LGALS1對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒在Marc-145中復(fù)制的影響

崔一龍，石 蕓，薛江東，2，馬德慧，2*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)肉牛疾病防控工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028042)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome ，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙和新生仔豬呼吸道疾病為典型癥狀并導(dǎo)致高死亡率的傳染病[1]。PRSSV屬于尼多病毒目(nidovirales)動(dòng)脈炎病毒科(arteriviridae)動(dòng)脈炎病毒屬(arteriviers)[2]。病毒基因組大小約為15 kb，包括10個(gè)開(kāi)放性閱讀框(ORFs)。2b蛋白由ORF2b編碼，相對(duì)分子質(zhì)量約為8 000，由73個(gè)氨基酸組成[3]。2b蛋白是一種較小的PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白，目前對(duì)其功能的研究相對(duì)其他蛋白較少。LEE等[4]試驗(yàn)證明，2b蛋白在PRRSV的復(fù)制和感染細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)構(gòu)建含有PRRSV 2b蛋白的釣餌菌株與豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)cDNA文庫(kù)進(jìn)行酵母雙雜交，篩選到了與2b蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白LGALS1。

LGALS1歸屬于動(dòng)物凝集素家族，是一類能夠與糖蛋白或聚乳糖胺中β-半乳糖殘基相結(jié)合的蛋白質(zhì)。目前哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)15種該家族成員，依據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同分為原型、嵌合型和串聯(lián)重復(fù)型3類，但是它們的氨基酸序列同源性很高，都包含至少1個(gè)糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CRD，carbohydrate-recognition domain)，用以與N-或O-糖鏈相互作用[5]。LGAL-S1歸屬于原型，常以單體和非共價(jià)結(jié)合的兩種同源二聚體形式存在，廣泛的分布在動(dòng)物心臟、肺臟、脾臟、腦、淋巴結(jié)等組織器官中，在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中也廣泛存在。LGALS1雖然是典型的胞漿蛋白，但是在細(xì)胞核內(nèi)、細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)也有表達(dá)，在細(xì)胞黏附、增殖、凋亡、免疫反應(yīng)、腫瘤的病理反應(yīng)等過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[6]。很多與LGALS1相互作用的分子已經(jīng)相繼被發(fā)現(xiàn)[7]。在黑素瘤細(xì)胞中，LGALS1可以介導(dǎo)同型腫瘤細(xì)胞的聚集[8]；在結(jié)腸癌細(xì)胞中，LGALS1可以與細(xì)胞表面的CD44和CD326等粘附相關(guān)因子發(fā)生作用[9]；在肺癌細(xì)胞荷瘤小鼠的腫瘤組織中，LGALS1表達(dá)量明顯變高并且可以促進(jìn)腫瘤增殖[10]；將LGALS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞后可以明顯促進(jìn)腫瘤增殖[11]；外源性LGALS1也可以明顯促進(jìn)卵巢癌和胰腺癌細(xì)胞的增殖[12]；使用LGALS1 siRNA抑制其表達(dá)后，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞增殖明顯降低[13]；使用瞬轉(zhuǎn)、穩(wěn)轉(zhuǎn)LGALS1干涉片段或直接注射中和抗體等方法，可明顯抑制卵巢癌、肺癌、乳腺癌、頭頸鱗癌和宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。我們由此猜測(cè)LGALS1也可能會(huì)在PRRSV入侵機(jī)制中扮演重要角色，因此以PRRSV易感細(xì)胞Marc-145為研究對(duì)象，通過(guò)抗體阻斷和siRNA法，利用間接免疫熒光、TCID50測(cè)定、熒光定量和Western blot來(lái)測(cè)定病毒的增殖、滴度變化和表達(dá)情況，為探索LGALS1對(duì)PRRSV在Marc-145細(xì)胞中復(fù)制的作用提供理論依據(jù)，并為PRRSV的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞、動(dòng)物和毒株Marc-145細(xì)胞、2 kg家兔2只由內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；PRRSV毒株JXA1由金宇生物揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、2×SDS上樣緩沖液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、RIPA蛋白裂解液、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記兔抗豬IgG購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、Realtime PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Lipofectamine 2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)自ThermoFisher公司；PRRSV N蛋白單克隆抗體由內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。PCR儀、多功能成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystem公司；倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；制冰機(jī)購(gòu)自SANYO公司；Milli-Q超純水儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；5424R臺(tái)式高速離心機(jī)、5810R大容量臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；電泳儀購(gòu)自Bio-rad公司；超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、空氣搖床購(gòu)自ThermoFisher公司。

1.3 重組蛋白免疫家兔及抗體效價(jià)測(cè)定取2 kg家兔2只，1只為蛋白免疫組，1只注射PBS緩沖液作為陰性對(duì)照組。取實(shí)驗(yàn)室前期純化保存的LGALS1重組蛋白(0.8 g/L)1 mL，加入等體積的弗氏佐劑進(jìn)行乳化后對(duì)家兔進(jìn)行首次免疫，2周后加強(qiáng)免疫1次。之后每周耳源靜脈采血，分離血清，-20℃保存。按常規(guī)間接ELISA方法測(cè)定免疫家兔血清的抗體效價(jià)，包被抗原為純化后的重組蛋白，洗滌緩沖液為PBST(Tween 20 3.3 mL，PBS 1 400 mL)，封閉液為5%脫脂奶粉(脫脂奶粉5 g，PBST100 mL)，第2抗體為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。

1.4 免疫血清的Western blot分析按常規(guī)方法制備Marc-145細(xì)胞和PK-15細(xì)胞膜蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，將凝膠取出轉(zhuǎn)印，第1抗體為稀釋后的免疫兔血清，第2抗體為1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG。

1.5 siRNA引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)LGALS1基因序列特征，設(shè)計(jì)特定siRNA，序列為shRNA-F：5′-CACCGCAAAGACAGCAACAACCTGTTTCAA-GAGAACAGGTTGTTGCTGTCTTTGCTTTTT-TG-3′，shRNA-R：5′-AGCTCAAAAAAGCAAA-GACAGCAACAACCTGTTCTCTTGAAAACAG-GTTGTTGCTGTCTTTGC-3′；PRRSV N蛋白熒光定量引物為qN-F：5′-TCCTCTAGCGACCG-AAGATGACG-3′，qN-R：5′-AGGCAGTCTGGAT-CGACGACAG-3′；LGALS1熒光定量引物為qLGALS1-F：5′-CTCGTTTCGACATGCACGGA-3′，qLGALS1-R：5′-CTGGCAGCTTGATGGTGAGG-3′；GAPDH熒光定量引物為GAPDH-F：5′-CTGCCGCCTGGAGAAACCT-3′，GAPDH-R：5′-GCTGTAGCCAAATTCATTGTCG-3′。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。設(shè)置轉(zhuǎn)染siRNA陽(yáng)性質(zhì)粒的試驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的對(duì)照組，培養(yǎng)24，48 h后分別按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)質(zhì)粒抑制效果。反應(yīng)體系20 μL：10×SYBR GREEN Realtime PCR Master Mix 10.0 μL，模板cDNA 2.0 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.0 μL，上下游引物各0.8 μL。擴(kuò)增條件：50℃ 2 min，94℃10 min進(jìn)行預(yù)變性反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)為94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min。

1.6 間接免疫熒光試驗(yàn)在24孔板上培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞至基本鋪滿平板。1組取等體積抗LGALS1血清和PRRSV病毒液混合，4℃孵育2 h，然后加入各細(xì)胞孔中，500 μL/孔，37℃孵育2 h后吸棄，用PBS洗3次，加入DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；另1組按Invitrogen公司的脂質(zhì)體Lipofec-tamine2000的轉(zhuǎn)染要求將陽(yáng)性siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Marc-145細(xì)胞中，24 h之后接種PRRSV；對(duì)照組直接以PRRSV孵育Marc-145細(xì)胞。48 h后吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗3次，每孔加入500 μL 60%冷丙酮乙醇，-20℃固定20 min，用PBS洗3次，晾干后每孔加500 μL已作100倍稀釋的PRRSV陽(yáng)性血清，37℃孵育1.5 h，再用PBS洗3次，每孔加500 μL 已作100倍稀釋的FITC標(biāo)記羊抗豬IgG，37℃孵育1.5 h，PBS洗3次后，每孔加1滴甘油，用熒光顯微鏡觀察熒光。

1.7 TCID50測(cè)定細(xì)胞分組處理同1.6。48 h之后，收取試驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞，用培養(yǎng)液在無(wú)菌管中作倍比稀釋，即10-1～10-8等。將稀釋度10-4～10-8的病毒液分別取100 μL接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板第1～5列中，每列8孔，同時(shí)第6～7列加等量的生長(zhǎng)液做對(duì)照。之后再向每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液。然后將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后開(kāi)始觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，記錄產(chǎn)生細(xì)胞病變的孔數(shù)，直到對(duì)照細(xì)胞開(kāi)始衰老為止。按Reed-Muench兩氏法計(jì)算細(xì)胞半數(shù)感染劑量(TCID50)[15]。

1.8 qPCR測(cè)定目的基因mRNA表達(dá)水平細(xì)胞分組處理同1.6。48 h之后采集樣品qPCR測(cè)定各組目的基因mRNA表達(dá)水平，具體操作見(jiàn)1.5。

1.9 Western blot測(cè)定目的基因蛋白水平細(xì)胞分組處理同1.6。48 h之后棄掉細(xì)胞樣品上清，用PBS洗3次，每孔加入適量RIPA裂解液裂解，之后加入10 μL上樣緩沖液，沸水中加熱5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，將凝膠取出轉(zhuǎn)印，第1抗體為稀釋后的PRRSV N蛋白單克隆抗體，第2抗體為1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG。

2 結(jié)果

2.1 免疫血清抗體滴度測(cè)定免疫后1周開(kāi)始采集血樣分離血清，每周采集1次用間接ELISA方法檢測(cè)免疫家兔血清中的抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，免疫血清抗體水平在免疫后第5周達(dá)到高峰期，抗體滴度為1∶10 000左右(圖1)。

圖1 抗LGALS1血清的抗體滴度

2.2 免疫血清的Western blot鑒定以家兔免疫血清為第1抗體進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，能檢測(cè)到預(yù)期的21 000蛋白條帶，證明表達(dá)的蛋白確為L(zhǎng)GALS1蛋白，且重組蛋白仍然保持有免疫原性(圖2)。

圖2 融合蛋白的Western blot分析 M.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1.融合蛋白表達(dá)

2.3 siRNA干擾效果判定數(shù)據(jù)采用GraphPad軟件進(jìn)行分析處理，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒的試驗(yàn)組比對(duì)照組LGALS1 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，表明siRNA抑制效果明顯(圖3)。

圖3 siRNA干擾LGALS1 mRNA表達(dá)的效果 相同小寫字母間表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母間表示差異顯著(P<0.05)

2.4 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，2個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組熒光無(wú)明顯差異，說(shuō)明LGALS1對(duì)PRRSV在Marc-145中復(fù)制無(wú)作用(圖4)。

圖4 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果 A.加免疫血清48 h；B.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h；C.對(duì)照組48 h

2.5 TCID50測(cè)定結(jié)果siRNA組、免疫血清組與對(duì)照組的TCID50差異不顯著(P>0.05)，表明LGALS1對(duì)PRRSV在Marc-145中復(fù)制無(wú)作用(圖5)。

圖5 TCID50檢測(cè)

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA組、免疫血清組與對(duì)照組的PRRSV mRNA含量差異均不顯著(P>0.05)，說(shuō)明LGALS1對(duì)PRRSV在Marc-145中復(fù)制無(wú)作用(圖6)。

圖6 PRRSV mRNA表達(dá)

2.7 N蛋白表達(dá)水平變化通過(guò)Western blot檢測(cè)N蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)2個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中病毒N蛋白水平未見(jiàn)明顯差異，說(shuō)明LGALS1對(duì)PRRSV在Marc-145中感染增殖無(wú)作用(圖7)。

圖7 N蛋白表達(dá)水平的變化

3 討論

PRRSV是養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一，一直是獸醫(yī)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)對(duì)象。疫苗雖是控制PRRSV的一種選擇，但其效果卻并不理想。注射PRRSV滅活疫苗后再對(duì)豬只攻毒，仔豬還是會(huì)受到感染，且滅活疫苗還存在免疫力產(chǎn)生期較長(zhǎng)，免疫劑量大、次數(shù)多等缺點(diǎn)。有些國(guó)家會(huì)使用PRRSV弱毒疫苗，但也存在很多安全問(wèn)題，比如在對(duì)公豬接種后再進(jìn)行攻毒，會(huì)出現(xiàn)精液質(zhì)量下降并排毒的現(xiàn)象，弱毒疫苗還會(huì)感染未接種的母豬并經(jīng)胎盤感染胎兒，弱毒疫苗存在的毒力返強(qiáng)現(xiàn)象提醒人們必須要對(duì)其謹(jǐn)慎使用。近期發(fā)展的基因工程亞單位疫苗、重組活載體疫苗等較為理想，但由于PRRSV是單鏈RNA病毒，基因組突變常常發(fā)生，致使經(jīng)常出現(xiàn)不同的毒株或分離株，這給免疫防治帶來(lái)了很高的難度。

在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，我們通過(guò)構(gòu)建含有PRRSV 2b蛋白的釣餌菌株與豬肺泡巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行酵母雙雜交，篩選到了與2b蛋白相互作用的LGALS1，本研究以PRRSV易感細(xì)胞Marc-145為研究對(duì)象，通過(guò)抗體阻斷和siRNA法，利用間接免疫熒光、TCID50測(cè)定、熒光定量和Western blot來(lái)測(cè)定病毒的增殖、滴度變化和表達(dá)情況，進(jìn)一步探索LGALS1對(duì)PRRSV在Marc-145中復(fù)制中的作用。在將純化的LGALS1蛋白對(duì)家兔進(jìn)行免疫后，獲得了高質(zhì)量的抗體，ELISA效價(jià)達(dá)到1∶10 000；用Marc-145細(xì)胞裂解液為抗原，免疫家兔血清為第1抗體進(jìn)行Western blot分析，證明了表達(dá)的蛋白確為L(zhǎng)GALS1蛋白；合成LGALS1 siRNA干擾分子，轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)LGALS1的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，證實(shí)了所構(gòu)建的siRNA具有有效的干擾效果；這些都為研究LGALS1對(duì)PRRSV在Marc-145中復(fù)制的作用奠定了基礎(chǔ)。

siRNA技術(shù)作為一項(xiàng)全新的基因沉默手段，對(duì)基因抑制作用明顯，具有高度特異性、高穿透性和級(jí)聯(lián)式放大效應(yīng)等特點(diǎn)，在動(dòng)物基因沉默的研究中是一種有效的方法[16]。間接免疫熒光是一種將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性呈現(xiàn)在顯微鏡下的技術(shù)，可顯著觀察到細(xì)胞中病毒的含量及增殖情況[17]。本研究不僅在Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行了抗LGALS1血清阻斷試驗(yàn)，還設(shè)計(jì)了LGALS1 siRNA干擾序列，綜合探索LGALS對(duì)PRRSV在Marc-145感染增殖中的作用，保證了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性與可信度。分析LGALS1對(duì)PRRSV在Marc-145感染增殖中無(wú)作用的原因可能為，細(xì)胞中存在的其他高水平受體發(fā)揮了比LGALS1更加顯著的作用。

本課題組在前期的酵母雙雜交試驗(yàn)中篩選到的出現(xiàn)機(jī)率最高的互作蛋白為L(zhǎng)GALS1，但是還發(fā)現(xiàn)了其他出現(xiàn)機(jī)率相對(duì)較低的互作蛋白，我們將繼續(xù)探索它們?cè)赑RRSV入侵易感細(xì)胞中發(fā)揮的作用。本研究證實(shí)了LGALS1在PRRSV感染增殖過(guò)程中沒(méi)有顯著的作用，且建立了一套科學(xué)有效的探索宿主細(xì)胞蛋白在PRRSV感染細(xì)胞中所發(fā)揮的作用的研究方法，可以為其他研究人員提供經(jīng)驗(yàn)和參考。相信在大家共同的努力下，我們?cè)赑RRSV的防控問(wèn)題上必將取得良好的對(duì)策。