大腸桿菌中三酶耦聯(lián)合成α-酮異戊酸

李雅婷，周麗，周哲敏

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

α-酮異戊酸(α-ketoisovalerate)在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1]。α-酮異戊酸鈣是α-酮酸片的主要成分之一，適用于慢性腎病患者[2-3]；在飼料里加入α-酮異戊酸能有效刺激家畜的肌肉生長(zhǎng)[4-5]；同時(shí)，α-酮異戊酸也是維生素B5的重要合成原材料[6]以及異丁醇合成過程中必不可少的中間體[7]。

目前，通過化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法可合成α-酮異戊酸，其中又以化學(xué)合成法較為常見。然而，化學(xué)合成法工藝繁瑣且反應(yīng)條件嚴(yán)苛，伴隨有毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生，不適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[8]。生物轉(zhuǎn)化法以L-纈氨酸為底物在氨基酸脫氨酶和氨基酸氧化酶的催化下轉(zhuǎn)化為α-酮異戊酸[9]。利用氨基酸氧化酶法產(chǎn)α-酮酸在我國(guó)已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。然而，酶轉(zhuǎn)化法的效率較低，且反應(yīng)過程中會(huì)有H2O2的生成，且難以除去[10-12]。利用發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮異戊酸可以有效地消除有毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生且成本更低，更利于環(huán)保。目前利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-酮異戊酸的研究很少，所報(bào)道的大多數(shù)是利用谷氨酸棒桿菌為宿主菌進(jìn)行α-酮異戊酸的發(fā)酵積累[13-15]。

在生物體中從頭合成α-酮異戊酸，必須共同表達(dá)多個(gè)關(guān)鍵酶。各酶在細(xì)胞內(nèi)的均衡高效表達(dá)可使催化過程更協(xié)調(diào)，有利于促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成，因此選擇合適的共表達(dá)策略至關(guān)重要。目前在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)多酶共表達(dá)的策略主要有2種，包括多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和多順反子系統(tǒng)[16]。多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將基因分別置于不同的質(zhì)粒中進(jìn)行共同表達(dá)，因此表達(dá)基因的數(shù)量受到篩選標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)的可相容性等因素的限制，且有研究表明多個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化后有的基因并沒有表達(dá)[17]。同時(shí)，多順反子系統(tǒng)將多個(gè)基因置于同一質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)，存在基因的排列順序影響其表達(dá)水平的問題[18]。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用多順反子載體在一個(gè)啟動(dòng)子下游共表達(dá)2個(gè)基因，啟動(dòng)子后面第2個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯弱于啟動(dòng)子后第1個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)[19]，為了解決這一問題，當(dāng)需要控制不同基因的轉(zhuǎn)錄水平時(shí)，可以給每個(gè)基因添加獨(dú)立的啟動(dòng)子，使每個(gè)基因都可以獨(dú)立轉(zhuǎn)錄[20]，同時(shí)也可以通過調(diào)節(jié)基因在質(zhì)粒上的不同順序，平衡各個(gè)基因的表達(dá)水平。此外，不同的終止子對(duì)于mRNA的量有很大影響，并且終止子的效率與mRNA的量有一定的相關(guān)性[21]。添加有效的終止子也可以幫助基因進(jìn)行正確的轉(zhuǎn)錄，以促進(jìn)蛋白質(zhì)的高效均衡表達(dá)[22]。

本研究通過克隆枯草芽孢桿菌來(lái)源的乙酰乳酸合成酶基因BsalsS、大腸桿菌來(lái)源的乙酰乳酸異構(gòu)還原酶基因EcilvC和二羥基酸脫水酶基因EcilvD，構(gòu)建了1株三酶串聯(lián)表達(dá)合成α-酮異戊酸的重組大腸桿菌。通過調(diào)整基因的排列順序、添加終止子等策略，對(duì)多個(gè)酶的平衡表達(dá)進(jìn)行了調(diào)節(jié)，經(jīng)體外轉(zhuǎn)化測(cè)定，篩選出1株最優(yōu)的重組菌，并實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵合成α-酮異戊酸，為以大腸桿菌為宿主生產(chǎn)α-酮異戊酸及其衍生物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

菌株E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α、E.coliMG1655、B.subtilis168，質(zhì)粒pETDuet-1由本實(shí)驗(yàn)室保藏，質(zhì)粒pUC-Term由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。本研究所用引物見表1，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 本研究所用引物

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

Prime Star max DNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Quick CutBamH I、HindIII、EcoR I、SacI、NotI、DNA Marker、Protein Marker(Broad)，寶生物工程(大連)公司；質(zhì)粒提取試劑盒、純化試劑盒、抗生素、IPTG、丙酮酸鈉，生工生物工程(上海)股份有限公司；α-酮異戊酸，sigma。其他試劑為國(guó)藥試劑。

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

2YT培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨16，酵母粉10，NaCl 5。

M9-2培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO46, KH2PO43, NaCl 0.3，NH4Cl 1，酵母粉5，葡萄糖36，MgSO42 mmol/L,微量元素0.1%(體積分?jǐn)?shù))。

微量元素(g/L): FeSO4·7H2O 10.0，CuSO4·5H2O 3.0，MnSO4·4H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 5.25，(NH4)Mo7O240.1，Na2B4O7·10H2O 0.2，CaCl22.0，溶于 1 mol/L HCl 溶液中。

1.3 主要儀器

PCR儀、凝膠成像儀、蛋白電泳儀，BIO-RAD公司；UV-1 800 PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)有限公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；生物傳感儀，山東省科學(xué)院；高效液相色譜儀，日立(HITACHI)公司；Prevail Organic Acid 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),美國(guó)奧泰公司。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 不同基因順序質(zhì)粒的構(gòu)建

分別以B.subtilis168基因組、E.coliMG1655基因組為模板，以表1中P1+P2、P13+P14、P25+P26為上下游引物，克隆基因BsalsS、EcilvC、EcilvD。將質(zhì)粒pETDuet-1與克隆基因用表1中對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切后，利用T4 DNA連接酶在16 ℃進(jìn)行過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，測(cè)序后得到重組質(zhì)粒pET-BsalsS、pET-EcilvC、pET-EcilvD。分別以pET-BsalsS、pET-EcilvC、pET-EcilvD為模板，以表1中P3+P4、P15+P16、P27+P28為上下游引物，克隆片段PT7-BsalsS、PT7-EcilvC、PT7-EcilvD。將質(zhì)粒pET-BsalsS與PT7-EcilvD用對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切后連接，得到重組質(zhì)粒pET-BsalsS-EcilvD。同樣的方法可得到重組質(zhì)粒pET-EcilvC-BsalsS、pET-EcilvC-EcilvD、pET-EcilvD-BsalsS、pET-EcilvD-EcilvC。分別以表1中P5+P6、P7+P8為上下游引物，以B.subtilis168基因組、質(zhì)粒pET-EcilvC-EcilvD/pET-EcilvD-EcilvC為模板，獲得片段BsalsS與質(zhì)粒骨架后進(jìn)行吉布森組裝，得到重組質(zhì)粒pCDS、pDCS。分別以表1中P17+P18、P19+P20為上下游引物，以E.coliMG1655基因組、質(zhì)粒pET-BsalsS-EcilvD/pET-EcilvD-BsalsS為模板，獲得片段EcilvC與質(zhì)粒骨架后進(jìn)行吉布森組裝，得到重組質(zhì)粒pSDC、pDSC。分別以表1中P29+P30、P31+P32為上下游引物，以E.coliMG1655基因組、質(zhì)粒 pET-EcilvC-BsalsS為模板，獲得片段EcilvD與質(zhì)粒骨架后進(jìn)行吉布森組裝，得到重組質(zhì)粒pCSD。各質(zhì)?；蚺帕许樞蛉鐖D1所示。

圖1 不同基因排列次序的共表達(dá)策略

1.4.2 基因終止子的添加

分別以質(zhì)粒pUC-Term、pCSD為模板，以表1中P21+P22、P23+P24為上下游引物，獲得片段EcilvC-Term與質(zhì)粒骨架后進(jìn)行吉布森組裝，得到重組質(zhì)粒pCTSDT。分別以質(zhì)粒pUC-Term、pCTSDT為模板，以表1中P9+P10、P11+P12為上下游引物，獲得片段BsalsS-Term與質(zhì)粒骨架后進(jìn)行吉布森組裝，得到重組質(zhì)粒pCTSTDT(圖2)。

圖2 基因終止子添加策略

將重組質(zhì)粒pET-BsalsS、pET-EcilvC、pET-EcilvD、pSDC、pCSD、pCDS、pDSC、pDCS、pCTSDT、pCTSTDT分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌S、C、D、SDC、CSD、CDS、DSC、DCS、CTSDT、CTSTDT。保存至-80 ℃冰箱中。

1.5 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及最優(yōu)菌株篩選

將保存至-80 ℃冰箱的重組菌株在含有100 μg/mL氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，挑取單菌落接種于含有100 μg/mL氨芐抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，按照體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接至含有100 μg/mL氨芐抗生素的50 mL 2YT培養(yǎng)基中，與37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為30 ℃，誘導(dǎo)20 h后收集菌體。

離心收集菌體，調(diào)節(jié)菌體濃度OD600為40，用pH 7.0的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液重懸菌體后進(jìn)行超聲破碎得粗酶液。將粗酶液統(tǒng)一稀釋8倍，利用Bradford法進(jìn)行粗酶液的蛋白濃度測(cè)定并利用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達(dá)情況。

體外轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系為1 mL，其中含有100 μL粗酶液，50 μL 1 mol/L丙酮酸鈉，10 μL TPP，10 μL NADPH，剩下的液體用pH 7.0的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足。置于30 ℃金屬浴中反應(yīng)30 min后，于100 ℃煮沸10 min滅活，離心取上清液，檢測(cè)上清液中產(chǎn)物α-酮異戊酸的含量。

1.6 α-酮異戊酸的檢測(cè)

α-酮異戊酸的HPLC檢測(cè)條件[23]：色譜柱Prevail Organic Acid，流動(dòng)相為pH 2.5、25 mmol/L的KH2PO4溶液，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 AlsS、IlvC、IlvD三酶耦聯(lián)表達(dá)體系的構(gòu)建

以B.subtilis168基因組為模板克隆目的基因BsalsS，以E.coliMG1655基因組為模板分別克隆EcilvC、EcilvD基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，目的條帶大小與理論值相符。電泳結(jié)果如圖3所示。

M-標(biāo)準(zhǔn)DNA;1-BsalsS;2-EcilvC;3-EcilvD

對(duì)重組菌S、C、D、SDC進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳(圖4)表明當(dāng)3個(gè)基因分別單獨(dú)表達(dá)時(shí)，均能獲得明顯條帶；而當(dāng)3個(gè)基因串聯(lián)表達(dá)時(shí)，3個(gè)蛋白表達(dá)量均有明顯的下降，且AlsS與IlvD大小相近，在SDS-PAGE電泳中并不能明顯地分開，IlvC由于在串聯(lián)體系的最末尾，表達(dá)量極低。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 1-對(duì)照; 2-S; 3-C; 4-D; 5-SDC

對(duì)于多基因的共表達(dá)，通常需要選擇合適的共表達(dá)策略。KIM等[19]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)1個(gè)啟動(dòng)子下游共表達(dá)2個(gè)以上的目的基因時(shí)，緊跟在啟動(dòng)子后面的基因表達(dá)水平明顯高于遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的基因表達(dá)水平，這可能是由于遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)錄不完全而引起的。同時(shí)，PERRAKIS等[24]通過對(duì)多種基因共表達(dá)的研究表明，共表達(dá)的多個(gè)基因的DNA序列大小和組成也可能影響基因的表達(dá)水平。因此，基因順序的不同對(duì)于多基因是否能夠均衡表達(dá)有著相當(dāng)關(guān)鍵的作用。接下來(lái)針對(duì)3個(gè)基因排列順序進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 不同基因排列順序?qū)θ副磉_(dá)水平與催化性能的影響

對(duì)重組菌SDC、CSD、CDS、DSC、DCS進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)其蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，并以丙酮酸鈉為底物進(jìn)行反應(yīng)并測(cè)定產(chǎn)物α-酮異戊酸的合成水平，結(jié)果如圖5所示。

a-不同基因順序蛋白表達(dá)；b-不同基因順序蛋白濃度測(cè)定;c-不同基因順序α-酮異戊酸催化合成 1-對(duì)照; 2-SDC;3-DSC; 4-DCS; 5-CSD; 6-CDS

由SDS-PAGE圖(圖5-a)可以看出，重組菌CSD蛋白表達(dá)總量有明顯提升，且對(duì)粗酶液中的總蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，也初步論證了這一點(diǎn)(圖5-b)。如圖5-c所示，重組菌CSD催化底物丙酮酸鈉生成0.40 g/L α-酮異戊酸，比優(yōu)化前菌株SDC產(chǎn)量提高42.86 %。因此，基因在載體上的順序在很大程度上影響基因的表達(dá)及催化效率，這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道[19]相符。選擇重組菌株CSD作為后續(xù)研究菌株。

雖然經(jīng)過基因順序優(yōu)化之后，產(chǎn)量有了明顯的提升，但是其總產(chǎn)量卻仍然很低，猜測(cè)多基因串聯(lián)在表達(dá)水平上彼此存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，雖然已經(jīng)盡量對(duì)多基因的表達(dá)進(jìn)行協(xié)調(diào)，但還是存在轉(zhuǎn)錄水平不完全、表達(dá)不均衡等問題。針對(duì)這個(gè)問題，我們決定對(duì)表達(dá)較弱的相關(guān)基因通過添加終止子的策略進(jìn)行完整的表達(dá)體系構(gòu)建。

2.3 添加終止子對(duì)三酶表達(dá)水平與催化性能的影響

對(duì)重組菌CTSDT、CTSTDT進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。比較添加不同終止子的蛋白表達(dá)效果及體外轉(zhuǎn)化效率， SDS-PAGE圖(圖6-a)及粗酶液的蛋白濃度測(cè)定(圖6-b)結(jié)果顯示，添加了終止子后，重組菌CTSDT的蛋白總量有了明顯的提升。體外轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖6-c所示，當(dāng)EcilvC添加終止子，α-酮異戊酸產(chǎn)量有了明顯提升，為0.91 g/L，對(duì)比未加終止子前的0.40 g/L，α-酮異戊酸產(chǎn)量提高了1.28倍。

a-添加終止子蛋白表達(dá); b-蛋白濃度測(cè)定;c-添加終止子α-酮異戊酸催化合成 1-對(duì)照; 2-CSD; 3-CTSDT; 4-CTSTDT

通過添加終止子策略對(duì)基因?qū)崿F(xiàn)精細(xì)化調(diào)控是較為常見的調(diào)控手段。WANG等[22]通過對(duì)266種終止子轉(zhuǎn)錄效率的研究表明，添加有效的終止子可以幫助基因進(jìn)行正確的轉(zhuǎn)錄，形成更加穩(wěn)定的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的精細(xì)化調(diào)控。MAIRHOFER等[25]通過在E.coli中添加不同的T7終止子組合，有效地提高了終止子的終止效率。本研究中由于基因EcilvC表達(dá)量不高，通過添加了終止子提高其終止效率，轉(zhuǎn)錄形成更多正確的mRNA，從而有效地提高了產(chǎn)物α-酮異戊酸的產(chǎn)量。于是，選擇重組菌株CTSDT作為后續(xù)的研究菌株。

2.4 α-酮異戊酸發(fā)酵合成

利用體外粗酶液轉(zhuǎn)化需要外源添加輔酶TPP與NADPH，操作繁瑣且成本較高，而通過發(fā)酵法利用菌體自身代謝實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物α-酮異戊酸的積累是一個(gè)較為簡(jiǎn)單且有效的方法。于是，在質(zhì)粒構(gòu)建優(yōu)化完成后，我們利用M9-2培養(yǎng)基，對(duì)重組菌株CTSDT進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證。在發(fā)酵過程中，每間隔4 h進(jìn)行取樣并同時(shí)調(diào)節(jié)pH在7左右。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)發(fā)酵16 h時(shí)，α-酮異戊酸的產(chǎn)量達(dá)到1.70 g/L，與未經(jīng)過改造的重組菌SDC相比較，提升了3.36倍。而在接下來(lái)的培養(yǎng)過程中，α-酮異戊酸產(chǎn)量有所下降，因?yàn)棣?酮異戊酸是多條代謝途徑的中間產(chǎn)物[26]，猜測(cè)可能是α-酮異戊酸在體內(nèi)被進(jìn)一步消耗生成其他代謝物。

圖7 重組菌發(fā)酵合成α-酮異戊酸驗(yàn)證

利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-酮異戊酸，與傳統(tǒng)的酶法轉(zhuǎn)化氨基酸生產(chǎn)α-酮異戊酸相比，具有更加綠色環(huán)保且高效等優(yōu)點(diǎn)。LI等[12]通過酶法轉(zhuǎn)化L-纈氨酸生成α-酮異戊酸，反應(yīng)16 h僅生成0.56 g/L α-酮異戊酸，本研究?jī)H通過優(yōu)化了關(guān)鍵代謝途徑的基因表達(dá)，利用大腸桿菌發(fā)酵16 h可生成1.70 g/L α-酮異戊酸，極大地提高了產(chǎn)物的產(chǎn)量，且發(fā)酵過程中不會(huì)產(chǎn)生H2O2等毒副產(chǎn)物，方便后續(xù)提取分離。

3 結(jié)論

本研究通過克隆α-酮異戊酸合成過程的3種基因，在大腸桿菌體內(nèi)過表達(dá)了該途徑。通過優(yōu)化3個(gè)基因的排列順序和終止子添加方式，獲得了最優(yōu)菌株CTSDT。重組菌株CTSDT體外催化合成α-酮異戊酸水平為0.91 g/L；以葡萄糖為碳源發(fā)酵16 h 可獲得1.70 g/L α-酮異戊酸，比未優(yōu)化前的菌株SDC產(chǎn)量提高了3.36倍。在接下來(lái)的研究中，將嘗試敲除α-酮異戊酸的進(jìn)一步消耗途徑基因，如ilvE、panB等，以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物α-酮異戊酸的高效發(fā)酵合成。本研究實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮異戊酸，為大腸桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮異戊酸提供了研究思路。