耐熱白樺莖葉高效再生體系的建立

黃曉旭

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院，河北 保定071001）

白樺（Betula platyphylla）為樺樹(shù)科、樺樹(shù)屬落葉喬木。高海拔樹(shù)種，是荒山荒地、采伐跡地和火燒跡地的先鋒樹(shù)種，是溫帶闊葉林和闊葉混交林的主要樹(shù)種，具有耐寒性強(qiáng)、適應(yīng)性好、生長(zhǎng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，姿態(tài)瀟灑、樹(shù)干通直、樹(shù)皮潔白雅致、枝葉扶疏，秋葉金黃，引人注目[1-2]。耐熱白樺（Heat-resistant Betula platyphylla）是白樺的一個(gè)耐熱型品種，由東北林業(yè)大學(xué)利用歐洲白樺和黑龍江白樺雜交而得，通過(guò)由北京市園林科研所、北京七彩園林工程有限公司等單位引種證明，耐熱白樺可以在北京生長(zhǎng)良好[3]。近幾十年來(lái)，樺木屬植物的組織培養(yǎng)研究取得了較大的進(jìn)展，關(guān)于白樺、光皮樺、歐洲白樺、歐洲垂枝樺、西南樺等的植株再生研究相繼得到報(bào)道[4]。例如，東北林業(yè)大學(xué)在1998年就開(kāi)展白樺組織培養(yǎng)再生體系的研究；Leena 等人對(duì)垂枝樺（Betula pendula）組織低溫保存后的再生植株與原植物的遺傳保真度進(jìn)行了比較[5]；Lu-Min VAARIO 等人開(kāi)展日本樺樹(shù)組培體系的研究[6]；黑龍江省林產(chǎn)工業(yè)研究所于2018年展開(kāi)了沼澤小葉樺（Betula microphylla Bunge var.paludosa）的研究[7]。但國(guó)內(nèi)關(guān)于耐熱型白樺組織培養(yǎng)快繁育苗的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中利用植物組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行耐熱白樺苗木快速繁殖的研究，獲得了完整的再生植株，并實(shí)現(xiàn)了再生植株的移栽，對(duì)于推動(dòng)耐熱白樺在華北地區(qū)的應(yīng)用，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料為河北省林業(yè)和草原科學(xué)研究院栽植的耐熱白樺3年生苗木，引種于山東。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體選擇

外植體選取生長(zhǎng)正常、無(wú)病蟲(chóng)害的耐熱白樺幼葉和莖段。

1.2.1 外植體消毒

先用75%的酒精，分別浸泡20s、30s、40s，以無(wú)菌水沖洗2～3 次；再用2%次氯酸鈉溶液分別浸泡8min、9min、10min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5 次。培養(yǎng)后隨時(shí)統(tǒng)計(jì)污染情況，培養(yǎng)20 d 統(tǒng)計(jì)存活率。

1.2.2 分化培養(yǎng)

采用MS、和WPM 作為基本分化培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的6-BA 和IBA。培養(yǎng)條件：溫度24 ℃，室內(nèi)相對(duì)濕度30%，每天16 h（6：00－22：00）光照培養(yǎng)。接種后觀察愈傷組織增殖和生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)第25 d 統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù)。具體培養(yǎng)基見(jiàn)表1。

表1 耐熱白樺分化培養(yǎng)基類(lèi)型和激素配比

1.2.3 生根培養(yǎng)

采用1/2MS、MS 和WPM 作為基本分化培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的IBA，接種后觀察生根情況，培養(yǎng)第20d 統(tǒng)計(jì)生根條數(shù)。具體培養(yǎng)基見(jiàn)表2。

表2 耐熱白樺生根培養(yǎng)基類(lèi)型和激素濃度

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)匯總后，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析、方差等分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 外植體最佳消毒方法

由表3 可見(jiàn)，酒精處理時(shí)間對(duì)組培苗褐化的影響較大，其中，浸泡20s、30s 的褐化率沒(méi)有顯著差異，處理40s，葉子褐化率顯著增大；次氯酸鈉處理時(shí)間，則對(duì)組培苗長(zhǎng)菌率影響較大，浸泡8min、9min 的處理結(jié)果沒(méi)有顯著差異，浸泡10min 的葉子生菌率大大降低。因此，最佳耐熱白樺的外植體消毒以浸泡75%酒精溶液中30s，無(wú)菌水沖洗2～3 次，再用2%次氯酸鈉溶液浸泡10min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5 次為宜。

表3 外植體消毒處理結(jié)果

2.2 分化培養(yǎng)基篩選

表4 分化培養(yǎng)基篩選結(jié)果

葉片分化效率最高的培養(yǎng)基為：wpm+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，分化效率達(dá)94%（表4），葉片5 天開(kāi)始膨大形成愈傷組織，25 天左右分化出叢生芽；莖段最佳分化培養(yǎng)基為：MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，分化效率達(dá)92%，7 天開(kāi)始膨大形成愈傷組織，25 天左右分化出叢生芽。

2.3 生根培養(yǎng)基篩選

再生芽長(zhǎng)至1cm 左右時(shí)接種至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。耐熱白樺初代生根選用1/2ms+0.2 mg/L IBA 培養(yǎng)基最好，接種后5 d 開(kāi)始生根，生根率96.7%，繼代生根用wpm+0.3 mg/L IBA 培養(yǎng)基最好，接種后7 d開(kāi)始生根，生根率100%。

表5 生根培養(yǎng)基篩選結(jié)果

3 結(jié)論與討論

在植物器官離體組織培養(yǎng)的條件下，不同植物組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不同，甚至同一植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不同[5]。培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是植物組織培養(yǎng)能否獲得成功的重要因素之一[6]。本研究從外植體消毒、分化培養(yǎng)基的篩選、生根培養(yǎng)基的篩選三個(gè)方面，試驗(yàn)總結(jié)出耐熱白樺最優(yōu)組織培養(yǎng)步驟，即：外植體浸泡于75%酒精溶液中30s，以無(wú)菌水沖洗2～3 次，再用2%次氯酸鈉溶液浸泡10min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5 次；葉片分化培養(yǎng)基選擇WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，莖段分化培養(yǎng)基選擇MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA；生根培養(yǎng)基最佳選擇為：初代生根用1/2MS+0.2 mg/L IBA 培養(yǎng)基最好，繼代生根用WPM+0.3 mg/L IBA 培養(yǎng)基。

組織培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)發(fā)生基因大片段丟失的情況，這也是創(chuàng)制新種質(zhì)的方法。在本次試驗(yàn)中，耐熱白樺的組培苗出現(xiàn)了花葉、白化葉突變體，因漲勢(shì)較弱未能成功轉(zhuǎn)化為白樺新品系，但此突變材料可作為直接研究色素代謝，光合作用以及激素合成等通路分子機(jī)理的重要植物材料。項(xiàng)目組下一步工作重點(diǎn)將以此為出發(fā)點(diǎn)，著重開(kāi)展利用組織培養(yǎng)創(chuàng)制白樺新種質(zhì)的工作。