OsRPK1基因過(guò)表達(dá)和RNA干涉對(duì)水稻苗期耐鹽性的影響

李晶嵐 陳鑫欣 石翠翠 劉方惠 孫 靜 葛榮朝

基因過(guò)表達(dá)和RNA干涉對(duì)水稻苗期耐鹽性的影響

李晶嵐**陳鑫欣**石翠翠 劉方惠 孫 靜 葛榮朝*

河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北石家莊 050024

水稻基因?qū)儆诟缓涟彼嶂貜?fù)序列的類(lèi)受體蛋白激酶, 在鹽脅迫下其表達(dá)量暫時(shí)升高后出現(xiàn)明顯下降。前期研究表明,基因過(guò)表達(dá)會(huì)造成擬南芥非生物脅迫耐受性明顯降低。本研究對(duì)基因在水稻中實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)和RNA干涉, 進(jìn)而對(duì)的抗逆性功能加以探究。結(jié)果表明,基因表達(dá)量增加時(shí), 水稻幼苗表現(xiàn)為耐鹽性下降; RNA干涉則使水稻幼苗表現(xiàn)為耐鹽性增加。鹽脅迫后過(guò)表達(dá)植株脯氨酸含量低于野生型、MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于野生型, 而-RNAi水稻植株的脯氨酸含量顯著高于野生型、MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于野生型。因此,基因的表達(dá)量對(duì)水稻耐鹽性具有明顯影響, 脯氨酸含量及細(xì)胞質(zhì)膜受破損程度的改變可能是造成轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽性變化的內(nèi)在原因。本研究為進(jìn)一步闡明基因的抗逆作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ), 對(duì)于通過(guò)調(diào)整該基因表達(dá)改良水稻的耐鹽性具有重要意義。

水稻;基因; 過(guò)表達(dá); RNA干涉; 生理指標(biāo)

目前土壤鹽漬化在全世界范圍嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]。我國(guó)在東北、西北、華北及濱海地區(qū)也分布著大面積的鹽堿地, 鹽堿化耕地面積達(dá)6.7×106hm2, 占全國(guó)耕地總面積的25%左右[2-3]。因此, 在我國(guó)農(nóng)作物育種工作中選育耐鹽堿的優(yōu)良品種顯得尤為重要。其中探究耐鹽相關(guān)基因、研究其耐鹽內(nèi)在生理機(jī)制, 成為耐鹽堿農(nóng)作物選育的重要研究方向之一。植物對(duì)逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)傳導(dǎo)途徑及多基因表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)雜過(guò)程, 這一過(guò)程中蛋白激酶是植物體內(nèi)一類(lèi)重要的調(diào)節(jié)因子,通過(guò)膜受體蛋白激酶感知外界環(huán)境脅迫信號(hào), 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Na+/K+、ABA (脫落酸)等離子和分子濃度改變, 進(jìn)而激活不同蛋白磷酸化途徑, 調(diào)控下游抗逆基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 啟動(dòng)相應(yīng)的生理生化等適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)降低或消除危害[4-6]。

類(lèi)受體蛋白激酶(receptor-like kinase, RLK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 通過(guò)Ser/Thr殘基的磷酸化和脫磷酸化, 控制下游靶蛋白的開(kāi)啟和關(guān)閉, 將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)換為胞質(zhì)信號(hào)進(jìn)而誘導(dǎo)特定功能基因的表達(dá)[7-8]。目前, 人們已經(jīng)從玉米、擬南芥、水稻、小麥等多種高等植物基因組中克隆出大量的RLK基因。類(lèi)受體蛋白激酶參與了植物體一系列的發(fā)育過(guò)程, 如調(diào)節(jié)原韌皮部和分生組織的生長(zhǎng)[9]、影響莖和導(dǎo)管的生長(zhǎng)發(fā)育[10]、抑制器官脫落[11]、調(diào)控花藥的生長(zhǎng)發(fā)育[12]以及維持植物細(xì)胞壁的完整性[13]。大量的RLK家族成員也被證實(shí)參與了植物對(duì)病原體入侵[14-16]、非生物脅迫的防御反應(yīng)[17-23]。富含亮氨酸重復(fù)序列的類(lèi)受體蛋白激酶(leucine-rich repeat receptor-like kinase, LRR-RLK)是在植物中廣泛存在的、與抗逆性密切相關(guān)的類(lèi)受體激酶, 其LRR單元的氨基酸序列一般為L(zhǎng)XXLXXLXXLXLXXNXLXG XIPXX(X為任意氨基酸)[24]。AtRPK1具有2個(gè)胞外LRR結(jié)構(gòu), 在ABA、脫水、高鹽和低溫等脅迫下,基因轉(zhuǎn)錄水平明顯增加[25]。AtRPK1在擬南芥對(duì)ABA的早期識(shí)別中發(fā)揮重要作用, 在發(fā)芽、生長(zhǎng)和氣孔關(guān)閉期間,基因的抑制表達(dá)將降低植物對(duì)脫落酸識(shí)別的敏感性[26]。在野生型擬南芥中過(guò)表達(dá)增加了植株對(duì)ABA的敏感性[19]。水稻抗白葉枯病基因、番茄的抗病基因和在結(jié)構(gòu)上均具有胞外LRR區(qū), Cf9蛋白有28個(gè)LRR單元, Cf2蛋白有38個(gè)LRR單元[22-23]。

水稻基因()與擬南芥基因序列具有高度的同源性。OsRPK1蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為1084個(gè)氨基酸, 約為AtRPK1蛋白質(zhì)(540個(gè)氨基酸)的2倍, 其胞外部分明顯具有2個(gè)LRR單元的聚集區(qū)域, 1~355位氨基酸區(qū)域具有7個(gè)LRR單元, 355~685位氨基酸區(qū)域具有6個(gè)LRR單元, 其后685~801位氨基酸區(qū)域?yàn)榭缒^(qū)(MSD)。前期實(shí)驗(yàn)表明,、基因過(guò)表達(dá)擬南芥與對(duì)照植株相比表現(xiàn)出對(duì)NaCl和ABA的耐受性明顯降低。RNAi擬南芥與野生型擬南芥相比, 對(duì)NaCl和ABA的耐受性得到明顯提高[27]。本文擬通過(guò)對(duì)基因在水稻中實(shí)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)及RNA干涉, 進(jìn)一步研究的抗逆性功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試水稻品種為日本晴(L. cv. Nipponbare)、水稻RNAi載體pTCK303由本室保存; RNA提取試劑、DNA限制性?xún)?nèi)切酶、PrimerSTAR DNA聚合酶、T4-DNA連接酶、qRT-PCR熒光酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司; PCR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式分析

將10日齡水稻幼苗移栽到140 mmol L–1NaCl溶液中處理0、1、6、24 h后, 剪取幼苗葉片, 提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 利用基因調(diào)整cDNA濃度使其一致, 然后利用LP-q: 5'-GCTAT GGTGTTGTACTGATGGAGT-3'、RP-q: 5'-GTGCAC ATCACTGCTAAATGCAATG-3'對(duì)不同處理的cDNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè), 重復(fù)檢測(cè)3次確定基因在鹽脅迫后的表達(dá)模式。

1.2.2基因過(guò)量表達(dá)與RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建 提取水稻總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 利用引物PU: 5'-GCCTAGCTAGCTCCCACC- 3' (酶切位點(diǎn)I)和PD: 5'-GCGTTGAA TGTGTAATCATCGGT-3' (酶切位點(diǎn)I)擴(kuò)增獲得基因, 構(gòu)建到表達(dá)載體pCAMBIA1300上, 獲得過(guò)量表達(dá)載體p1300:35S:。

選取基因距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)69~419 bp區(qū)域和2043~2371 bp區(qū)域作為RNAi的干涉序列, 分別命名為-RNAi-1和-RNAi-2。以p1300:35S:質(zhì)粒為模板, 用引物L(fēng)P-1: 5'- GATCACTCTCTTCCTCCTCCTG-3' (酶切位點(diǎn)I、I)和RP-1: 5'-GCGGCGGAGCGACCAGAT-3' (酶切位點(diǎn)IH I), 采用PrimerSTAR DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 得到350 bp目的片段, 回收、連接到pMD18-T載體pMD18--RNAi-1, 轉(zhuǎn)化到DH5α進(jìn)行測(cè)序。提取pTCK303和pMD18-T--RNAi-1的質(zhì)粒, 首先采用內(nèi)側(cè)酶I/H I進(jìn)行雙酶切, 電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌, 酶切鑒定獲得正連載體pTCK303-- RNAi-antisense-1; 提取pTCK303--RNAi- antisense-1和pMD18-T--RNAi-1質(zhì)粒, 采用外側(cè)酶I/I進(jìn)行雙酶切, 回收、連接、構(gòu)建獲得RNAi表達(dá)載體pTCK303--RNAi-sense-1, 即pTCK303--RNAi-1載體。

利用引物L(fēng)P-2: 5'-GGTTCG GTGTGATAGCGTTATTGG-3' (酶切位點(diǎn)I、I)和RP-2: 5'-GTGATTGGCACT CCGATGTCTTG-3'(酶切位點(diǎn)IHI), 用相同的方法構(gòu)建獲得RNAi表達(dá)載體pTCK303--RNAi-sense-2, 即pTCK303--RNAi-2載體。

1.2.3 水稻愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定 對(duì)日本晴水稻種子消毒后, 均勻鋪于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+2 mg L–12,4-D)誘導(dǎo)愈傷組織, 28℃暗培養(yǎng)25~ 28 d。挑選光滑、淡黃色、較硬的胚性愈傷組織, 均勻鋪放在新鮮NB培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3~4 d。然后將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中, 倒入適量的農(nóng)桿菌懸浮液, 室溫放置10~20 min, 并不時(shí)晃動(dòng)。取出愈傷組織用無(wú)菌濾紙吸去多余的菌液, 接種到固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+100 μmol L–1乙酰丁香酮, pH 5.5), 28℃暗培養(yǎng)2~3 d。隨后, 將經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿, 用無(wú)菌水沖洗2~3次。將愈傷組織轉(zhuǎn)入含潮霉素的選擇性培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+羧芐青霉素500 mg L–1+潮霉素50 mg L–1), 28℃避光培養(yǎng)7 d。第2輪篩選培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基+羧芐青霉素250 mg L–1+潮霉素50 mg L–1, 在28℃培養(yǎng)箱避光繼續(xù)培養(yǎng)2周。然后, 選擇生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+2.5 mg L–1KT+0.5 mg L–1NAA+羧芐青霉素250 mg L–1+潮霉素50 mg L–1), 于28℃、12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)。分化的幼苗長(zhǎng)到2 cm左右時(shí), 將其移到壯苗培養(yǎng)基(1/2 MS +1/2 B5維生素+10 g L–1蔗糖+ 50 mg L–1潮霉素)。繼續(xù)培養(yǎng)幼苗長(zhǎng)到瓶口時(shí), 打開(kāi)瓶蓋、加入少量水, 將其于自然狀態(tài)下煉苗1周左右。然后將幼苗移入營(yíng)養(yǎng)土中, 將成活的幼苗移栽至大田, 培養(yǎng)、收取種子。

利用上述方法, 將已構(gòu)建好的過(guò)量表達(dá)載體p1300:35S:、RNAi表達(dá)載體pTCK303--RNAi-1和pTCK303--RNAi-2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105后, 對(duì)水稻愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化, 最終得到35S:、-RNAi-1和- RNAi-2水稻種子。用RT-PCR檢測(cè)35S:和RNAi水稻的基因表達(dá)。

質(zhì)粒pTCK303攜帶GUS報(bào)告基因, 因此在轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織過(guò)程中, 可以對(duì)愈傷組織及分化幼苗進(jìn)行GUS基因表達(dá)的組織化學(xué)染色進(jìn)行轉(zhuǎn)基因初步鑒定。具體方法是將準(zhǔn)備好的愈傷組織、幼苗用蒸餾水沖洗干凈后放入EP管中, 加入染色液(50 μL X-Gluc母液＋950 μL基液)浸沒(méi)樣品, 封好蓋子。37℃培養(yǎng)箱中避光溫育1~12 h。將浸染過(guò)的樣品轉(zhuǎn)入95%乙醇中脫色2~3次, 至陰性對(duì)照材料呈白色為止, 在體視顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性檢測(cè) 選取p1300:35S:、pTCK303--RNAi-1和pTCK303--RNAi-2轉(zhuǎn)基因水稻T1代株系, 在潮霉素水(50 mg L–1)中浸泡, 篩選出生根長(zhǎng)芽的陽(yáng)性苗, 挑選生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致的轉(zhuǎn)基因水稻移栽入微孔板中, 用含有0 mmol L–1、140 mmol L–1NaCl水稻營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)7~10 d, 并以生長(zhǎng)狀態(tài)一致的野生型水稻作為對(duì)照進(jìn)行耐鹽性分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因水稻的生理指標(biāo)檢測(cè) 對(duì)正常培養(yǎng)7 d的野生型和轉(zhuǎn)基因水稻幼苗分別用清水和140 mmol L–1NaCl溶液澆灌6~10 d, 測(cè)定其脯氨酸含量、MDA含量。

選取葉齡相似的對(duì)照日本晴水稻與轉(zhuǎn)基因水稻的葉片, 剪成小塊, 稱(chēng)取0.2 g, 將葉片壓入10 mL蒸餾水中, 真空抽氣1 h后重新充入空氣。將樣品于室溫?cái)噭?dòng)浸提1 h后, 用電導(dǎo)儀測(cè)定樣品電導(dǎo)率。再將同樣的葉片樣品放入100℃沸水浴15 min, 轉(zhuǎn)入清水中冷卻10 min, 測(cè)定其煮沸電導(dǎo)率。相對(duì)電導(dǎo)率(%) = (處理電導(dǎo)率? 空白電導(dǎo)率) / (煮沸電導(dǎo)率? 空白電導(dǎo)率) × 100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫后OsRPK1基因在水稻中的表達(dá)模式

對(duì)10日齡水稻幼苗用140 mmol L–1NaCl溶液處理0、1、6、24 h, 分別取葉片提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。qRT-PCR檢測(cè)表明, 水稻中基因在鹽脅迫后1 h出現(xiàn)暫時(shí)的應(yīng)激性增加, 在脅迫6 h時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)持續(xù)下降, 脅迫24 h時(shí), 表達(dá)量比對(duì)照顯著下降(圖1)。

2.2 OsRPK1過(guò)表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

2.2.1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 以水稻日本晴基因組cDNA為模板, 擴(kuò)增得到基因3317 bp的目的條帶。測(cè)序正確后, 對(duì)pMD18-T-質(zhì)粒進(jìn)行I單酶切, 電泳后回收、純化3317 bp目的DNA條帶。將該基因與p1300表達(dá)載體重組融合, 對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定后, 測(cè)序判斷插入方向正確, 獲得過(guò)量表達(dá)載體p1300:35S:。

圖1 OsRPK1基因在140 mmol L–1 NaCl脅迫的水稻中表達(dá)量的變化

差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***< 0.001。

The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

2.2.2-RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建 利用設(shè)計(jì)的LP-1、RP-1和LP-2、RP-2兩對(duì)引物, PCR擴(kuò)增得到兩段長(zhǎng)度分別為350 bp、328 bp的特異性序列, 對(duì)PCR產(chǎn)物電泳、回收、連接到pMD18-T載體上, 進(jìn)行雙酶切鑒定、測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為pMD18-T--RNAi-1、pMD18-T--RNAi-2。用內(nèi)側(cè)酶IH I分別酶切兩種RNAi T載體和pTCK303載體, 回收目標(biāo)片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、酶切鑒定, 分別命名為新構(gòu)建的載體pTCK303--RNAi-antisense-1、pTCK303--RNAi-antisense-2。然后用外側(cè)酶I/I雙酶切兩種RNAi T載體質(zhì)粒和兩種pTCK303--RNAi-antisense質(zhì)粒, 回收目的片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化, 用H I單酶切鑒定分別得到1199 bp、1155 bp的DNA片段, 鑒定表明連接正確, 分別命名質(zhì)粒為pTCK303--RNAi-sense-1、pTCK303--RNAi-sense-2, 成功構(gòu)建獲得水稻pTCK303--RNAi-1、pTCK303-- RNAi-2載體。

2.2.3 水稻愈傷組織的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化 將消毒好的水稻種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)得到愈傷組織, 選擇光滑、淡黃色、較硬、大小為2~3 mm的胚性愈傷組織, 轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)3~4 d; 利用含有p1300:35S:、pTCK303--RNAi-1和pTCK303--RNAi-2的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織, 平鋪于帶有濾紙的固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d; 然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有潮霉素的第1次選擇培養(yǎng)基上, 7 d后將淡黃色、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到第2次選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選; 培養(yǎng)2周后, 將黃色、生長(zhǎng)活性良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上; 分化培養(yǎng)至發(fā)綠、生長(zhǎng)出幼苗; 最后將生長(zhǎng)出的幼苗進(jìn)行壯苗、煉苗; 然后移栽到營(yíng)養(yǎng)土中, 等其適應(yīng)外部環(huán)境后再栽種到大田, 培養(yǎng)、收獲種子。將RNAi轉(zhuǎn)基因后的水稻愈傷組織和幼苗在GUS染液中染色, 初步確定RNAi質(zhì)粒對(duì)水稻的成功轉(zhuǎn)化。

2.3 水稻OsRPK1轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和耐鹽性檢測(cè)

2.3.1 水稻轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 分別選取T1代p1300:35S:、pTCK303-- RNAi-1和pTCK303--RNAi-2轉(zhuǎn)基因水稻的OX1、OX2、OX3三個(gè)株系和對(duì)照日本晴水稻, 提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 根據(jù)序列3′端設(shè)計(jì)的引物L(fēng)P-q和RP-q, 進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)表明, 在模板量相同的條件下, 35S:水稻相對(duì)于對(duì)照水稻日本晴表達(dá)量顯著上升;-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻相對(duì)于對(duì)照水稻日本晴表達(dá)量則顯著減弱, 其中利用基因編碼區(qū)5′區(qū)域作為RNAi干涉序列的-RNAi-1表達(dá)量下降更為顯著(圖2)。

2.3.2 水稻轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性檢測(cè)

分別選取p1300:35S:、pTCK303--RNAi-1和pTCK303--RNAi-2 T1代轉(zhuǎn)基因水稻的不同株系, 以水稻日本晴作為對(duì)照進(jìn)行幼苗耐鹽性分析。

圖2 35S:OsRPK1植株與OsRPK1-RNAi植株的qRT-PCR檢測(cè)

差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、 ***< 0.001。

The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

正常水培條件下,過(guò)表達(dá)水稻與對(duì)照日本晴的長(zhǎng)勢(shì)無(wú)明顯差異(圖3-A)。140 mmol L–1NaCl脅迫處理6 d后,過(guò)表達(dá)水稻幼苗葉片出現(xiàn)明顯干枯萎蔫現(xiàn)象, 而對(duì)照日本晴水稻受鹽脅迫損傷較輕, 依舊有很多綠色葉片(圖3-B), 恢復(fù)培養(yǎng)9 d后, 過(guò)表達(dá)植株絕大多數(shù)都干枯萎蔫, 出現(xiàn)失綠現(xiàn)象, 而對(duì)照水稻依舊有部分植株存活(圖3-C)。存活率統(tǒng)計(jì)表明, 野生型水稻約為61%, 而過(guò)表達(dá)水稻OX1、OX2、OX3株系則分別僅有5.57%、6.67%、4.43%, 耐鹽性明顯下降(圖3-D)。

圖3 OsRPK1過(guò)表達(dá)水稻在鹽脅迫下的生長(zhǎng)情況

A: NaCl脅迫前; B: 140 mmol L–1NaCl脅迫6 d; C: 140 mmol L–1NaCl脅迫后恢復(fù)9 d; D: 鹽脅迫恢復(fù)培養(yǎng)后存活率統(tǒng)計(jì)。差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***< 0.001。

A: rice seedling without NaCl stress; B: treated with 140 mmol L–1NaCl for 6 days; C: recovery for nine days after 140 mmol L–1NaCl stress; D: survival rate after renewing culture under salt stress. The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

在正常水培條件下,-RNAi-1水稻與對(duì)照日本晴的長(zhǎng)勢(shì)均無(wú)明顯差異(圖4-A)。在140 mmol L–1NaCl脅迫10 d后,-RNAi-1轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照水稻相比存活綠葉更多, 生長(zhǎng)狀態(tài)較好;-RNAi-2轉(zhuǎn)基因水稻在鹽脅迫后也具有比對(duì)照野生型水稻更多的綠葉(圖4-B)?；謴?fù)培養(yǎng)7 d后,-RNAi-1轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)仍較蔥綠, 但是對(duì)照日本晴已經(jīng)全部干枯, 無(wú)法存活; 其中-RNAi-2轉(zhuǎn)基因水稻在鹽脅迫后的抗逆性與對(duì)照植株差異并不顯著, 幼苗也基本枯萎(圖4-C)。最終野生型水稻存活率為1%左右, 而- RNAi水稻株系存活率均明顯較高, 其中表達(dá)量抑制效果更好的-RNAi-1株系1-2、1-4、1-7存活率更高, 達(dá)到50%~77%; 而RNA干涉區(qū)域設(shè)計(jì)在開(kāi)放閱讀框3′下游區(qū)域的-RNAi-2株系2-1、2-3、2-5存活率約為27%~32% (圖4-D, E)。

在水稻中的過(guò)量表達(dá)降低了植株對(duì)鹽脅迫的耐受性; 而的表達(dá)被干涉后,-RNAi水稻對(duì)鹽的耐受性有所提高, 與過(guò)表達(dá)植株的表型正好相反。

2.4 水稻OsRPK1轉(zhuǎn)基因植株的生理指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 脯氨酸含量的檢測(cè) 選取p1300:35S:、兩種-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻和對(duì)照水稻日本晴植株, 分別用清水和140 mmol L–1NaCl溶液澆灌, 然后測(cè)定其脯氨酸含量表明, 鹽脅迫前,過(guò)表達(dá)水稻、兩種-RNAi水稻和野生型水稻植株的脯氨酸含量均無(wú)明顯差異; 鹽脅迫后,過(guò)表達(dá)植株脯氨酸含量顯著低于對(duì)照水稻, 而-RNAi水稻的脯氨酸含量顯著高于對(duì)照植株(圖5)。

過(guò)表達(dá)植株體內(nèi)脯氨酸合成不足可能是造成植株鹽敏感的原因之一, 而-RNAi植株體內(nèi)有更多的脯氨酸從而提高了水稻植株對(duì)鹽的耐受性。

2.4.2 MDA含量的檢測(cè) 對(duì)p1300:35S:、兩種-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻和對(duì)照水稻植株, 分別用清水和140 mmol L–1NaCl溶液澆灌培養(yǎng), 然后測(cè)定其MDA含量。表明, 脅迫前過(guò)表達(dá)水稻、-RNAi水稻和野生型日本晴水稻的MDA含量無(wú)明顯差異; 脅迫后所有水稻植株的MDA含量均顯著升高, 其中過(guò)表達(dá)水稻MDA含量顯著高于野生型日本晴水稻,- RNAi水稻的MDA含量均顯著低于野生型日本晴水稻植株(圖6)。

在鹽脅迫條件下,過(guò)表達(dá)水稻植株細(xì)胞受損程度比野生型日本晴更高,-RNAi水稻植株細(xì)胞受破損程度比野生型日本晴低。

2.4.3 相對(duì)電導(dǎo)率的檢測(cè)過(guò)表達(dá)水稻的相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于野生型日本晴水稻; 而-RNAi水稻植株的相對(duì)電導(dǎo)率則均顯著低于野生型日本晴水稻(圖7)。

圖4 OsRPK1-RNAi水稻在脅迫下生長(zhǎng)情況

A: NaCl脅迫前; B: 140 mmol L–1NaCl脅迫10 d; C: 140 mmol L–1NaCl脅迫后恢復(fù)7 d; D, E: 鹽脅迫恢復(fù)培養(yǎng)后存活率統(tǒng)計(jì)。差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***< 0.001。

A: rice seedling without NaCl stress; B: treated with 140 mmol L–1NaCl for 10 days; C: recovery for seven days after 140 mmol L–1NaCl stress; D, E: survival rate after renewing culture under salt stress. The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

圖5 140 mmol L–1 NaCl鹽脅迫后轉(zhuǎn)基因水稻脯氨酸含量

差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***< 0.001。

The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

基因過(guò)表達(dá)水稻在受到鹽脅迫時(shí), 可能會(huì)有更多的Na+離子進(jìn)入細(xì)胞之中, 從而表現(xiàn)出鹽敏感表型; 而-RNAi水稻植株則由于較低的質(zhì)膜透性, 鹽脅迫時(shí), 進(jìn)入細(xì)胞的Na+離子較少, 從而植株表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫的耐受性。

圖6 140 mmol L–1 NaCl鹽脅迫后轉(zhuǎn)基因水稻株系中MDA含量

差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***<0.001。

The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

3 討論

類(lèi)受體蛋白激酶在植物體內(nèi)能夠參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆反應(yīng)和病原反應(yīng)等途徑, 對(duì)植物的抗逆信號(hào)傳導(dǎo)具有重要意義。類(lèi)受體激酶的表達(dá)量上升往往會(huì)提高植物體的抗逆性, 如PnLRR-RLK27的過(guò)量表達(dá)提高了擬南芥對(duì)鹽、干旱、H2O2和ABA的耐受性[28]; 在擬南芥中類(lèi)受體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因的過(guò)量表達(dá)同樣提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽、干旱和ABA的耐受性[29]; An等[30]從辣椒中分離獲得的基因的表達(dá)使擬南芥提高了耐鹽性和抗病性。同時(shí), 一些類(lèi)受體激酶的表達(dá)量上升也會(huì)造成植物抗逆性的下降, 如水稻類(lèi)受體激酶SIT1可以被NaCl誘導(dǎo)表達(dá)量明顯上升, 進(jìn)而SIT1磷酸化MAPK3/6, 介導(dǎo)細(xì)胞中的乙烯傳導(dǎo)信號(hào)通路,導(dǎo)致植物活性氧的產(chǎn)生和積累, 造成細(xì)胞生長(zhǎng)受抑和死亡[31]。在苔蘚中, 凝集素受體樣激酶PnLec RLK1在低溫、鹽脅迫、干旱脅迫、外源ABA和茉莉酸甲酯脅迫下表達(dá)量迅速上升。過(guò)表達(dá)PnLec RLK1的轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫脅迫的耐受性增強(qiáng), 而對(duì)ABA的耐受性明顯減弱[32]。

圖7 轉(zhuǎn)基因水稻的相對(duì)電導(dǎo)率

差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***< 0.001。

The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

是Hong等在1997年從擬南芥中克隆到的受干旱、高鹽及低溫誘導(dǎo)的受體蛋白激酶基因。在脫落酸誘導(dǎo)、脫水、高鹽和低溫等脅迫環(huán)境下轉(zhuǎn)錄水平明顯增加[11]?；虻倪^(guò)量表達(dá)造成了擬南芥的耐鹽性明顯下降, 而基因的表達(dá)受到抑制時(shí), 擬南芥植株的耐鹽性則明顯得到提高。與基因具有高度同源性, 前期研究表明,基因過(guò)表達(dá)擬南芥與對(duì)照擬南芥相比, 其種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)階段對(duì)NaCl和ABA的耐性明顯降低[27]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式檢測(cè)表明, 水稻受到鹽脅迫時(shí),的表達(dá)量暫時(shí)升高后, 明顯下降。在水稻中實(shí)現(xiàn)的過(guò)量表達(dá)和RNA干涉, 結(jié)果表明基因表達(dá)量增加時(shí), 水稻植株對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)為抗逆性明顯降低; 在RNA干涉使其表達(dá)量下調(diào)后, 水稻植株則表現(xiàn)為耐鹽性明顯增加。通過(guò)生理檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)造成擬南芥質(zhì)膜透性增加, 在受到鹽脅迫時(shí)對(duì)細(xì)胞造成更大的損傷。前期亞細(xì)胞定位檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明, OsRPK1蛋白分布于細(xì)胞膜上, 且明顯呈簇狀分布, 這可能是過(guò)表達(dá)植株細(xì)胞膜通透性增加的原因之一。同時(shí)過(guò)表達(dá)擬南芥細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量的減少, 使其在遭受鹽脅迫時(shí)受到了更嚴(yán)重的滲透脅迫。無(wú)論在抗逆表型還是在生理指標(biāo)的變化趨勢(shì)方面,基因在水稻中的表現(xiàn)與在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表現(xiàn)一致[27]。

總之, 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證實(shí), 在水稻中基因的過(guò)表達(dá)會(huì)明顯降低植株的耐鹽性, 而對(duì)基因表達(dá)抑制后, 減弱了鹽脅迫對(duì)早期細(xì)胞質(zhì)膜的損傷, 提高了水稻植株的耐鹽性。在農(nóng)作物育種方面, 對(duì)相應(yīng)的基因敲除, 可能會(huì)獲得耐鹽性提高的品系, 為培育優(yōu)良耐鹽作物品種奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

水稻類(lèi)受體蛋白激酶基因在鹽脅迫下其表達(dá)量暫時(shí)升高后出現(xiàn)明顯下降?；虻谋磉_(dá)量對(duì)水稻耐鹽性具有明顯影響, 其表達(dá)量增加時(shí), 水稻幼苗耐鹽性下降;基因的RNA干涉則使水稻幼苗耐鹽性增加。生理指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明, 脯氨酸含量及細(xì)胞質(zhì)膜受破損程度的改變可能是造成轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽性變化的內(nèi)在原因。

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Effects ofgene overexpression and RNAi on the salt-tolerance at seedling stage in rice

LI Jing-Lan**, CHEN Xin-Xin**, SHI Cui-Cui, LIU Fang-Hui, SUN Jing, and GE Rong-Chao*

College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei, China

is a leucine-rich repeat receptor-like protein kinase (LRR-RLK) gene in rice, and its expression level decreases evidently after temporarily increasing under salt stress. Previous studies have shown that the overexpression ofcan significantly reduce the abiotic stress tolerance of. In this study,gene was overexpressed and RNA interfered in rice. The salt tolerance of the 35S:rice seedlings was significantly lower than that of the control plants. The-RNAirice seedlings exhibited higher salt tolerance than the wild-type plants. The proline content ofoverexpressed plants was lower than that of the wild type, MDA content and relative conductivity were significantly higher than those of the wild type, while the proline content of-RNAirice plants was significantly higher than those of wild type, MDA content and relative conductivity were significantly lower than those of wild type. The results of this study indicate thatplays an important role in salt tolerance of rice. The changes of proline content and the damage degree of cytoplasmic membrane may be the internal reasons for the salt-tolerance variations of the transgenic rice lines. This study lays a foundation for further elucidating the resistance mechanism ofgene, which is very important for cultivating salt-tolerance rice by adjusting the expression ofgene.

rice;genes; overexpressed; RNA interference; physiological indexes

10.3724/SP.J.1006.2020.92060

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900104)和河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2016205158)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30900104) and the Hebei Provincial Natural Science Foundation (C2016205158).

葛榮朝, E-mail: grcgp@sina.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

李晶嵐, E-mail: 83494429@qq.com; 陳鑫欣, E-mail: 1046433763@qq.com

2019-11-25;

2020-03-24;

2020-04-21.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20200421.1254.004.html