大孔樹(shù)脂純化桑白皮多糖的工藝研究

孫 偉,葉 潤(rùn),蔡 靜,谷清義,喬新榮

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,河南信陽(yáng) 464000)

桑白皮為雙子葉植物?？粕?MorusalbaL.)除去栓皮后的干燥根皮,別名桑根皮、桑根白皮、白桑皮、桑皮[1],主產(chǎn)于河南、安徽、浙江、湖南、江蘇等地,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]?！吨袊?guó)藥典》記載桑白皮性味甘寒,歸肺脾經(jīng),具有瀉肺平喘,行水消腫的功效,主治肺熱喘咳、尿少水腫、面目肌膚腫脹等癥[3]。桑白皮主治消渴尿多,且功效獨(dú)特,有記載桑白皮“是它藥不替也”[4]。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),桑白皮具有抗菌[5-6]、抗炎[7]、利尿[8]、降糖[9]、抗HIV、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[10]等作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其也具有抗氧化性,并對(duì)心腦血管疾病具有預(yù)防治療作用,對(duì)損傷的功能細(xì)胞也具有修復(fù)作用[11-13]。多糖作為桑白皮的主要成分之一,其含量與桑白皮的諸多藥理作用密不可分,但是目前對(duì)桑白皮多糖的研究還比較少,所以,研究桑白皮多糖的純化工藝具有一定應(yīng)用價(jià)值和必要性。

大孔樹(shù)脂由于其獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)及材料性質(zhì),多應(yīng)用于黃酮[14]、多酚[15]、多糖等[16-17]的分離純化。目前,利用大孔樹(shù)脂純化桑白皮多糖的研究尚未被報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)以10種不同型號(hào)大孔樹(shù)脂的分離、純化效果為研究目標(biāo),篩選出最佳的純化樹(shù)脂及最優(yōu)的分離條件,為更高效的開(kāi)發(fā)桑白皮和利用桑樹(shù)資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑白皮 2019年02月購(gòu)于信陽(yáng)美銳大藥房有限公司,并經(jīng)信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院中藥教研室陳瓊教授鑒定;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;蒽酮 色譜純,上海展云化工有限公司;D-101、AB-8、DM301、DA-201、H103、NKA-9型大孔樹(shù)脂 天津浩聚樹(shù)脂科技有限公司;HP20、X-5、HPD-722、HPD300型大孔樹(shù)脂 山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司;濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇均 分析純,武漢市中天化工有限責(zé)任公司;所有實(shí)驗(yàn)用水 均為二次重蒸水。

UV-1600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司;ME104電子分析天平 瑞士梅特勒公司;HG101-3A電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京卓鼎干燥設(shè)備廠;400Y多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司);SCQ-168數(shù)控加熱超聲波清洗機(jī) 上海聲彥超聲波儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;DKZ-2B電熱恒溫振蕩水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;層析柱(30×300 mm) 江陰市新輝層析設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑白皮的預(yù)處理 將精選的桑白皮清洗后,置鼓風(fēng)干燥箱60 ℃下干燥4 h至恒重,粉碎后過(guò)80目分樣篩,備用。

1.2.2 桑白皮多糖的粗提 取桑白皮粉200 g,置于2000 mL燒杯中,加入6倍量的蒸餾水,在50 ℃水浴中浸泡提取8 h,并于50 ℃下300 W超聲30 min,過(guò)濾得提取液。將提取液減壓蒸餾濃縮至粘稠狀,冷卻后加入95%的乙醇100 mL使糖類(lèi)沉淀,4 ℃靜置2 h后過(guò)濾,反復(fù)2～3次,得濾渣冷凍干燥為桑白皮粗多糖,4 ℃保存?zhèn)溆肹18]。

1.2.3 多糖含量的測(cè)定 采用蒽酮-硫酸法[19]測(cè)定桑白皮多糖純化前后的多糖含量。

1.2.4 大孔樹(shù)脂的處理 取十種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂,先用重蒸水洗滌,接著以3倍柱體積的95%乙醇浸泡24 h,再用重蒸水洗滌至無(wú)乙醇味;將處理好的大孔樹(shù)脂分別用3倍柱體積,質(zhì)量濃度為6%的HCl和質(zhì)量濃度為6%的NaOH溶液浸泡3 h,最后用重蒸水洗至中性[20-22]。

1.2.5 靜態(tài)吸附的吸附率和解析率考察 取處理過(guò)的十種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂各1 g,放入150 mL具塞錐形瓶中,再加入30 mL質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL桑白皮粗多糖水溶液,將錐形瓶置于25 ℃恒溫?fù)u床上振蕩24 h,取上清液,按照“1.2.3”項(xiàng)中方法處理測(cè)定A625值,計(jì)算上清液粗多糖的含量,計(jì)算吸附量(Q)及吸附率(P)。

Q(mg/g)=(C0-C1)V/m;

P(%)=[(C0-C1)/C0]×100

將吸附后的大孔樹(shù)脂過(guò)濾,重蒸水洗滌后,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%的乙醇溶液50 mL,在同樣條件的搖床中進(jìn)行解吸,取解吸液按照“1.2.3”項(xiàng)中方法處理測(cè)定A625值,計(jì)算解吸率(D)。

D(%)=[C2/(C0-C1)]×100

注:C0為粗多糖溶液中多糖的原始含量(mg/mL),C1為大孔樹(shù)脂吸附后溶液中多糖的含量(mg/mL),C2為解吸液中多糖的含量(mg/mL),V為粗多糖溶液體積(mL),m為大孔樹(shù)脂的質(zhì)量(g)。

1.2.6 靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)曲線 取處理過(guò)的D-101型大孔樹(shù)脂1 g,放入150 mL具塞錐形瓶中,再加入30 mL質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL桑白皮粗多糖水溶液,將錐形瓶置于25 ℃恒溫?fù)u床上振蕩吸附6 h,每0.5 h取1 mL溶液,測(cè)定吸光值,計(jì)算吸附率,繪制吸附曲線[23]。

1.2.7 D-101型大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附中對(duì)吸附效果的影響條件考察

1.2.7.1 pH 取處理好的D-101型號(hào)大孔樹(shù)脂1.0 g,裝入Ф20 mm×200 mm的層析柱里,將1.2.2中的粗多糖配制成質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL溶液,用稀鹽酸分別調(diào)節(jié)pH=2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0,以2.0 BV/h(1 BV=45 mL)的速度上樣并靜置2 h,保持柱溫在25 ℃,每5 mL收集流出液,測(cè)定吸光值[24],計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附率。

1.2.7.2 上樣速度 按照以上確定的最佳條件,選用處理好的D-101型號(hào)大孔樹(shù)脂,將1.2.2中的粗多糖配制成質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL溶液,調(diào)節(jié)pH=3.0,分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h的速度上樣并靜置2 h,保持柱溫在25 ℃,每5 mL收集流出液,測(cè)定吸光值,計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附率。

1.2.7.3 上樣濃度 按照以上確定的最佳條件,選用處理好的D-101型號(hào)大孔樹(shù)脂,將1.2.2中的粗多糖分別配制成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、3.0、5.0、6.0 mg/mL溶液,調(diào)節(jié)pH=3.0,以2.0 BV/h的速度上樣并靜置2 h,保持柱溫在25 ℃,每5 mL收集流出液,測(cè)定吸光值,計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附率。

1.2.8 D-101型大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附中對(duì)解吸效果的影響因素考察

1.2.8.1 洗脫劑濃度 將制備好的粗多糖配制成質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL溶液,按照1.2.7確定的最佳條件上樣,依次用150 mL的25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液洗脫,洗脫速度在1.0 BV/h,分段收取洗脫液,測(cè)定吸光值,計(jì)算大孔樹(shù)脂的解吸率。

1.2.8.2 洗脫劑用量 將制備好的粗多糖配制成質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL溶液,按照1.2.7確定的最佳條件上樣,用75%乙醇溶液洗脫,洗脫劑用量分別在2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 BV,洗脫速度在1.0 BV/h,分段收取洗脫液,測(cè)定吸光值,計(jì)算大孔樹(shù)脂的解吸率。

1.2.8.3 洗脫流速 將制備好的粗多糖配制成質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL溶液,按照1.2.7確定的最佳條件上樣,用75%乙醇溶液洗脫,用量在3.5 BV,控制洗脫速度分別在1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h,分段收取洗脫液,測(cè)定吸光值,計(jì)算大孔樹(shù)脂的解吸率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)平行做3次,結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,單因素實(shí)驗(yàn)采用SPSS 13.0軟件和Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測(cè)定的方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密移取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞試管中,加重蒸水至2.0 mL,再分別精密加入0.2%蒽酮-濃硫酸溶液5.0 mL,振蕩后置90 ℃水浴20 min后移出,冷卻后在625 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度A值。以葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光值(y)為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程y=0.0921x+0.0642,相關(guān)系數(shù)r=0.9995,在0.0020～0.1600 mg/mL濃度區(qū)間內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度測(cè)定 精密稱(chēng)量0.0010 g桑白皮粗多糖,完全溶解后置于25 mL容量瓶中定容,搖勻。精密移取0.2 mL于具塞試管中,按照“2.1.1”項(xiàng)中方法處理測(cè)定A625值,得RSD為0.802%(n=6),說(shuō)明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)量6份桑白皮粗多糖0.0100 g,按照“2.1.1”項(xiàng)中方法處理,得RSD為0.915%(n=6),說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性測(cè)定 準(zhǔn)確移取桑白皮粗多糖待測(cè)液0.4 mL于25 mL容量瓶中用重蒸水定容,按照“2.1.1”項(xiàng)中方法檢測(cè),分別于0、15、30、45、60、75、90、105、120 min檢測(cè)吸光值,計(jì)算RSD值,得RSD為1.102%(n=9),說(shuō)明桑白皮粗多糖待測(cè)液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率測(cè)定 準(zhǔn)確移取6份0.4 mL桑白皮粗多糖待測(cè)液,分別精密加入0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4 mL,按照“2.1.1”項(xiàng)中方法檢測(cè),測(cè)定A625值,得平均回收率為98.04%,RSD為1.81%(n=6)。

2.2 大孔樹(shù)脂類(lèi)型的篩選

根據(jù)“1.2.4”項(xiàng)中大孔樹(shù)脂的處理方法得十種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂吸附效果(見(jiàn)表1),H103、D-101、HPD300、AB-8這四種大孔樹(shù)脂的吸附量較高,但是 H103的解吸率最低,這可能與 H103的比表面積最大有關(guān)系;HPD300的吸附率最大,但是解吸率不足60%,這也可能與HPD300的比表面積比較大有關(guān)系;HPD-722、DA-201、D-101、AB-8這三種樹(shù)脂的比表面積適中,表現(xiàn)出良好的吸附、解吸性能,且D-101的綜合數(shù)值最優(yōu),故最終選取D-101型大孔樹(shù)脂為接下來(lái)實(shí)驗(yàn)所使用的樹(shù)脂。

表1 十種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂吸附和解吸效果Table 1 Adsorption and desorption effects of ten different types of macroporous resins

2.3 靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)曲線

如圖1所示,D-101型大孔樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附在前3.0 h呈上升的趨勢(shì),在3.0 h的時(shí)候達(dá)到吸附的最大值,之后基本達(dá)到飽和,吸附趨于穩(wěn)定。

圖1 靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Kinetic curve of static adsorption

2.4 D-101型大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附中對(duì)吸附效果的影響條件考察

2.4.1 pH對(duì)吸附效果的影響 如圖2所示,當(dāng)樣品的pH調(diào)節(jié)為3.0時(shí)上樣,此時(shí)D-101型大孔樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附效果最好。pH過(guò)小或者過(guò)大都會(huì)阻礙大孔樹(shù)脂的吸附,主要因?yàn)樗釅A度對(duì)多糖溶解度和化學(xué)性質(zhì)影響較大[25],相對(duì)來(lái)說(shuō)弱酸性條件下更容易被樹(shù)脂吸附,被洗脫劑解吸。故最終確定把樣品pH調(diào)節(jié)到3.0進(jìn)行上樣。

圖2 pH對(duì)吸附效果的影響Fig.2 Effect of pH on adsorption efficiency

2.4.2 上樣速度對(duì)吸附效果的影響 如圖3所示,當(dāng)上樣速度在2.0 BV/h時(shí),D-101型大孔樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附效果最佳。上樣速度太快會(huì)導(dǎo)致大孔樹(shù)脂來(lái)不及吸附,吸附率大幅度降低;上樣量太慢會(huì)影響整體的純化效率[26]。綜合各因素考慮,確定上樣速度在2.0 BV/h為最佳。

圖3 上樣速度對(duì)吸附效果的影響Fig.3 Effect of sample loading rate on adsorption efficiency

2.4.3 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響 如圖4所示,當(dāng)上樣濃度低于4.0 mg/mL 時(shí),大孔吸附樹(shù)脂還有較多的吸附多糖的位點(diǎn),因此吸附率會(huì)隨著濃度的增加而增大;但隨著濃度的進(jìn)一步增加,溶液中的雜質(zhì)含量也會(huì)越來(lái)越多,與桑白皮多糖成分競(jìng)爭(zhēng)吸附樹(shù)脂的位點(diǎn)的作用也會(huì)越來(lái)越強(qiáng)[27],因此吸附率稍有下降。故最佳上樣液質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL。

圖4 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響Fig.4 The effect of sample concentration on adsorption efficiency

2.5 D-101型大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附中對(duì)解吸效果的影響因素考察

2.5.1 洗脫劑濃度對(duì)解吸效果的影響 如圖5所示,D-101型大孔樹(shù)脂的最佳洗脫濃度為75%的乙醇,濃度過(guò)大或者過(guò)小都不利于多糖的解吸,根據(jù)“相似相溶”原理,桑白皮乙醇提取物中多糖極性較大,低濃度的乙醇不能破壞樹(shù)脂與多糖形成的氫鍵,故解吸率較低。而高濃度乙醇會(huì)使極性與多糖極性相差變大[28],解吸率亦會(huì)降低,因此選用濃度為75%的乙醇作為解吸液。

圖5 洗脫劑濃度對(duì)解吸效果的影響Fig.5 The effect of eluent concentration on desorption efficiency

2.5.2 洗脫劑用量對(duì)解吸效果的影響 如圖6所示,低于3.5 BV時(shí)隨著洗脫劑用量的增加,解吸率逐漸增加;當(dāng)洗脫劑用量大于3.5 BV時(shí),解吸率隨洗脫劑用量的增加變化不明顯。從理論上講,洗脫劑的用量越多越能完全將吸附在樹(shù)脂上的多糖洗脫下來(lái),但是過(guò)量的洗脫劑會(huì)增加成本和后續(xù)濃縮的工時(shí)。因此,綜合考慮解吸率、成本和工時(shí),最佳洗脫劑用量為3.5 BV。

圖6 洗脫劑用量對(duì)解吸效果的影響Fig.6 Effect of eluent dosage on desorption efficiency

2.5.3 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響 如圖7所示,隨著解吸液流速的增加,桑白皮多糖的解吸率呈下降的趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)榱魉俚募涌鞂?dǎo)致解吸液與大孔樹(shù)脂不能充分接觸,不能使吸附在大孔樹(shù)脂上的桑白皮多糖成分被解吸出來(lái),最佳洗脫流速為1.0 BV/h。

圖7 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響Fig.7 Effect of elution flow rate on desorption efficiency

2.6 驗(yàn)證純化試驗(yàn)

按照以上確定的最優(yōu)條件,用處理好的D-101型號(hào)大孔樹(shù)脂,將2.1.2中的粗多糖配制成質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL溶液,調(diào)節(jié)pH=3.0,以2.0 BV/h的速度上樣并靜置2 h,保持柱溫在25 ℃,用75%的乙醇溶液洗脫,洗脫劑用量分別在3.5 BV,洗脫速度在1.0 BV/h,收集洗脫液,測(cè)定吸光值,計(jì)算桑白皮多糖的純度,3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。經(jīng)過(guò)D-101型大孔樹(shù)脂純化處理后,桑白皮多糖的純度從16.12%±1.20%提高到了74.45%±1.15%,可以看出在此工藝設(shè)置下,D-101大孔樹(shù)脂純化桑白皮多糖切實(shí)可行,可以獲得較高的純化效率。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)10種大孔樹(shù)脂的吸附量、吸附率和解吸率進(jìn)行研究比較,篩選出桑白皮多糖的最佳純化樹(shù)脂為D-101型大孔樹(shù)脂。再經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)考察,得出最佳上樣條件為:pH=3.0、上樣速度為2.0 BV/h、上樣濃度為4.0 mg/mL;最佳洗脫條件為:75%的乙醇洗脫液、洗脫劑用量為3.5 BV、流速為1.0 BV/h。經(jīng)過(guò)該工藝純化后,桑白皮多糖的純度從16.12%提高到了74.45%。該工藝根據(jù)方法學(xué)考察驗(yàn)證穩(wěn)定可行,為桑白皮中多糖的富集、純化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為桑白皮、桑樹(shù)資源的有效開(kāi)發(fā)利用提供了新的途徑,且大孔樹(shù)脂的成本低廉、操作簡(jiǎn)單再生容易、效率高,可為大規(guī)模生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。