樂孕寧口服液對妊娠缺血性貧血大鼠的作用機制研究

李柳柳 李曉紅 常愛冰 楊寧娟 閆亞峰 符 敏 張海燕 吳 博 顏永剛* 朱麗紅*

1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083； 2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

樂孕寧口服液是遵照中醫(yī)補氣養(yǎng)血的治則，在《景岳全書·婦人規(guī)》胎元飲基礎上，由多名婦產(chǎn)科專家基于長期臨床實踐經(jīng)驗總結(jié)的保胎驗方，組方中含黃芪、黨參、白術、續(xù)斷、杜仲、白芍、補骨脂、當歸、山藥、大棗、砂仁等十一味藥材，對妊娠惡阻、先兆性流產(chǎn)和復發(fā)性流產(chǎn)等具有良好的效果[1-2]。其中黃芪、黨參和白術為君藥，共奏補中益氣、健脾養(yǎng)血之功，以達到氣行血行、胎養(yǎng)安合之目的；續(xù)斷、補骨脂和杜仲為疏通氣血筋骨之要藥，具補而不滯、行而不泄的特點，三者共為方中臣藥，能補肝腎、益沖任；佐以當歸補血理氣，山藥健脾固腎，達到調(diào)理血脈，補腎安胎的目的[3]。藥理研究表明，樂孕寧口服液組方中多種活性物質(zhì)可影響機體的造血功能，在一定程度上可成為治療貧血的物質(zhì)基礎。如黃芪和當歸多糖可促進造血干細胞的增殖、分化，刺激紅細胞的生成[4]，黨參皂苷可刺激骨髓造血細胞分裂[5]，大棗提取物可明顯升高IDA大鼠血清鐵含量、鐵飽和度及肝臟鐵含量, 并明顯降低血清未飽和鐵結(jié)合力[6]。

紅細胞(RBC)是血液中數(shù)量最多的一種血細胞，與RBC相關的參數(shù)，如平均紅細胞體積(MCV)，平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)，紅細胞體積分布寬度(RDW)等是臨床上評估貧血嚴重程度和鑒別貧血類別的常用指標[7-8]。血紅蛋白是紅細胞內(nèi)運輸氧的特殊蛋白質(zhì)，是反映貧血程度的重要指標[9]。在血紅蛋白合成過程中，幼紅細胞中的原卟啉(FEP)通過酶促反應與鐵結(jié)合，如果機體缺鐵，原卟啉將以高于正常水平的游離形式積聚[10]。血清與組織中鐵的含量是鐵儲存量的重要評估指標，血清鐵蛋白是人體鐵元素的主要貯存形式，其水平反映了鐵的結(jié)合能力[11]。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2(TfR2)是與鐵代謝相關的蛋白，負責鐵的轉(zhuǎn)運和利用。當機體處于缺鐵狀態(tài)時，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體可為幼紅細胞攝取鐵元素提供條件，其表達會明顯增強，一旦鐵元素恢復正常水平，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體就會隨之降低[12-13]。本實驗采用低鐵飼料干預聯(lián)合定期尾部放血法構建缺鐵性貧血(Iron Deficiency Anemia, IDA)妊娠ID模型[14]，通過測定大鼠不同階段血液和生化指標，系統(tǒng)評價樂孕寧口服液對妊娠IDA大鼠狀況的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 樂孕寧口服液(批號：20180305，陜西關愛制藥有限公司)；琥珀酸亞鐵片(規(guī)格: 0.3 g /片，批號: 2018130524，北京雙鶴藥業(yè))。所用的清潔級低鐵飼料和標準飼料均由南通特洛菲科技飼料科技有限公司提供。

1.1.2 動物 SPF級健康雌性Wistar大鼠，體重(160±15)g。SPF級健康Wistar雄性大鼠45只，體重(230±10)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物審批許可號：SCXK- (川) 2018-30。研究所涉及的實驗過程均按照動物護理指南進行，并獲得動物倫理委員會的批準。大鼠分籠飼養(yǎng)于溫度為(22±2)℃，濕度為45% 的空調(diào)動物房內(nèi)。自由進食和飲水，并始終保持12h明暗交替，常規(guī)適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 妊娠IDA模型的建立 參考李美荃等[14]的造模方法并稍加改進，選取健康雌性Wistar 大鼠110只，常規(guī)性飼養(yǎng)1周。其中85只大鼠給予低鐵飼料和去離子水，并定期尾部放血(每只大鼠2次/周，放血量1～1.5 mL只/次)。實驗過程中采用不銹鋼籠具和食盒，其余15只常規(guī)標準飼養(yǎng)為對照組。飼養(yǎng)4周后，各大鼠內(nèi)眥靜脈采血，EDTA抗凝后測定Hb含量。IDA大鼠以Hb ≤ 100 g/L為篩選條件進行后續(xù)試驗，符合條件的為81只。將對照組大鼠和81只IDA雌性大鼠和篩選出的雌性大鼠與健康成年Wistar 雄鼠按照2: 1同籠交配，次日以雌鼠陰道沖洗物做陰道圖片，在低倍鏡下以見到精子計算妊娠期(孕0 d)。最終IDA模型大鼠成功受孕大鼠72只，對照組大鼠14只成功受孕。造模期間飼養(yǎng)條件保持不變。

1.2.2 動物分組及給藥 將受孕成功的72只IDA大鼠按照血紅蛋白水平隨機分為6組，每組12只。各分組分別為：模型組(Model)，琥珀酸亞鐵組(HPS)、樂孕寧高(LH)、樂孕寧中(LM)、樂孕寧低劑量(LL)和樂孕寧+琥珀酸亞鐵組(LL+HPS)。對照組常規(guī)受孕作為Control組。HPS組按照(2 mg /kg)給予琥珀酸亞鐵 ，LL、LM、LH組給予樂孕寧口服液相應劑量為1.5 mL /kg、3 mL /kg 、6 mL /kg，LL+HPS組按照(1.5 mL /kg+2 mg /kg)給藥，各組均按 10 mL /kg 灌胃容積給藥。Control組和Model組分別給予相同容積純凈水和去離子水，連續(xù)灌胃4周。

1.2.3 臟器指數(shù)的測定 大鼠用10% 水合氯醛麻醉后，腹主動脈采血，分離心臟和肝臟，沖洗干凈并稱重，于-80℃冷凍保存。

1.2.4 血液參數(shù)檢測 分別于低鐵飼料干預前，干預4周后，給藥2周后和給藥4周后眼眶取血約1～1.5 mL，EDTA抗凝后，用全自動血液分析儀測定血液中Hb、RBC、Hct、MCV、RDW等指標。

1.2.5 血液中游離原卟啉(FEP)的檢測 末次給藥后，水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，將血樣保存于抗凝管中。取血適量滴于濾紙干燥，加入2% 硅藻土溶液適量洗脫過夜，加乙酸乙脂和冰乙酸(4∶1) 混合液，離心15 min，取上清加4 mL 0.5 NHCl振蕩離心，熒光分光光度計法測定紅細胞內(nèi)游離原卟啉含量[15]。

1.2.6 血清和組織中鐵含量的測定

1.2.6.1 血清制備 大鼠腹主動脈采血，7℃ 孵育30 min，3500 r/min離心10min，取上清，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.6.2 組織勻漿的制備 取適量心肌和肝臟組織適量，加入適量生理鹽水，于勻漿機中勻漿，離心取上清，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 血清中鐵蛋白(Fn)含量測定 取“1.2.6.1項下”血清適量，按照鐵蛋白測定試劑盒測定血清中Fn的含量。

1.2.8 免疫組化法測定TfR1和TfR2 取心肌組織適量，按照試劑盒進行操作，Olympus BX50采集封片后的圖像，并運用image pro plus 6.0軟件對所得照片進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 各分組大鼠一般狀況觀察和體重稱定結(jié)果 Control組大鼠行為和體態(tài)未見明顯改變或異?，F(xiàn)象。常規(guī)適應性飼養(yǎng)后所有大鼠均反應靈敏，活動正常，皮毛柔順。低鐵飼料喂養(yǎng)第9天，個別大鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象。2周后，大鼠脫毛現(xiàn)象已普遍出現(xiàn)，耳緣和腳爪出現(xiàn)較輕泛白，3只表現(xiàn)出神情倦怠。4周后，飼喂低鐵飼料和去離子水的大鼠均出現(xiàn)不同程度皮毛脫落現(xiàn)象，每只大鼠耳緣和腳爪顏色蒼白，神情倦怠，怕冷，多蜷縮成團狀。

灌胃給藥2周后，除Model組外，大鼠毛發(fā)脫落現(xiàn)象均有一定改善，各給藥組大鼠食欲有所增加。給藥4周后，Model組毛發(fā)出現(xiàn)片狀脫落，各給藥組體態(tài)和行為學已接近正常，除樂孕寧低劑量組大鼠尾部尚有些許泛白，其余組皆與Control組無明顯區(qū)別。

各分組大鼠體重變化由圖1(A)可知，大鼠體重在第1個測試點(即常規(guī)適應性飼養(yǎng)1周后)差異無統(tǒng)計學意義，且各分組體重大小均集中在170g左右，表明初始大鼠體重基本一致。由第1個測試點至第2個測試點為按照相應飼養(yǎng)條件喂養(yǎng)4周后大鼠體重變化，可看出Control組體重增長比其余各組速度快，結(jié)合圖1(B)可知，Control組與其余各組體重之間有顯著性差異(**P<0.01)，表明長期服用低鐵飼料和去離子水會影響大鼠體重的正常增長。由第2個測試點至第3個測試點為灌胃給藥2周后大鼠體重變化。各組體重增長速度由大至小依次為：Control組 > LH、HPS >其余給藥組>Model組，表明不同給藥組可不同程度減輕缺血性貧血所導致的體重增長緩慢狀況，長期缺鐵可能會影響妊娠期胎兒體重的正常發(fā)育。由第3個至第4個測試點為大鼠灌胃2周至第4周過程中體重的增長情況。Control組增長速度依舊最快。給藥組LH和LL+HPS增長速度較之前也有所加快。表明這兩個給藥組相較于其它給藥組改善缺鐵性貧血引起的體重胎兒發(fā)育遲緩能力較強。

由圖1(C)可知，長期低鐵飼料喂養(yǎng)會導致妊娠大鼠體重持續(xù)增長遲緩，連續(xù)2周灌胃給藥，Control組與其余各組體重之間有顯著性差異(**P<0.01)。HPS、LL和LM給藥組與Model組無統(tǒng)計學差異，LH和LL+HPS組與Model組有顯著性差異(P<0.01)，表明樂孕寧高劑量和樂孕寧聯(lián)合補鐵劑可有效改善妊娠期胎兒發(fā)育遲緩情況。由圖1(D)可知，灌胃給藥4周后，HPS、LM、LH和LL+HPS組體重均與Model組有統(tǒng)計學差異，表明妊娠伴隨缺鐵性貧血可通過服用樂孕寧口服液可不同程度改善缺鐵引起的不良后果。若聯(lián)合補鐵劑益氣使用效果更佳。

2.2 樂孕寧口服液對大鼠心肌指數(shù)和肝臟指數(shù)的影響 由圖2可知，與Control組相比較，Model組的心肌指數(shù)顯著上升，差異有統(tǒng)計學差異；各個給藥組與Control組相比較，指數(shù)有不同程度的上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。各個分組間肝臟指數(shù)無統(tǒng)計學差異，但Model組和各個給藥組肝臟指數(shù)均較Contro組有所升高。

注：A.心肌指數(shù)；B.肝臟指數(shù)圖2 各分組大鼠心肌和肝臟指數(shù)測定結(jié)果

2.3 樂孕寧對血液各項指標的影響

2.3.1 不同時間點Hb含量水平

組別造模前合籠前給藥2周后給藥4周后Control137.21±5.98136.97±2.67134.3 ± 11.32129.37±6.53Model139.2±4.3188.63±3.62??88.56 ± 7.4??79.21±5.37??HPS135.99±6.2784.96±1.80??98.31±6.52?? ##106.38±10.11? ##LL147.36±3.6587.69±2.18??88.39±4.51??91.26±6.28??LM129.87±9.8185.36 ± 2.66??92.78 ±3.4??110.54±5.22?? ##

表1 樂孕寧口服液對大鼠Hb的影響

由圖3可知，Control組大鼠血液中Hb含量始終未有大范圍波動，各個測定時間點間無統(tǒng)計學差異，提示體內(nèi)鐵含量一直在正常范圍內(nèi)。在第1個測定點時，即各組大鼠未做任何處理前，Hb含量均在正常范圍內(nèi)，彼此之間沒有統(tǒng)計學差異。第2個測定點時，Control組和其余組Hb含量有顯著性差異，Model組與給藥組間Hb含量無統(tǒng)計學差異，表明低鐵飼料飼養(yǎng)聯(lián)合定期尾部放血4周后，大鼠體內(nèi)Hb含量下降顯著。各分組大鼠給藥兩周后，血液中Hb有不同程度的上升趨勢，由表2得知，模型組與HPS、LH和LL+HPS組有顯著性差異，表明此3個給藥水平連續(xù)給藥2周對于妊娠IDA有一定程度改善作用，LL和LM相對改善能力較小。給藥4周后，Model組大鼠Hb水平與HPS、LM、LH和LL+HPS給藥組有顯著性差異，各組體內(nèi)Hb水平有一定程度的升高，其中，HPS、LM、LH和LL+HPS組升高效果較為明顯，Hb 水平>100 g/L。

圖3 不同時間點各組大鼠血紅蛋白含量圖

2.3.2 對大鼠RBC、HCT、MCV、RDW的影響

由圖4可知，連續(xù)給藥4周后(第4個測定點)，與Control組相比較，Model組大鼠血中RBC、Hct、MCV明顯降低，RDW水平顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與Model組相比較，HPS組及樂孕寧不同劑量組大鼠血RBC、Hct、MCV均明顯升高，RDW水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，表明長時間食用低鐵食物會導血液中一些指標逐漸偏離正常狀態(tài)。連續(xù)給藥4周后，各項指標在一定程度上均有改善，表明樂孕寧不同劑量和HPS對于妊娠IDA具有一定的改善作用。其中，LH和LL+HPS這兩個給藥組效果較為明顯，表明長期服用樂孕寧口服液可改善妊娠IDA引起的一系列癥狀，與HPS聯(lián)合使用效果更為顯著。

圖4 樂孕寧口服液對大鼠血液RBC、HCT、MCV、RDW的影響

2.4 樂孕寧口服液對血液FEP的影響 由圖5可知，與Control組相比，Model組大鼠血中FEP含量顯著上升，差異具有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與Model組相比，各給藥組血中FEP含量顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義。其中，LH和LL+HPS組與空白相比無統(tǒng)計學差異，表明這兩個給藥組效果更為明顯，這也與之前測定指標相一致。測定結(jié)果表明樂孕寧口服液可顯著降低血液中游離FEP數(shù)量，進而改善妊娠鐵缺乏。

圖5 樂孕寧口服液對血中FEP含量的影響

2.5 樂孕寧口服液對血清和組織中的鐵含量的測定

2.5.1 血清中鐵的含量 由圖6可知，與Control組相比，Model組大鼠血清中鐵的含量顯著降低，差異有顯著性，這表明缺鐵組大鼠體內(nèi)的鐵含量會低于正常對照組；與Model組相比，各給藥組血清中鐵的含量均有一定程度的升高，且有顯著性差異。這表明樂孕寧口服液可有效增加血液中鐵的含量，促進鐵吸收。

圖6 各分組中血清鐵的含量

注：A.心??；B.肝臟圖7 心肌和肝臟中鐵的含量

2.5.2 組織中鐵的鐵含量 由圖7可知，與Control組相比，Model組大鼠心肌和肝臟中鐵的含量顯著降低，且降低程度有顯著性差異；各給藥組與Model組相比，心肌和肝臟中鐵的含量有一定的上升趨勢，其中LM組心肌鐵含量與Model組相比升高趨勢有統(tǒng)計學意義。LH和LL+HPS組較模型組升高有顯著性差異，與空白對照組比差異無統(tǒng)計學意義；肝臟中鐵含量的測定結(jié)果中，LH和LL+HPS組相較于Model組鐵含量升高有統(tǒng)計學差異，提示樂孕寧高劑量和樂孕寧聯(lián)合琥珀酸亞鐵組有較好地提高肝臟組織中鐵含量的效果。組織和血液中鐵含量測定結(jié)果表明，樂孕寧口服液可有效升高血液和組織中鐵含量，且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴性。

2.6 鐵蛋白含量測定 由圖8可知，與空白組相比，模型組血清中Fn含量顯著降低(P<0.05)；與模型組學相比，各給藥組血清中Fn含量均不同程度上升，其中，HPS、LM、LH和LL+HPS組與模型組相比均有顯著性差異。LH和LL+HPS組血清中Fn含量與空白組無統(tǒng)計學差異，表明連續(xù)給藥4周，樂孕寧口服液和樂孕寧聯(lián)合琥珀酸亞鐵對于妊娠IDA效果極好。

圖8 各分組中Fn的含量測定結(jié)果

2.7 心肌中TfR1和TfR2的測定 免疫組化結(jié)果顯示，TfR1和TfR2在各個分組中的表達有一定的差異。由圖10所示，與Control組相比，Model組的TfR1和TfR2表達量顯著下降，差異有顯著性意義。與Model組相比，各給藥組TfR1和TfR2表達量有不同程度的上升。其中，HPS組、LH組和LL+HPS下降量與Model組相比有統(tǒng)計學差異。表明樂孕寧口服液可升高妊娠IDA大鼠體內(nèi)TfR1和TfR2水平。

注：A、B、C、D、E、F、G分別對應的組別為:Control、Model、HPS、LL、LM、LH、LL+HPS給藥組。圖9 樂孕寧口服液對心肌組織中TfR1表達的影響

注：A.TfR1；B.TfR2圖10 心肌中TfR1、TfR2的表達

3 討論

妊娠合并輕、中度貧血是臨床常見的疾病，長期鐵缺乏會影響子代體重和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[15-16]。目前治療妊娠IDA的主要思路是及時補充鐵劑和去除引發(fā)IDA的誘因，臨床上主要采用口服亞鐵鹽與食療相結(jié)合的方式來改善缺鐵狀況。研究證明，該方式具有一定療效，但口服亞鐵鹽往往存在胃腸道反應重，吸收不理想等缺點[17-18]。 IDA在中醫(yī)屬于“血虛”“脾虛”范疇，是因脾運失健而致氣血生化不足產(chǎn)生的疾病，臨床表現(xiàn)屬氣血兩虛證。臨床表明，補鐵劑與部分中成藥聯(lián)合在改善缺鐵性貧血方面具有很好的療效，不僅可增加機體自身的造血功能，還可有效降低胃腸道的不良反應[9-10,19]。樂孕寧口服液作為婦科臨床常用品種之一，方中所含的當歸、白芍和山藥合用可有效補血養(yǎng)血，各味藥材彼此之間相互作用，共奏健脾益氣、滋陰養(yǎng)血，調(diào)理血脈，補腎安胎之功效[3]。

在IDA臨床診斷過程中，血常規(guī)、Hb含量、FEP含量、鐵蛋白含量等指標對于評價缺血程度具有重要意義[20]。本研究基于上述指標，系統(tǒng)評價樂孕寧口服液對于妊娠IDA狀況的改善作用，并對其改善機制進行了初步探究。研究結(jié)果表明，按照一定療程服用樂孕寧口服液后可改善妊娠IDA缺鐵狀況，但單用效果并不明顯，若與補鐵劑合用效果更佳。其對于妊娠IDA改善作用主要表現(xiàn)為可顯著升高RBC、Hct、MCV水平，降低RDW水平。此外，樂孕寧口服液還可有效升高妊娠IDA大鼠組織所含鐵水平、降低血清中FEP含量，免疫組化結(jié)果顯示，樂孕寧口服液高劑量組和樂孕寧聯(lián)合琥珀酸亞鐵組在一定程度上可促進心肌組織中TfR1和TfR2的表達。這表明，樂孕寧口服液改善缺鐵狀況的機制之一有可能是通過促進TfR1和TfR2的表達，進而影響機體鐵代謝來維護妊娠期婦女體內(nèi)鐵的正常水平。

樂孕寧口服液作為保胎品種之一，被廣泛應用于臨床實踐中，顯示出了良好的治療效果。本研究表明，樂孕寧口服液對妊娠IDA具有明顯的改善作用，可作為治療臨床妊娠IDA的潛在藥物，但單用效果不如與補鐵劑合用明顯，建議與補鐵劑聯(lián)合使用。本研究對樂孕寧口服液更好地服務于臨床實踐提供了一定的參考，有利于樂孕寧口服液在臨床適應癥上的進一步擴展。