苦味和鮮味數(shù)據(jù)化，如圖3所示。

圖3 SPI、ASPI和TASPI的苦味、鮮味測定分析

ASPI的苦味值和鮮味值分別是12.4和14.6，TASPI苦味值和鮮味值分別是11.5和14.8，苦味值較ASPI降低7.3%，鮮味值提高1.4%，苦味和鮮味均比ASPI有所改善。

通過感官評定對樣品的苦味和鮮味進(jìn)行排序，表2是9位評價人員對3種樣品的苦味排序和鮮味排序，然后通過表3的樣品苦味的秩和R，使用Friedman檢驗[21]計算出統(tǒng)計量F=10.1，遠(yuǎn)大于檢驗近似臨界值8.66(顯著性水平α=0.01)，說明樣品之間存在非常顯著差異。用Kramer檢定法[21]對3個樣品分組，根據(jù)評價人數(shù)9和樣品數(shù)3，查閱《食品感官鑒評》[14]書中附表，得到秩和臨界值為12～24(α=0.01)，SPI的秩和12.5和ASPI的秩和16都在臨界值區(qū)間內(nèi)被劃分為一組，同組內(nèi)無顯著性差別，TASPI秩和25.5，大于臨界最大值24，TASPI單獨劃分一組，與其他樣品存在顯著性差異,由此得到結(jié)論,在0.01顯著水平上，TASPI苦味最低。同樣對于鮮味，通過表3鮮味的秩和，計算統(tǒng)計量F=12.3,也遠(yuǎn)大于檢驗近似臨界值8.66(顯著性水平α=0.01)，樣品之間也存在非常顯著差異。分組發(fā)現(xiàn)SPI單獨一組，ASPI和TASPI一組，2組存在顯著性差異。得到結(jié)論,在0.01顯著水平上，ASPI和TASPI鮮味最強(qiáng)，這與電子舌檢測結(jié)果一致。

表2 SPI、ASPI和TASPI的排序結(jié)果

表3 SPI、ASPI和TASPI苦味、鮮味的秩次和秩和

通過以上電子舌檢測和感官評定，結(jié)果表明，結(jié)合三肽酶的雙酶法可以有效降低大豆多肽的苦味，適用于制備低苦味的大豆功能肽。

2.4 大豆低聚肽抗氧化能力分析

圖4 SPI、ASPI和TASPI的抗氧化活性

從圖4-d可以看出，TASPI的還原能力最大，OD700值為0.94，比ASPI的OD700值0.77提高了22.1%。三肽酶可以進(jìn)一步酶解使長肽鏈斷裂成短肽產(chǎn)生H+增加了還原力，因此TASPI的還原能力會高于ASPI。

綜上結(jié)果表明，結(jié)合三肽酶雙酶水解制備的大豆低聚肽TASPI在抗氧化性能上明顯優(yōu)于單酶水解的ASPI，抗氧化性能顯著提升。

2.5 大豆低聚肽抗ACE能力分析

ACE通過催化血管緊張素 II(ANG II)的產(chǎn)生和抑制血管擴(kuò)張劑緩激肽活性，起到控制血壓的作用。ACE抑制率可以反映多肽的降血壓功能的效果[26]，如圖5所示，TASPI的ACE抑制率達(dá)到83.6%，有很強(qiáng)的ACE抑制效果，比ASPI的74.9%提高了11.6%。目前報道利用酶法制備的大豆ACE抑制肽的ACE抑制率在50%～80%，張焱[27]對比不同蛋白酶制備大豆多肽，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶制備的小于1 kDa的大豆多肽ACE抑制活性最高可以達(dá)到78.5%，于勝男等[28]利用堿性蛋白酶制備的大豆降血壓肽的ACE抑制率達(dá)到68.6%。

圖5 SPI、ASPI和TASPI的ACE抑制率

堿性蛋白酶結(jié)合三肽酶雙酶水解能夠提高大豆多肽的ACE抑制率，主要是和三肽酶的酶切特性有關(guān)，能特定地水解一些三肽等小肽產(chǎn)生二肽，而很多二肽均具有較好的ACE抑制率，例如GU等[29]采用RP-HPLC從醬油中分離純化出多種ACE 抑制肽，經(jīng)鑒定序列分別為Gly-Tyr、Ser-Tyr、Ala-Tyr、Val-Pro、Val-Gly、Gly-Trp、Ala-Ile、Ala-Phe、Ala-Trp這些二肽。綜上所述，堿性蛋白酶結(jié)合三肽酶雙酶法制備的大豆低聚肽具有良好的抗ACE效果。

3 結(jié)論