探討實(shí)時熒光定量PCR儀用于流感病毒檢測的效果分析

羅周正 張麗艷 李 賀 杜 波

（阜新市衛(wèi)生健康服務(wù)中心（阜新市疾病預(yù)防控制中心）檢驗檢測部，遼寧 阜新 123000）

流感在臨床上屬于流感病毒引發(fā)的一種急性呼吸道傳染病，因流感病毒屬于RNA病毒，且潛伏期短，傳染性較強(qiáng)及已發(fā)生變異等特點(diǎn)，一旦感染流感病毒，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，甚至威脅生命健康。臨床通常采取分離病毒、鑒定病毒或細(xì)胞培養(yǎng)作為檢測流感病毒的常用手段，但因消耗時間長，特別是針對爆發(fā)疫情時難以滿足病毒診斷的要求。據(jù)有關(guān)臨床實(shí)驗室最新研究表示，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用在臨床實(shí)踐中，除有操作簡便、靈敏度及自動化程度高外，還對核酸具備較高的擴(kuò)增性及檢測快等優(yōu)勢，深得廣大患者一致好評與認(rèn)可[1]。因此，為對實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在流感病毒檢測中的診斷價值進(jìn)一步探討，本研究對我市哨點(diǎn)醫(yī)院采集疑似流感病毒樣本檢測后予以臨床分型，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：回顧分析于2018年10月至2019年3月期間前來我市哨點(diǎn)醫(yī)院就診疑似流感病毒患者共530例納入本次實(shí)驗，并對以上對象流感病毒樣本進(jìn)行采集。530例流感病毒樣本中包含男性患者330例、女性患者200例；科室包含兒科門診患者110例、內(nèi)科門診患者190例、呼吸科病房患者230例。以上所有標(biāo)本采集、存儲、運(yùn)輸?shù)雀黜棽僮骶罁?jù)《甲型H1N1流感病毒實(shí)驗室檢測技術(shù)方案》有關(guān)文件進(jìn)行執(zhí)行。將采集的所有標(biāo)本及時送往流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗室，并由檢驗人員在規(guī)定時間內(nèi)完成檢測。針對未能在24h完成的檢驗，應(yīng)置于-70 ℃的環(huán)境下冷凍保存。

1.2 檢驗儀器與檢驗方法

1.2.1 儀器型號與試劑：ABI 7500 Fast熒光PCR擴(kuò)增儀（美國Thermo公司生產(chǎn)）；核酸提取采用RNA病毒提取試劑盒RNeasy Mini Kit（QIAGEN公司，貨號74104）；PCR反應(yīng)試劑（碩世生物科技有限公司）；狗腎傳代細(xì)胞（由遼寧省疾病預(yù)防控制中心感染與傳染性疾病防制所提供）[2-3]。

1.2.2 標(biāo)本采集和處理：采用核酸提取盒實(shí)時熒光定量PCR法提取樣本季節(jié)性H1亞型、季節(jié)性H3亞型、新甲H1亞型、H5、H7、H9等亞型檢測，且所有操作過程均依據(jù)試劑盒使用說明說進(jìn)行操作[2]。按照說明，將RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄處理后擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為，50 ℃ 30 min，1個循環(huán)，95 ℃ 5 min，1個循環(huán)，95 ℃ 10 s，45個循環(huán)，55 ℃ 40 s，45個循環(huán)，最后采取FAM信道在55 ℃下單點(diǎn)熒光檢測[3-4]。

1.2.3 病毒細(xì)胞分離鑒定：采集樣本中適當(dāng)加入10000 U/mL雙抗接種于單層狗腎傳代細(xì)胞，并注意觀察細(xì)胞病變，對病毒培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞凝血試驗，結(jié)合細(xì)胞病變及細(xì)胞凝集進(jìn)行檢測。若凝集試驗符合1∶16以上的細(xì)胞培養(yǎng)，可采用有關(guān)亞型標(biāo)準(zhǔn)血清給予紅細(xì)胞凝集抑制試驗來作為流感病毒型別和亞型的鑒定[5-6]。

1.3 觀察指標(biāo)：統(tǒng)計兩組檢測方式對陽性流感病毒及臨床分型（新甲H1型、H3亞型、B型）陽性檢出率情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，卡方檢驗以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；則兩個連續(xù)變量間呈線性相關(guān)時，使用Pearson積差相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 比較兩組檢測方法對流感病毒樣本不同分型檢測結(jié)果情況，見表1。

2.2 比較兩組檢測方法對陽性流感病毒不同分型檢出率情況，見表2。

表1 兩組檢驗方法流感病毒檢測結(jié)果對比

表2 兩組檢測方法對陽性流感病毒不同分型檢出率對比（n，%）

3 討論

流感病毒最常用的檢測方法較多，包含PCR、血清學(xué)診斷以及細(xì)胞培養(yǎng)法，即可保證流感病毒的抗原性和原始標(biāo)本保持一致性，加上利于長時間保存，能夠更好的對病毒抗原性及基因進(jìn)行分析。經(jīng)最新研究成果表明，因細(xì)胞培養(yǎng)法的檢出率受到大量病毒載量及樣本質(zhì)量影響，一旦樣本質(zhì)量低或病毒載量不夠時，極易存在一定的假陰性[7-8]。與此同時，細(xì)胞培養(yǎng)法處于局限性，為確保病毒活性，只能單純用于活體病毒[9]。

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在臨床上主要適用于流感、禽流感、麻疹、手足口病等傳染性疾病診斷，且在食品安全上、科學(xué)研究等方面也發(fā)揮了重要作用[10]。本研究通過采用實(shí)時熒光定量PCR法，針對流感病毒鑒別多株多亞型流感病毒，具有實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)主要是通過擴(kuò)增至每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號，進(jìn)而能夠?qū)_(dá)到擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，伴隨產(chǎn)物的增多，進(jìn)一步促使熒光信號強(qiáng)度增強(qiáng)，若經(jīng)過一個循環(huán)后，自然被熒光強(qiáng)度信號收集。較高的特異性及靈敏性[11-12]。經(jīng)國內(nèi)有關(guān)臨床實(shí)踐表示，實(shí)時熒光定量PCR具有操作便捷、反應(yīng)速度快、具備較強(qiáng)的敏感性及直觀性，通過定量檢測深得臨床醫(yī)師及患者滿意的效果[13]。

本次研究證實(shí)了實(shí)驗組檢出89例陽性標(biāo)本，陽性率為16.79%，其中包括新甲H1型71例、H 3亞型14例、B型4例；則參照組檢出57例陽性標(biāo)本，陽性率為10.75%，包括新甲H1型52例、H 3亞型3例、B型2例，實(shí)驗組高于參照組，P＜0.05。由此說明，通過選自2018年10月至2019年3月對我市哨點(diǎn)醫(yī)院收集的530例疑似流感病毒攜帶者樣本進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，使用實(shí)時熒光定量PCR法檢測出的陽性率更高，且兩組均未查出H5、H7、H9型，且在進(jìn)入11月-次年1月份流感病毒的檢出率相對較高，是引發(fā)流感病毒的傳播及擴(kuò)散的最佳時機(jī)，冬季天氣寒冷，人體抵抗力減弱，容易受寒。加上，人們多半時間在室內(nèi)活動，窗戶常管閉，導(dǎo)致空氣不流通，病毒更容易傳播。

綜上所述：較細(xì)胞培養(yǎng)法而言，選擇實(shí)時熒光定量PCR法應(yīng)用在流感病毒診斷中的臨床價值更高，值得進(jìn)一步推廣與借鑒。