大豆生物鐘基因GmLNK1/2、GmRVE4/8和GmTOC1 CRISPR/Cas9組織表達(dá)分析及敲除靶點的鑒定

甘卓然 石文茜 黎永力 侯智紅 李海洋 程 群 董利東 劉寶輝 蘆思佳

研究簡報

大豆生物鐘基因、和CRISPR/Cas9組織表達(dá)分析及敲除靶點的鑒定

甘卓然 石文茜 黎永力 侯智紅 李海洋 程 群 董利東 劉寶輝 蘆思佳*

廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東廣州 510006

生物鐘基因能夠參與調(diào)控植物的整個生命進(jìn)程, 對提高作物產(chǎn)量具有重要的作用。(-)、()、()和()是植物中重要的生物鐘基因。本研究利用BLAST同源比對和進(jìn)化樹分析的方法分別鑒定、、、和在大豆中的同源基因, 通過qRT-PCR實驗證明這些生物鐘基因在大豆根、莖、葉等組織中均有表達(dá)。成功構(gòu)建這些基因的CRISPR/Cas9敲除載體, 并利用大豆根毛轉(zhuǎn)化體系成功鑒定出13個基因的CRISPR/CAS9有效靶點。為進(jìn)一步獲得穩(wěn)定的大豆突變體材料及研究其生物鐘基因的功能提供了理論基礎(chǔ)。

大豆; 基因敲除; 生物鐘基因; CRISPR/Cas9

單產(chǎn)低是我國大豆面臨的最大問題, 因此提高大豆單產(chǎn)是首要任務(wù)[1]。影響大豆產(chǎn)量的因素可歸為兩大類, 一是外部因素, 如耕作技術(shù)、氣候、土壤和自然災(zāi)害等; 二是內(nèi)部因素, 即基因, 兩方面的因素相互影響、協(xié)調(diào), 共同調(diào)控大豆的產(chǎn)量[2-3]。大豆作為固著生物, 必須準(zhǔn)確地感知環(huán)境信號, 如光和溫度, 以適應(yīng)其生長發(fā)育的周圍環(huán)境[4]。實際上, 大多數(shù)生物并不是簡單地對外部環(huán)境做出反應(yīng), 而是對外部環(huán)境的變化做出預(yù)測, 并根據(jù)自己的生物習(xí)性進(jìn)行調(diào)整[5]。這種內(nèi)源性生物節(jié)律就是生物鐘。生物鐘使生物體能夠預(yù)測和準(zhǔn)備應(yīng)對周圍環(huán)境中的變化[4]。生物種基因在控制植物開花、產(chǎn)量、生物脅迫和非生物脅迫中都扮演重要的角色。我們前期的研究發(fā)現(xiàn), 大豆長童期性狀關(guān)鍵位點是擬南芥生物鐘關(guān)鍵基因()的一個同源基因, 并證明在短日照下的等位變異能夠延遲大豆開花, 使大豆產(chǎn)量提高30%以上[6]。植物生物鐘由許多基因共同調(diào)控, 如()、()、()、()、(),()、()、()、()等[7]。在擬南芥中,/與是植物生物鐘的核心元件,并且形成反饋調(diào)節(jié)回路[8-9]。、和是與同源的生物鐘基因, 作為生物鐘激活因子調(diào)控下游基因的表達(dá)[9-10]。與作為轉(zhuǎn)錄共激活因子, 能夠與及相互作用, 共同調(diào)控基因的表達(dá)[11]。番茄基因的突變可導(dǎo)致番茄生物鐘周期延遲[12]。這些生物鐘基因在不同植物中引起其他性狀的變化也開始被解析。功能研究中發(fā)現(xiàn), 擬南芥//三突變體中, 光敏色素互作因子()和()表達(dá)量提高, 從而導(dǎo)致其葉片面積顯著大于野生型擬南芥植株[10]。功能研究中發(fā)現(xiàn), 番茄基因突變可導(dǎo)致番茄生物鐘周期延后, 葉綠素含量明顯增加, 有效防止番茄曬傷, 該研究指出晝夜節(jié)律中的這種條件變化可能對各物種(包括植物和動物)的緯度適應(yīng)性至關(guān)重要[12-13]。盡管這些重要的生物鐘基因在擬南芥、番茄等植物中的功能相繼被解析, 但在大豆中仍不清楚。

CRISPR/Cas9技術(shù)能夠精準(zhǔn)快速地進(jìn)行基因編輯, 因此被廣泛應(yīng)用在動物和植物中[14-17]。近些年在大豆中利用CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功對多個大豆基因進(jìn)行定點編輯。例如、、、、等, 為更加深入研究這些基因的功能, 提供了良好的遺傳材料[18-20]。大豆的基因組復(fù)雜, 生長周期長, 轉(zhuǎn)化效率低, 所以我們在利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行大豆穩(wěn)定轉(zhuǎn)化前, 確定目的基因靶點(gRNA)的有效性是十分重要的。本研究首先利用蛋白同源比對和進(jìn)化樹分析的方法成功鑒定出與擬南芥同源的大豆生物鐘基因和。并利用qRT-PCR技術(shù), 檢測這些基因在大豆植株的各個組織中的表達(dá)情況。隨后, 利用CRISPR/Cas9技術(shù), 構(gòu)建了大豆、、基因的敲除載體, 并利用大豆發(fā)根體系成功檢測出大部分基因的有效編輯靶點。為利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)造這些生物鐘基因的穩(wěn)定大豆突變體和進(jìn)一步研究這些生物鐘基因的功能提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆發(fā)根轉(zhuǎn)化材料為大豆品種Williams 82 (W82), 大腸桿菌菌株DH5α、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599均由本實驗室保存, 載體構(gòu)建質(zhì)粒AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29、Cas9載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士提供。

1.2 植物材料處理及RNA提取

將大豆品種W82種子播于缽中(草炭土∶蛭石=2∶1), 每缽6粒, 在溫度25℃、光照16 h/8 h (光照/黑暗)的溫室內(nèi)培養(yǎng)。大約14 d后, 大豆幼苗長到V1期, 取大豆的根、莖、子葉、下胚軸、初生葉、三出復(fù)葉和生長點于液氮中速凍。大豆生長到R1期(約48 d), 取大豆的花于液氮中速凍。參照RNA提取試劑盒說明書(RNA pure Plant Kit, China)提取RNA。qRT-PCR實驗分別進(jìn)行3次生物重復(fù)。

1.3 大豆生物鐘基因的鑒定和進(jìn)化樹分析

分別利用擬南芥生物鐘基因、、、、的蛋白序列, 在Phytozome 12數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析, 分別鑒定與擬南芥同源的大豆生物種基因。根據(jù)同源性由高到低, 分別將每個擬南芥生物鐘基因在大豆中4個同源基因命名為a、b、c和d。利用DANMAN軟件進(jìn)行同源比對分析。

1.4 靶點設(shè)計

利用CRISPR direct在線網(wǎng)站(http://crispr.dbcls.jp/)進(jìn)行靶點設(shè)計, 載體構(gòu)建所用基因靶點引物信息, 如表1所示。

表1 基因靶點引物列表

(續(xù)表1)

1.5 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

參照曾棟昌等[21]、侯智紅等[22]研究方法進(jìn)行載體構(gòu)建。實驗步驟如下: (1)靶點引物退火。(2)已退火的靶點與小載體AtU3d、AtU3b、AtU6-1和AtU6-29一一對應(yīng)連接, 并進(jìn)行第一次邊切邊連。(3)使用第一次邊切邊連產(chǎn)物進(jìn)行第一次PCR擴增。(4)以第一次PCR產(chǎn)物為模板, 進(jìn)行第二次PCR擴增。(5)回收第二次PCR的產(chǎn)物, 進(jìn)行第二次邊切邊連, 連接Cas9載體。(6)第二次邊切邊連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH。(7)挑取陽性單菌落, 搖菌, 提取質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌K599。

1.6 大豆根毛轉(zhuǎn)化

參照表2配制萌發(fā)及根誘導(dǎo)培養(yǎng)基, 并參照Cheng等[23]方法進(jìn)行根毛轉(zhuǎn)化。步驟如下: (1)將大豆種子滅菌, 取飽滿沒有病斑的籽粒置干燥器中, 在干燥器中放一個200 mL燒杯, 盛96 mL次氯酸鈉和4 mL濃鹽酸, 滅菌12~16 h。(2)根據(jù)表2配制大豆萌發(fā)培養(yǎng)基, 在無菌操作臺中將已滅菌的大豆種子均勻擺放到萌發(fā)培養(yǎng)基。(3)大豆種子萌發(fā)5 d左右, 根據(jù)表2配制發(fā)根培養(yǎng)基, 在無菌操作臺中利用手術(shù)刀在大豆的子葉上面切一個小洞。然后將處理的大豆子葉均勻放置到發(fā)根培養(yǎng)基上, 取20 μL含有目的載體的農(nóng)桿菌K599放到大豆子葉的小洞中。(4)將培養(yǎng)基放在大豆無菌培養(yǎng)室中, 培養(yǎng)15 d左右, 從大豆子葉的侵染部位會有根毛長出, 分別收集大豆的根毛于液氮中速凍。

1.7 基因靶點編輯有效性檢測

大豆生物鐘基因靶點編輯有效性檢測步驟如下: (1)用1.6中收集的大豆根毛提取DNA。(2)利用CRISPR/Cas9載體通用引物SP1和SP3 (表3)檢測大豆根毛是否為轉(zhuǎn)基因根毛(目的片段的長度約為2000 bp左右), 檢測每個載體20個轉(zhuǎn)基因事件以檢測靶點編輯效率。(3)根據(jù)每個基因的DNA序列, 分別設(shè)計擴增目的基因的靶點檢測特異引物。利用每個基因的靶點特異引物(表3)進(jìn)行PCR擴增目的片段, 將PCR產(chǎn)物送廣州天一輝遠(yuǎn)測序服務(wù)公司測序。(4)分析測序結(jié)果的峰圖, 如果在靶點附近發(fā)生套峰, 證明目的基因的靶點是有效的。

表2 萌發(fā)培養(yǎng)基與根誘導(dǎo)培養(yǎng)基

MES: 2-Morpholinoethanesulfonic acid.

2 結(jié)果與分析

2.1 進(jìn)化樹與同源性比對分析

在Phytozome 12數(shù)據(jù)庫中, 搜索并下載與擬南芥生物鐘基因()、()、()、()、()同源的大豆基因序列, 發(fā)現(xiàn)大豆中分別含有4個同源拷貝, 命名為()、()、()、(); 大豆中分別含有4個同源拷貝, 命名為()、()、()、(); 大豆中分別含有4個同源拷貝, 命名為()、()、()、(); 大豆中分別含有4個與同源拷貝, 命名為()、()、()、()。

利用 DNAMAN軟件, 分別與AtLNK1、AtLNK2、AtTOC1、AtRVE4、AtRVE8進(jìn)行同源性比對。表明, GmLNK1a/b/c/d在第503~618位氨基酸比較保守, 保守率約為63.38% (圖1-A)。GmLNK2a/b/c/d在第176~224、438~471和511~620位氨基酸比較保守, 保守率約為68.81% (圖1-B)。GmTOC1a/b/c/d在第27~205、553~622位氨基酸比較保守, 保守率約為72.07% (圖1-C)。GmRVE4/8a/b/c/d在第35~124、226~282位氨基酸比較保守, 與AtRVE4比對, 保守率約為73.37%, 與AtRVE8比對, 則保守率約為76.66% (圖1-D)。

表3 靶點檢測引物

(圖1)

A: AtLNK1與GmLNK1a、GmLNK1b、GmLNK1c、GmLNK1d氨基酸序列對比; B: AtLNK2與GmLNK2a、GmLNK2b、GmLNK2c、GmLNK2d氨基酸序列對比; C: AtTOC1與GmTOC1a、GmTOC1b、GmTOC1c、GmTOC1d氨基酸序列對比; D: AtRVE4、AtRVE8與GmRVE4/8a、GmRVE4/8b、GmRVE4/8c、GmRVE4/8d氨基酸序列對比。

A: amino acid sequences comparison of AtLNK1, GmLNK1a, GmLNK1b, GmLNK1c, and GmLNK1d; B: amino acid sequences comparison of AtLNK2, GmLNK2a, GmLNK2b, GmLNK2c, and GmLNK2d; C: amino acid sequences comparison of AtTOC1, GmTOC1a, GmTOC1b, GmTOC1c, and GmTOC1d; D: amino acid sequences comparison of AtRVE4, AtRVE8, GmRVE4/8a, GmRVE4/8b, GmRVE4/8c, and GmRVE4/8d.

2.2 組織特異性表達(dá)分析

生物鐘基因在整個植物生命進(jìn)程及應(yīng)答環(huán)境脅迫過程中扮演至關(guān)重要的角色, 因此檢測生物鐘基因在植物中的表達(dá)部位非常重要。通過qRT-PCR技術(shù)檢測顯示,、和、在大豆各個組織中均有表達(dá), 但表達(dá)量較低, 而在下胚軸、子葉、莖、生長點中表達(dá)較高(圖2-A);在大豆各個組織中均有表達(dá), 且在初生葉

圖2 4個生物鐘基因組織特異表達(dá)

A:///在W82中的組織特異表達(dá); B:///在W82中的組織特異表達(dá); C:///在W82中的組織特異表達(dá); D:///在W82中的組織特異表達(dá)。

A: the expression of///in soybean W82 tissues; B: the expression of///in soybean W82 tissues; C: the expression of///in soybean W82 tissues; D: the expression of///in soybean W82 tissues.

中表達(dá)最高(圖2-B);家族中4個的表達(dá)情況與家族相似,、和的表達(dá)量都很低,在下胚軸的表達(dá)量最高(圖2-C);家族則沒有明顯的規(guī)律,在三出復(fù)葉處的表達(dá)量最高,在花處的表達(dá)量最高,在生長點處的表達(dá)量最高,在花處的表達(dá)量最高(圖2-D)。

2.3 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

為了鑒定這些基因有效的基因編輯靶點, 分別將、、、16個基因的16個靶點構(gòu)建到4個CRISPR/Cas9載體上, 每個基因包含2~3個靶點, 各基因所對應(yīng)靶點如表1所示。載體結(jié)構(gòu)如圖3所示,、、和基因的T1靶點連接擬南芥的啟動子, T2靶點連接擬南芥的啟動子, T3靶點連接擬南芥的啟動子, T4靶點連接擬南芥的啟動子。

2.4 GmLNK1、GmLNK2、GmTOC1和GmRVE4/8基因的靶點有效性檢測

從圖4-A可以看出,基因的T1靶點測序峰圖在靶點附近發(fā)生套峰, 說明這個靶點是有效的。根據(jù)測序發(fā)現(xiàn)的16個基因中, 有13個被成功編輯,的LNK1T1靶點、的LNK1T2靶點、和的LNK1T4靶點可被有效編輯(圖4-A);和的靶點LNK2T1靶點,和的LNK2T4可被有效編輯(圖4-B),的RVE48T1靶點和的RVE48T4靶點可被有效編輯(圖4-C),的TOC1T2靶點, 以及和的TOC1T4可被有效編輯(圖4-D)。

3 討論

基因組定點編輯是將外源的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞染色體的特定位點上, 特異地改造基因組, 是目前研究基因功能的重要方法之一[24]。2013年, 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一個突破性的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng), 這個系統(tǒng)作為防御系統(tǒng)存在于部分古生菌和細(xì)菌的基因組中[24-27]。在植物中, CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已成功應(yīng)用于包括擬南芥、煙草、水稻、煙草、高粱、小麥、玉米、柑橘和苔類植物在內(nèi)的多種植物中[28-35]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)較傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)更加便捷高效, 應(yīng)用廣泛[36]。

大豆是古四倍體植物, 約75%的基因重復(fù)[37]。在大豆中一個基因往往存在2~4個拷貝, 而且這些基因大多是功能冗余的, 隨機突變一個基因往往不會產(chǎn)生表型[38]。隨著對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的不斷完善, 現(xiàn)已成功應(yīng)用到大豆中, 實現(xiàn)對目標(biāo)基因的定點編輯[18-19,39]。但由于大豆的轉(zhuǎn)化效率低, 基因組復(fù)雜, 生長周期長等特點, CRISPR/ Cas9技術(shù)在大豆中的應(yīng)用仍然會出現(xiàn)靶點無效的問題。生物鐘基因在植物的生長發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫中都扮演著重要的角色。但大部分生物鐘基因在大豆中的功能都沒有被解析。本試驗通過蛋白序列比對和進(jìn)化樹分析鑒定了大豆中的、、、同源基因, 初步分析了它們在大豆植株不同組織中的表達(dá)情況, 為進(jìn)一步預(yù)測這些基因在大豆的不同組織中是否具有功能提供了理論基礎(chǔ)。例如,在三出復(fù)葉中的表達(dá)量最高, 推測在大豆的葉片中具有重要功能;和在大豆的花中表達(dá)量最高, 這2個基因可能對大豆花的發(fā)育具有重要作用; 而在生長點處的表達(dá)量最高,可能與大豆的開花和生長習(xí)性有關(guān)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在應(yīng)用于大豆的過程中靶點的編輯效率存在相對低的問題。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建多個用于誘導(dǎo)大豆、、、突變的CRISPR/Cas9載體。共設(shè)計了16個靶點, 其中9個能有效編輯目的基因, 同時也發(fā)現(xiàn)9個有效的靶點能夠有效敲除13個基因。本研究設(shè)計大豆多個拷貝的同源基因CRISPR/Cas9基因敲除靶點的策略盡可能設(shè)計一個能夠同時敲除2個或2個以上基因的靶點, 在構(gòu)建一個多基因敲除載體時保證每個基因含有2個或2個以上的靶點。本研究中, 構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體能夠同時敲除的4個同源基因和的4個同源基因證明CRISPR/Cas9靶點設(shè)計策略是有效的。本研究提供了一個簡單高效的大豆多拷貝同源基因CRISPR/Cas9靶點設(shè)計策略, 保證每個基因設(shè)計2個或2個以上靶點, 同時利用大豆發(fā)根轉(zhuǎn)化體系快速檢測靶點的編輯效率, 為更加快速創(chuàng)造大豆關(guān)鍵基因的穩(wěn)定突變體提供了理論基礎(chǔ)。

圖3 Cas9載體結(jié)構(gòu)圖

a: 靶點LNK1T1、LNK2T1、TOC1T1和RVE4/8T1; b: 靶點LNK1T2、LNK2T2、TOC1T2和RVE4/8T2; c: 靶點LNK1T3、LNK2T3、TOC1T3和RVE4/8T3; d: 靶點LNK1T4、LNKT4、TOC1T4和RVE4/8T4。

a: target of LNK1T1, LNK2T1, TOC1T1, and RVE4/8T1; b: target of LNK1T2, LNK2T2,T2, and RVE4/8T2; c: target of LNK1T3, LNK2T3, TOC1T3, andRVE4/8T3; d: target LNK1T4, LNK2T4,TOC1T4, and RVE4/8T4.

圖4 發(fā)生編輯靶點的測序峰圖

A:的靶點LNK1T1、的靶點LNK1T2、的靶點LNK1T4和的靶點LNK1T4突變情況; B:的靶點LNK2T1、的靶點LNK2T1、的靶點LNK2T4和的靶點LNK2T4突變情況; C:的靶點TOC1T2、的靶點TOC1T4和的靶點TOC1T4突變情況; D:的靶點RVE4/8T1和的靶點RVE4/8T4突變情況。

A: mutations were found in target LNK1T1 of, target LNK1T2 of, target LNK1T4 ofand target LNK1T4 of; B: mutations were found in target LNK2T1 of, target LNK2T1 of, target LNK2T4 ofand target LNK2T4 of; C: mutations were found in target TOC1T2 of, target TOC1T4 ofand target TOC1T4 of; D: mutations were found in target RVE4/8T1 ofand target RVE4/8T4 of.

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Identification of CRISPR/Cas9 knockout targets and tissue expression analysis of circadian clock genes,, andin soybean

GAN Zhuo-Ran, SHI Wen-Qian, LI Yong-Li, HOU Zhi-Hong, LI Hai-Yang, CHENG Qun, DONG Li-Dong, LIU Bao-Hui, and LU Si-Jia*

School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangzhou 510006, Guangdong, China

Circadian clock genes play an important role in improving crop yield.,,,, andare important circadian clock genes in plants. Homologous genes of,,,, andin soybean were found by evolutionary tree analysis. These genes were expressed in soybean roots, stems and leaves. The knockout vectors of these genes were successfully constructed by using CRISPR/Cas9 gene editing technology. Transformation system of soybean root hair and RT-PCR were used to identify 13 genes targets effectively. The results of this study provide important target informations for further obtaining soybean mutant materials, and a foundation for further studying the function of circadian clock genes.

soybean; gene knockout; clock gene; CRISPR/Cas9

10.3724/SP.J.1006.2020.94169

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31771815, 31701445)和作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室開放課題(ZW201901)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31771815, 31701445) and the State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement (ZW201901).

蘆思佳, E-mail: lusijia@gzhu.edu.cn

E-mail: gggzzr@126.com

2019-11-07;

2020-03-24;

2020-04-07.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200404.0851.002.html