乳酸菌發(fā)酵對乳清蛋白藍(lán)莓果汁體系特性的影響

王文瓊，孫志勇，黃冬成，張杰龍，張志賢，李穎，顧瑞霞*

1(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225127) 2(江蘇乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(揚(yáng)州大學(xué))，江蘇 揚(yáng)州，225127) 3(黑龍江大三源乳品機(jī)械有限公司，黑龍江 哈爾濱，150069)

藍(lán)莓可以加工成果汁、飲料、果醬等產(chǎn)品，將藍(lán)莓與乳清蛋白混合，研制藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵飲料，具有藍(lán)莓和乳清蛋白的雙重營養(yǎng)保健功效，有很高的推廣價值和實(shí)際意義。藍(lán)莓漿中含有大量可溶性物質(zhì)和果膠物質(zhì)，但經(jīng)稀釋調(diào)配后其飲料體系內(nèi)所含的果膠物質(zhì)難以保證液相達(dá)到平衡狀態(tài)，在飲料貯藏和銷售過程中會出現(xiàn)沉淀和分層現(xiàn)象，同時藍(lán)莓中的花青素、多酚類物質(zhì)不穩(wěn)定，對光、溫度、pH等較敏感，影響其在加工貯藏過程感官特性及營養(yǎng)功能的變化。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓果汁經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，花青素含量提高15.38%，酶抑制能力和抗氧化能力顯著提高[1]。同時有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后果蔬制品的抗氧化能力顯著增強(qiáng)，這是由于乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠水解一些結(jié)合酚，釋放游離酚，提高其生物利用率，從而提高抗氧化能力。乳清蛋白經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后會產(chǎn)生大量的功能性多肽，具有抑制血管緊張轉(zhuǎn)化酶(angictensin converting enzyme, ACE)活性、抗氧化等功能。研究表明，蛋白質(zhì)對花色苷的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性具有一定的保護(hù)作用。近年來，有關(guān)多酚與蛋白質(zhì)相互作用的研究很多。蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)可以通過可逆的非共價鍵(如氫鍵、范德華力、π-鍵-疏水、離子)和不可逆共價鍵相互作用[2]。通過多酚與蛋白的相互作用，可改變蛋白結(jié)構(gòu)使其生物活性增加[3]。另外，花色苷在酸性條件下，能夠以黃烊鹽陽離子的穩(wěn)定形式存在。而當(dāng)pH逐漸升高，花色苷存在形式變?yōu)椴环€(wěn)定的查爾酮式，所以提高花色苷的穩(wěn)定性是目前需要解決的技術(shù)難題[4]。

本研究利用乳酸菌對乳清蛋白與藍(lán)莓果汁混合物進(jìn)行發(fā)酵，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酸，降低發(fā)酵體系pH，提高藍(lán)莓花色苷穩(wěn)定性，同時利用乳酸菌發(fā)酵作用促進(jìn)藍(lán)莓果漿中活性成分與乳清蛋白對接，產(chǎn)生蛋白-多酚和花色苷復(fù)合物，維持發(fā)酵體系穩(wěn)定。研究藍(lán)莓-乳清蛋白體系在嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌以及嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種(以下簡稱混合菌種)分別發(fā)酵24、36、48 h后體系的沉淀率、游離氨基含量、色度、pH、總酚、花色苷含量以及主要官能團(tuán)的變化，旨在以藍(lán)莓、乳清蛋白為原料，了解不同的乳酸菌對藍(lán)莓-乳清蛋白飲料體系特性的影響，開發(fā)高檔的發(fā)酵飲料, 從而為提高乳清的附加值提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品預(yù)處理

(1)原料的篩選：選擇果實(shí)飽滿，成熟的藍(lán)莓果(2018 成熟的大興安嶺野生藍(lán)莓51° 55′ N, 124°34′ E)，摘除果柄、枝葉，剔除病蟲害、變色、變質(zhì)等質(zhì)量不合格的藍(lán)莓果，并用清水清洗干凈。

(2)榨汁：將清洗干凈的藍(lán)莓果晾干，取晾干后的藍(lán)莓100 g，加水榨汁。

(3)過濾：將藍(lán)莓漿液先用200目紗布單層過濾，再用2層紗布過濾，收集濾液600 mL，分裝50 mL。

(4)調(diào)配：向過濾完的藍(lán)莓汁中加入去離子水，使得藍(lán)莓與水的比例為1∶5(g∶mL)。

(5)加入乳清粉：向調(diào)配液中加入60 g/L的乳清蛋白。

(6)加入60 g/L蔗糖。

(7)調(diào)pH：將樣品液pH調(diào)至7.0。

(8)滅菌：將配制成的藍(lán)莓乳清蛋白飲料置于95 ℃水浴鍋滅菌5 min。

(9)接菌發(fā)酵：接入保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌(上海昊岳食品科技有限公司提供)以及混合菌種(保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1)，接種量為2%(活菌數(shù)為7 lg CFU/mL)，樣品置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)。

1.2 色度分析

測定藍(lán)莓-乳清蛋白混合體系發(fā)酵24、36、48 h后顏色變化。使用Minolta Chroma Meter CR-400比色計(Minolta Ltd.，Milton Keynes，UK)。L*值表示亮度，a*值表示紅色-綠色，b*值表示黃色-藍(lán)色。將樣品裝入比色皿中并放置在白色校準(zhǔn)板(L*、a*、b*)的前面[5]。ΔL*、Δa*、Δb*均為發(fā)酵后的L*、a*、b*與發(fā)酵前的L*、a*、b*的差值。

1.3 沉淀率測定

精確量取配制的飲料于離心管中，3 500 r/min下離心5 min，棄去上層液體，測量離心率，確定沉淀率，根據(jù)斯托克原理，進(jìn)行蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測定，利用公式(1)計算沉淀物含量[6]。

(1)

1.4 游離氨基含量測定

采用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)方法，100 mL OPA試劑含：50 mL濃度為0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液，5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)溶液，80 mg OPA(溶于2 mL甲醇)，200 μL β-巰基乙醇。取樣品液100 μL和3 mL OPA試劑混合，室溫避光反應(yīng)5 min后，于340 nm處測其吸光值。以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制出L-亮氨酸濃度(0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 mmol/L)與吸光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，測定樣品的吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中的游離氨基濃度[7]。

1.5 總酚含量測定

采用福林-肖卡比色法。移取 0.3 mL 提取液于試管中，先加入 0.3 mL 福林酚試劑，充分混勻并靜置 5 min，加入 3 mL 75 g/L Na2CO3溶液，混勻后靜置 5 min，加 6.4 mL 去離子水定容至10 mL，50 ℃避光水浴 5 min，于波長750 nm 處測定吸光值。以沒食子酸(0.025～0.25 mg/mL)為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果用沒食子酸當(dāng)量表示(mg/100 g 提取樣)[8]。

1.6 花色苷含量測定

采用pH示差法。取1 mL提取液于2支試管中，分別用pH 1.0的KCl(0.025 mol/L)和pH 4.5的 CH3COONa (0.4 mol/L)緩沖液稀釋 6倍，平衡 20 min 后分別測定各稀釋樣液的A520 nm和A700 nm值，以去離子水作為空白調(diào)零，結(jié)果用矢車菊素-3-葡萄糖苷當(dāng)量表示(mg/100g 提取樣)[9]。

1.7 傅里葉紅外光譜分析

樣品冷凍干燥后，采用紅外光譜分析結(jié)構(gòu)變化。紅外光譜采用SPECTRUM ONE B FTIR spectrometer光譜譜儀(Thermo Electron Co.)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌對乳清蛋白藍(lán)莓果汁發(fā)酵體系色度的影響

由圖1可知，發(fā)酵24、36、48 h的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系ΔL*比相同條件下的乳清蛋白在發(fā)酵24、36、48 h的ΔL*增加，說明加入藍(lán)莓發(fā)酵后亮度增加。發(fā)酵后的藍(lán)莓-乳清蛋白液的Δa*顯著增加，說明紅度增加。而Δb*顯著降低(P<0.05)，表明黃度降低。接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵36 h時ΔL*與Δa*最高，Δb*在發(fā)酵24、36、48 h均小于0，而在24 h時達(dá)到最小，黃度顯著減少，而繼續(xù)發(fā)酵達(dá)到36 h時黃度增加，發(fā)酵48 h時黃度繼續(xù)增加，但黃度與發(fā)酵前相比顯著降低(P<0.05)，即顏色向藍(lán)色偏移，說明隨著發(fā)酵時間的延長，花色苷的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。研究顯示，花色苷的結(jié)構(gòu)在溶液介質(zhì)中隨著pH改變會有4種變化。這4種結(jié)構(gòu)變化在固定的 pH 值溶液介質(zhì)中存在著一定平衡關(guān)系：藍(lán)色或紫色的醌式(脫水)堿、無色的甲醇假堿和查爾酮、紅色的花烊正離子(AH+)[10]。即接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵48 h后花色苷的結(jié)構(gòu)向著藍(lán)色或紫色的醌式(脫水)堿方向轉(zhuǎn)化。另外，花色苷及多酚在發(fā)酵過程中結(jié)構(gòu)的變化也與乳清蛋白的相互作用有關(guān)。

1-乳清蛋白+嗜熱鏈球菌；2-乳清蛋白+保加利亞乳桿菌；3-乳清蛋白+嗜熱鏈球菌+保加利亞乳桿菌；4-乳清蛋白+藍(lán)莓+嗜熱鏈球菌；5-乳清蛋白+藍(lán)莓+保加利亞乳桿菌；6-乳清蛋白+藍(lán)莓+嗜熱鏈球菌+保加利亞乳桿菌 a-ΔL*;b-Δa*;c-Δb*

接入保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵36 h時，ΔL*顯著低于發(fā)酵24和48 h (P<0.05)，即發(fā)酵36 h藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系亮度顯著低于發(fā)酵24和48 h，而發(fā)酵24和48 h的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系亮度差異不顯著。在發(fā)酵24 h時Δa*值為11.59，紅度與發(fā)酵前相比顯著增加，發(fā)酵36 h時，Δa*值繼續(xù)增加，紅色繼續(xù)加深，發(fā)酵48 h時Δa*值達(dá)到14.21。Δb*在發(fā)酵24、36、48 h均小于0，而在36 h時達(dá)到最小，黃度顯著降低，而繼續(xù)發(fā)酵達(dá)到48 h時黃度顯著增加，但黃度與發(fā)酵前相比仍有顯著降低。接入混合菌種的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵36 h時，ΔL*值為20.26，顯著高于發(fā)酵24和48 h，即此時的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系色度最亮[11]。

2.2 藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系發(fā)酵過程中pH的變化

接種前樣品pH均調(diào)為7.0。由表1可知，經(jīng)嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、混合菌種分別發(fā)酵后，各樣品pH顯著降低。其中，接入嗜熱鏈球菌和接入混合菌種的藍(lán)莓-乳清蛋白飲料在發(fā)酵24 h與36、48 h的pH沒有顯著變化，而接入保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓乳清蛋白飲料在發(fā)酵24、36、48 h，pH顯著下降，原因是藍(lán)莓本身含有的多種有機(jī)酸在發(fā)酵的過程中不斷溶出，乳酸菌自身代謝產(chǎn)生大量的乳酸、蘋果酸等，使得pH不斷降低，隨著時間的延長，產(chǎn)酸量不斷積累，pH下降[12]。當(dāng)pH降至5.5時嗜熱鏈球菌的生長速率減慢[13]，從表1中看出，發(fā)酵至24 h，飲料的pH已降低趨于穩(wěn)定的4.12?；旌暇N發(fā)酵時，由于嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸較快，在發(fā)酵到24 h時，飲料的pH已降低趨于穩(wěn)定的4.21；而單一的保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸較慢，在發(fā)酵24 h后pH仍在顯著下降。當(dāng)發(fā)酵48 h時， pH與接種嗜熱鏈球菌的樣品差異不顯著(P>0.05)。

表1 藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系發(fā)酵過程中pH的變化

2.3 不同乳酸菌對藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系沉淀率的影響

由圖2可知，接入嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、混合菌種的乳清蛋白樣品和藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系都是在發(fā)酵36 h時沉淀率最高，發(fā)酵48 h時沉淀率最低。

1-乳清蛋白；2-乳清蛋白+藍(lán)莓；3-乳清蛋白+嗜熱鏈球菌；4-乳清蛋白+保加利亞乳桿菌；5-乳清蛋白+嗜熱鏈球菌+保加利亞乳桿菌；6-乳清蛋白+藍(lán)莓+嗜熱鏈球菌；7-乳清蛋白+藍(lán)莓+保加利亞乳桿菌；8-乳清蛋白+藍(lán)莓+嗜熱鏈球菌+保加利亞乳桿菌(下同)

多酚與蛋白質(zhì)可以發(fā)生不可逆的共價結(jié)合與可逆的非共價結(jié)合，部分結(jié)合物下沉形成沉淀，使得沉淀率提高。當(dāng)沉淀發(fā)生可逆反應(yīng)分解時，沉淀率重新降低，因此經(jīng)嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和混合菌種發(fā)酵的乳清蛋白樣品和藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系都是在發(fā)酵36 h時沉淀率升高，在48 h時又降低。

接種嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵24 h時沉淀率相比于發(fā)酵前顯著提高，發(fā)酵36 h時沉淀率繼續(xù)提高，發(fā)酵48 h時沉淀率顯著降低。接種保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵24 h時沉淀率相比于發(fā)酵前低，發(fā)酵36 h時沉淀率顯著提高，發(fā)酵48 h時沉淀率顯著降低，發(fā)酵48 h與發(fā)酵前相比沉淀率更低。接種混合菌種的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵24 h時沉淀率相比于發(fā)酵前低，發(fā)酵36 h時沉淀率顯著提高，發(fā)酵48 h時沉淀率顯著降低(P<0.05)。在發(fā)酵24、36、48 h時，接種保加利亞乳桿菌的樣品沉淀率比接種嗜熱鏈球菌和混合菌種都低，沉淀量降低約60%。乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生胞外多糖, 研究發(fā)現(xiàn)多糖會通過吸附多個蛋白使得蛋白間發(fā)生聚合甚至沉淀[14]。胞外多糖多聚物作為增稠劑、膠凝劑增加了藍(lán)莓-乳清蛋白飲料的黏度，乳酸菌飲料黏度越大,沉淀率明顯上升, 穩(wěn)定性顯著下降[15]。嗜熱鏈球菌所分泌的胞外多糖較多，而保加利亞乳桿菌所分泌的胞外多糖較少[16],但是保加利亞乳桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長和胞外多糖的分泌。另外，乳酸菌在發(fā)酵過程中可以將黃酮苷轉(zhuǎn)化為糖基配體，糖基配體可以與蛋白絡(luò)合形成沉淀[17]。混合菌發(fā)酵藍(lán)莓-乳清蛋白體系36 h時沉淀率最高，之后隨著蛋白質(zhì)的降解，沉淀率降低。因此，藍(lán)莓-乳清蛋白汁混合體系經(jīng)保加利亞乳桿菌發(fā)酵48 h時沉淀量最低，產(chǎn)品體系相對穩(wěn)定。

2.4 不同乳酸菌對藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系游離氨基含量的影響

由圖3可知，發(fā)酵48 h的游離氨基含量顯著高于發(fā)酵24和36 h。無論發(fā)酵24、36或48 h，乳清蛋白與藍(lán)莓果汁的混合樣品發(fā)酵后的游離氨基含量顯著高于不添加藍(lán)莓果汁的樣品，由于藍(lán)莓中含有蛋白質(zhì)，嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和混合菌種能夠?qū)⒌鞍姿?，使得游離氨基含量上升[18]。

圖3 不同乳酸菌對藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系游離氨基含量的影響

乳清蛋白或藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系，加入保加利亞乳桿菌發(fā)酵后產(chǎn)生的游離氨基含量顯著高于加入嗜熱鏈球菌和混合菌種(P<0.05)。目前研究顯示嗜熱乳桿菌CRL804、德氏乳桿菌保加利亞種CRL656和嗜熱鏈球菌CRL636以及它們的混合菌種發(fā)酵乳清濃縮蛋白，其中德氏乳桿菌保加利亞種CRL656表現(xiàn)出較高降解乳清蛋白的能力[19]，產(chǎn)生大量的游離氨基。藍(lán)莓的添加，對于乳清蛋白藍(lán)莓嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵體系中游離氨基含量影響較小。因此，藍(lán)莓的加入不影響對于乳清蛋白發(fā)酵體系中游離氨基變化。而保加利亞乳桿菌發(fā)酵體系中游離氨基含量高于嗜熱鏈球菌。

2.5 不同乳酸菌對藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系總酚及花色苷含量的影響

花色苷屬多酚類物質(zhì)，是一種水溶色素，以多糖形式出現(xiàn)， 花色苷具有黃酮類化合物的 C6—C3—C6碳結(jié)構(gòu)， 即 2個芳香環(huán)和 1個含氧雜環(huán)，它的配基花色素與各種糖結(jié)合形成不同的配糖體。多酚物質(zhì)具有廣泛的生物活性， 包括抗氧化、抗輻射、清除自由基、抗突變、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、促血管舒張、抗菌等作用[20]。

由圖4可知，接入保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系發(fā)酵24、36、48 h時，多酚含量都顯著高于接入嗜熱鏈球菌和混合菌種。接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵24 h時與發(fā)酵前相比，多酚含量無顯著差異，在發(fā)酵36 h時，多酚含量顯著降低，發(fā)酵48 h時多酚含量顯著上升，但含量仍低于發(fā)酵前。接入保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵24 h時與發(fā)酵前相比，多酚含量顯著增加，在發(fā)酵36 h時，多酚含量顯著降低，但含量仍高于發(fā)酵前，發(fā)酵48 h時多酚含量顯著上升。接入混合菌種的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系在發(fā)酵24 h時與發(fā)酵前相比，多酚含量降低，在發(fā)酵36 h時，多酚含量顯著降低，發(fā)酵48 h時多酚含量顯著上升，但含量仍低于發(fā)酵前。由圖2可知，在發(fā)酵36 h時，嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和混合菌種發(fā)酵后產(chǎn)生的沉淀相對于發(fā)酵24和48 h時多。蛋白質(zhì)與多酚相互作用會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水-親水性的相應(yīng)變化以及溶解度的改變[21]。由于多酚與蛋白質(zhì)會發(fā)生相互作用而產(chǎn)生沉淀，所以多酚含量降低。由圖3可知，發(fā)酵48 h時，蛋白質(zhì)水解，轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x氨基酸。多酚可與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，且相互作用較弱，而在某些外界條件下，可與鄰近的分子產(chǎn)生共價鍵結(jié)合[22]，因此蛋白質(zhì)與多酚結(jié)合的沉淀會出現(xiàn)分解，所以多酚含量在發(fā)酵48 h上升。由嗜熱鏈球菌發(fā)酵48 h時的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系花色苷含量小于發(fā)酵36 h時花色苷含量，發(fā)酵36 h時的乳清蛋白藍(lán)莓果汁發(fā)酵體系花色苷含量小于發(fā)酵24 h時花色苷含量。主要是隨著時間的推移，接入的嗜熱鏈球菌利用了藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系中的糖，使得體系含糖量降低，而相對較高的含糖量對花色苷有穩(wěn)定保護(hù)作用[23-24]，較高的糖濃度下，果汁的水份活度降低，進(jìn)而影響花色苷轉(zhuǎn)化為假堿式結(jié)構(gòu)的速率[25-26]。接入保加利亞乳桿菌發(fā)酵后的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系花色苷含量在36 h時達(dá)到最高。另外，在36 h時，藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系pH顯著下降(表1)， 而較低pH對花色苷有穩(wěn)定保護(hù)作用[27]。較低的水份活度及pH對花色苷有穩(wěn)定保護(hù)作用[28]。接入保加利亞乳桿菌發(fā)酵后的乳清蛋白藍(lán)莓果汁發(fā)酵體系花色苷含量在48 h時顯著下降，由于蔗糖被保加利亞乳桿菌利用含量變低，蔗糖對花色苷有穩(wěn)定保護(hù)作用，所以48 h時花色苷降低。蔗糖濃度增加，藍(lán)莓花色苷的穩(wěn)定性增強(qiáng)[29]。而混合菌種發(fā)酵后的乳清蛋白藍(lán)莓果汁發(fā)酵體系花色苷含量在發(fā)酵36 h時達(dá)到最低，因?yàn)楸＜永麃喨闂U菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長和胞外多糖的分泌，而保加利亞乳桿菌本身產(chǎn)生胞外多糖較少，嗜熱鏈球菌產(chǎn)生胞外多糖較多，乳酸菌胞外多糖能夠不同程度地降低花色苷含量[30]。

圖4 不同乳酸菌對藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系中總酚及花色苷的含量的影響

由此可見，保加利亞乳桿菌發(fā)酵藍(lán)莓-乳清蛋白體系24 h時，與混合菌種發(fā)酵24 h相比花色苷含量差異不顯著(P>0.05)，而發(fā)酵到36 h時，保加利亞乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵花色苷含量顯著高于混合菌種發(fā)酵(P<0.05)。因此，保加利亞乳桿菌發(fā)酵藍(lán)莓-乳清蛋白體系在36 h時有助于花色苷含量的保持。

2.6 FTIR結(jié)果分析

圖5 乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓-乳清蛋白體系紅外光譜變化

藍(lán)莓-乳清蛋白體系中有羥基、甲氧基等特征基團(tuán)，這些基團(tuán)也是花色苷類物質(zhì)的特征基團(tuán)。藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系中酰胺帶的峰形發(fā)生明顯變化，可能是花色苷類物質(zhì)與蛋白結(jié)合，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[31]。乳清蛋白在混合菌發(fā)酵后，酰胺鍵和羥基峰顯著增加，說明保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌有促進(jìn)乳清蛋白水解作用。乳清蛋白體系在加入藍(lán)莓后經(jīng)過混合菌發(fā)酵，酰胺鍵和羥基峰顯著降低，主要是蛋白的酰胺鍵和藍(lán)莓花色苷及多酚中的羥基發(fā)生相互作用導(dǎo)致。另外，由圖5可知，保加利亞乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵乳清蛋白藍(lán)莓體系，羥基峰顯著增加，再加入嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵后，羥基峰顯著降低。由此可知，保加利亞乳桿菌有促進(jìn)蛋白水解作用，而嗜熱鏈球菌有促進(jìn)乳清蛋白多肽與藍(lán)莓汁中花色苷及多酚類物質(zhì)結(jié)合的作用。

3 結(jié)論

本研究選用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及其混合菌種對藍(lán)莓-乳清蛋白混合體系進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中體系顏色產(chǎn)生明顯變化?；旌暇N發(fā)酵36 h后顏色變化最小，最接近于發(fā)酵前藍(lán)莓-乳清體系的紫紅色。單獨(dú)采用保加利亞乳桿菌發(fā)酵藍(lán)莓乳清蛋白體系48 h時產(chǎn)生的沉淀率最低，游離氨基含量最高。同時接種保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓-乳清體系中在發(fā)酵24 h時多酚含量最高。因此，藍(lán)莓-乳清蛋白體系中酚類化合物的穩(wěn)定性與發(fā)酵菌種和發(fā)酵時間相關(guān)。紅外光譜結(jié)果表明，經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后的藍(lán)莓-乳清蛋白發(fā)酵體系中酰胺帶的峰形發(fā)生明顯變化主要是藍(lán)莓-乳清發(fā)酵體系中花色苷類物質(zhì)與蛋白結(jié)合導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。綜合以上各因素，藍(lán)莓-乳清蛋白體系在保加利亞乳桿菌發(fā)酵24～48 h之間，有助于產(chǎn)品顏色、穩(wěn)定性和活性成分的保持。