玉米陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZmNHX7的功能鑒定

張凌霄 焦珍珍 卜華虎 王逸茹 李 健, 3 鄭 軍,*

玉米陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZmNHX7的功能鑒定

張凌霄1,2焦珍珍2卜華虎2王逸茹2李 健2, 3鄭 軍1,2,*

1北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 北京 102206;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;3吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林長春 130118

植物陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡, 在抵御離子毒害過程中發(fā)揮重要作用。本研究克隆了一個(gè)編碼玉米陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因, 命名為。該基因編碼序列(coding sequence, CDS)全長3411 bp, 編碼一條含1136個(gè)氨基酸的多肽鏈。基因在玉米各組織部位均有表達(dá), 在V7 (第7片葉完全展開)時(shí)期的根和莖中表達(dá)量較高。在NaCl與LiCl的脅迫條件下, 該基因表達(dá)量上調(diào)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析將ZmNHX7與擬南芥質(zhì)膜陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX7和AtNHX8歸為一類, 亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞膜和核膜上。將基因轉(zhuǎn)入擬南芥T-DNA插入突變體中, 轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系可以恢復(fù)該突變體對Li+的耐受性。這些結(jié)果表明,編碼一個(gè)玉米質(zhì)膜陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 在緩解Li+對植物的毒害和維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡等方面發(fā)揮重要作用。

玉米;; 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; 離子毒害

鹽脅迫是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的主要非生物脅迫之一, 是一種多形態(tài)脅迫, 通過滲透脅迫、營養(yǎng)脅迫和離子毒害3種途徑來降低作物產(chǎn)量甚至導(dǎo)致植物死亡[1]。在耐鹽實(shí)驗(yàn)研究中, Li+常常被用作Na+的代替物, 因?yàn)長i+可能和Na+有相同的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及毒性目標(biāo)物, 且Li+的離子毒害性更強(qiáng)[2]。鋰是自然界中最輕的堿金屬元素, 主要以鋰輝石等礦物質(zhì)的形式存在于土壤中[3], 隨著巖石、礦物的風(fēng)化和水的下游流動(dòng), 鋰在土壤中的濃度逐漸增加, 此外鋰電池、陶瓷、玻璃等行業(yè)也使用了鋰元素[4], Li2CO3常作為情緒穩(wěn)定劑和治療躁郁癥的藥物, 這些人為活動(dòng)導(dǎo)致自然界中的Li+濃度升高[5], 許多作物正在遭受離子毒害。因此研究作物解毒和維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡的分子機(jī)理具有重要意義。

已有報(bào)道表明, 植物陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要有兩類。第一類是液泡膜型, 在液泡膜或者其他細(xì)胞器膜上表達(dá), 當(dāng)受到鹽脅迫時(shí)該類蛋白可以將Na+局域化在液泡內(nèi)從而維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)[6]。AtNHX1就是典型的液泡膜型的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[7], 在其他物種中也克隆到了該基因的同源基因。玉米Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZmNHX1是液泡膜型的, 當(dāng)玉米受到鹽脅迫時(shí), 根中的基因表達(dá)量上調(diào), 提高玉米的耐鹽性[8]。OsNHX1蛋白被定位在液泡膜上, 當(dāng)水稻細(xì)胞質(zhì)中Na+濃度過高時(shí), 它可以將Na+區(qū)隔在液泡內(nèi); 將其在水稻中過表達(dá), 水稻的耐鹽性增強(qiáng)[9-10]。第二類是質(zhì)膜型陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 主要起到有害陽離子外排的作用, 該類蛋白通常需要借助質(zhì)膜H+-ATPase水解ATP的能量將H+泵出細(xì)胞質(zhì), 產(chǎn)生跨膜的H+電化學(xué)勢梯度, 驅(qū)動(dòng)質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將細(xì)胞內(nèi)的Na+排出細(xì)胞, 降低胞質(zhì)內(nèi)Na+濃度[11-12]。Shi等[13]克隆了一個(gè)擬南芥質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX7, 該基因在維持細(xì)胞內(nèi)的鈉鉀平衡方面發(fā)揮了重要作用, 該基因突變后植物對高Na+和低K+環(huán)境的生長抑制表現(xiàn)得更加敏感。AtNHX8與AtNHX7的氨基酸序列相似性高達(dá)76%, 定位在細(xì)胞膜上的該基因被證明是一個(gè)質(zhì)膜Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 它可特異地恢復(fù)釀酒酵母突變體的Li+敏感表型而不能互補(bǔ)Na+敏感表型,基因被證明與植物體解除Li+毒性緊密相關(guān)[2,14]。

玉米是我國重要的糧飼兼用型作物, 研究表明離子毒害對玉米的生長發(fā)育具有不利影響[15]。因此了解玉米對離子脅迫的解毒機(jī)理, 深入研究玉米解除離子毒害相關(guān)基因的功能對玉米的正常生長發(fā)育具有重要意義。本研究利用組織特異性表達(dá)、脅迫誘導(dǎo)表達(dá)、轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)和亞細(xì)胞定位等方法, 對玉米7基因的功能進(jìn)行了研究, 實(shí)驗(yàn)證明其可以緩解Li+對植物的毒害作用, 維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用玉米材料為自交系B73, 擬南芥材料為野生型(wild type, WT) Columbia-0和由SALK突變體庫提供的擬南芥T-DNA插入突變體, 其編號為Salk_070497。所用菌株包括大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101, 載體包括表達(dá)載體pEarleyGate 104[16]與入門載體pGWC[17]。

1.2 基因序列獲取與分析

在擬南芥TAIR (http://www.arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫獲取擬南芥基因家族成員序列, 根據(jù)擬南芥基因家族成員序列在maize GDB (https:// www.maizegdb.org/)和NCBI (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行BLASTP分析, 獲得了7個(gè)玉米基因家族成員的基因序列與編碼氨基酸序列[8]。利用MEGA 6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6)軟件對擬南芥和玉米NHX家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析, 使用鄰近法(neighbour- joining, NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹, 設(shè)Bootstrap值為1000[18]。使用CLUSTALW程序比對蛋白序列[19], 默認(rèn)參數(shù)設(shè)置, 用GeneDoc編輯比對后的序列。

1.3 DNA提取與ZmNHX7基因克隆

采用CTAB法提取玉米基因組DNA[20]。根據(jù)CDS序列, 利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)全長引物(ZmNHX7-G-F1/R1)(表1), 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增獲取基因全長。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)含有2×Phanta Max buffer 25 μL, dNTP (2.5 μmol L–1) 1 μL, 上下游引物(10 μmol L–1)各1 μL, DNA聚合酶(1.0 U L–1) 1 μL, 模板DNA 1 μL, 用ddH2O配平至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min, 95℃變性15 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃徹底延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物與Loading buffer混合, 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳15 min后, 在凝膠成像分析儀中觀察目的條帶。

1.4 ZmNHX7基因表達(dá)分析

1.4.1組織特異性分析 取玉米B73材料V1 (第1片葉完全展開)時(shí)期的根和葉, V7 (第7片葉完全展開)和R2 (籽粒建成)時(shí)期根、莖、葉, 以及苞葉、穗軸、雄穗、花絲、籽粒等部位樣品, 置液氮中速凍, 使用植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司, Cat#DP432)提取上述樣品總RNA, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物科技有限公司, Cat#AU311-03)反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR[21]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以玉米組成型基因?yàn)閮?nèi)參(表1), 設(shè)計(jì)基因的特異性引物(ZmNHX7-Q-F/R)(表1), 每個(gè)樣品設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 在Applied Biosystems 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上分析, 導(dǎo)出CT值, 用2–ΔΔCT公式計(jì)算獲取定量結(jié)果。

表1 引物序列

1.4.2 Li+和Na+脅迫下基因的表達(dá)模式

為了研究基因在外源Li+和Na+脅迫下的表達(dá)模式, 將B73種子置濕潤的發(fā)芽紙上卷起來, 放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3 d, 待種子生根后水培。令營養(yǎng)液沒過種子根部, 2 d換一次營養(yǎng)液。培養(yǎng)7 d后用不同濃度的LiCl和NaCl處理5 h[22], 用植物總RNA提取試劑盒提取玉米幼苗總RNA, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以cDNA為模板, 以ZmNHX7-Q-F/R與為引物(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。用2–ΔΔCT公式計(jì)算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量, 設(shè)LiCl和NaCl的濃度為0時(shí),表達(dá)量為1, 計(jì)算出不同濃度LiCl和NaCl處理后玉米幼苗的表達(dá)量。

1.5 亞細(xì)胞定位

根據(jù)基因CDS序列設(shè)計(jì)引物(ZmN HX7-L-F/R)(表1), PCR擴(kuò)增獲得基因全長, 將目的片段與入門載體pGWC連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 測序正確的陽性克隆與表達(dá)載體pEarleyGate 104[23]進(jìn)行LR反應(yīng), 篩選陽性克隆, 采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞, 將空載體pEarleyGate 104轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞作為陰性對照。將亞細(xì)胞定位表達(dá)載體與膜和核膜marker PM-2K同時(shí)擴(kuò)繁, 用緩沖液將二者OD600值調(diào)成一致后, 按1∶1混合, 注射至煙草, 避光處理2~3 d后, 用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察該基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位[24-25]。

1.6 ZmNHX7的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用農(nóng)桿菌蘸花法侵染擬南芥獲取轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)純合株系。將擬南芥突變體置于MS培養(yǎng)基上, 4℃春化3 d后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室中培養(yǎng), 培養(yǎng)條件是光照16 h/黑暗8 h, 溫度22℃, 相對濕度(relative humidity, RH)為50%。7 d后將擬南芥移至培養(yǎng)土(蛭石∶營養(yǎng)土=1∶1)中培養(yǎng)約20 d, 待擬南芥初生花序生長至5~15 cm進(jìn)行侵染。將pEarleyGate 100- ZmNHX7轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101, 擴(kuò)繁后侵染擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化, 擬南芥培養(yǎng)至成熟后單株收獲種子, 即為T1代種子。pEarleyGate 100上含有草銨膦(phosphinothricin, ppt)篩選標(biāo)記, 因此將T1代種子種在含有ppt的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周, 存活的幼苗移苗培養(yǎng)至成熟即獲得T2代種子, 直至收獲的種子在含有ppt的培養(yǎng)基上完全存活, 證明已獲得轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)純合株系。經(jīng)過逐代篩選的方法共得到4個(gè)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)純合株系, 命名為COM1、COM2、COM3、COM4 (簡稱COM1~COM4)。提取4周齡的WT、、COM1~COM4的DNA, 設(shè)計(jì)基因的特異性引物(ZmNHX7-G-F2/R2)(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 提取上述材料的總RNA, 設(shè)計(jì)和基因的特異性引物(AtNHX8-G-F/R, ZmNHX7-G-F2/ R2)(表1)進(jìn)行分子驗(yàn)證。

1.7 擬南芥表型數(shù)據(jù)調(diào)查

1.7.1 擬南芥表型及鮮重?cái)?shù)據(jù)分析 將擬南芥野生型(WT)、突變體材料和4個(gè)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)材料(COM1~COM4)同期分別種在含有0 mmol L–1、5 mmol L–1、10 mmol L–1和15 mmol L–1的Li+以及50 mmol L–1、75 mmol L–1和100 mmol L–1的Na+的MS培養(yǎng)基上, 4℃春化3 d后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室, 培養(yǎng)條件是16 h光照/8 h黑暗, 溫度22℃, 濕度50% RH, 將培養(yǎng)皿水平放置, 使其垂直接受光照。于第7天拍照記錄各個(gè)株系的生長狀況, 同時(shí)選取每個(gè)處理?xiàng)l件下的每個(gè)株系各20株稱重, 統(tǒng)計(jì)植株鮮重[26]。

1.7.2 擬南芥根長情況及數(shù)據(jù)分析 將擬南芥野生型(WT)、突變體材料和2個(gè)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)材料(COM1, COM4)同期分別種在含有0 mmol L–1、5 mmol L–1、10 mmol L–1和15 mmol L–1的Li+以及50 mmol L–1、75 mmol L–1和100 mmol L–1的Na+的MS培養(yǎng)基上, 4℃春化3 d后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室, 培養(yǎng)條件同上。將培養(yǎng)皿豎直放置, 使根系豎直生長。于第7天照相記錄各個(gè)株系的根長, 同時(shí)選取每個(gè)處理?xiàng)l件下的每個(gè)株系各10株統(tǒng)計(jì)根長。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmNHX基因鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對擬南芥家族成員基因BLASTP分析,獲得7個(gè)玉米相關(guān)基因, 分別命名為(表2)[8], 其中位于玉米1號染色體上, 基因序列號為(GRMZM2G098494), 該基因全基因組序列長度為17,992 bp, CDS序列長度3411 bp, 編碼1136個(gè)氨基酸, 有22個(gè)外顯子和21個(gè)內(nèi)含子。

7個(gè)玉米和8個(gè)擬南芥NHX逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)化樹表明, ZmNHX7氨基酸序列與AtNHX7和AtNHX8同源性較高, 屬于同一個(gè)分支(圖1-A)。有研究表明AtNHX7與AtNHX8都是定位在質(zhì)膜上的陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[2,11-14], 由此推測基因也與質(zhì)膜上陽離子的逆向運(yùn)輸有關(guān)。將ZmNHX7和擬南芥陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX7和AtNHX8進(jìn)行蛋白序列比對, 結(jié)果表明ZmNHX7與AtNHX7和AtNHX8的N端高度保守, 且有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[8](圖1-B)。

表2 玉米NHX基因信息

2.2 玉米ZmNHX7基因的組織表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明在玉米V1時(shí)期的根和葉, V7和R2時(shí)期根、莖、葉, 以及苞葉、花絲、穗軸、雄穗、籽粒等部位均有表達(dá), 但在花絲中表達(dá)量最低, V7時(shí)期莖的表達(dá)量最高, 約是花絲中表達(dá)量的3倍, 其次是在V7時(shí)期的根中表達(dá)量較高, 約是花絲表達(dá)量的2.2倍(圖2)。

2.3 ZmNHX7基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示, 在不同濃度的LiCl與NaCl處理5 h后,基因的表達(dá)量顯著上升(圖3)。用10 mmol L–1LiCl處理5 h后,基因表達(dá)量上升為對照的3.24倍, 當(dāng)用30 mmol L–1LiCl處理5 h后, 表達(dá)量上升為對照的3.54倍(圖3-A)。用100 mmol L–1和400 mmol L–1的NaCl處理玉米幼苗5 h后,基因的表達(dá)量分別上升為對照條件的1.76倍和3.36倍(圖3- B)。說明基因受到外源Li+和Na+的誘導(dǎo)表達(dá)。

(圖1)

圖2 熒光定量PCR分析ZmNHX7基因在玉米不同組織中的表達(dá)

V1: 玉米第1片葉完全展開; V7: 玉米第7片葉完全展開; R2: 籽粒建成。誤差線表示3次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差, 以基因V1時(shí)期根的相對表達(dá)水平為對照。

V1: the first leaf of maize was fully expanded; V7: the seventh leaf of maize was fully expanded; R2: grain formation period. The error bar shows the standard deviation of three biological replicates, the relative expression level in root (V1) was used as the control.

圖3 ZmNHX7基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況

A:基因在不同濃度LiCl處理5 h后的表達(dá)量分析; B:基因在不同濃度NaCl處理5 h后的表達(dá)量分析。誤差線代表3個(gè)獨(dú)立重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差, *和**分別表示不同濃度離子脅迫條件下基因相對表達(dá)量與對照在< 0.05和< 0.01水平差異顯著。

A: analysis of the expression level ofafter treatment with different concentrations of LiCl for 5 hours; B: analysis of the expression level ofafter treatment with different concentrations of NaCl for 5 hours. error bars represent standard errors of three independent repetitions; * and **: the relative expression ofunder different concentrations of ion stress is significantly different from the content at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

2.4 ZmNHX7的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建ZmNHX7的亞細(xì)胞定位載體, 通過農(nóng)桿菌侵染使ZmNHX7在煙草中瞬時(shí)表達(dá), 以確定其亞細(xì)胞定位?？蛰d體在煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均可以檢測到黃色熒光(圖4-A), 而含有目的基因的表達(dá)載體只在細(xì)胞膜和核膜上檢測到了熒光信號(圖4-B), 將發(fā)紅色熒光的質(zhì)膜與核膜marker PM-2K與ZmNHX7表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化煙草, 共定位結(jié)果顯示目的基因發(fā)出的黃色熒光與定位在質(zhì)膜與核膜上的PM-2K所發(fā)的紅色熒光完全重合(圖4-C)。說明ZmNHX7定位于細(xì)胞質(zhì)膜和核膜。

圖4 ZmNHX7的亞細(xì)胞定位

A: YFP空載在煙草葉片中的表達(dá); B: ZmNHX7-YFP在煙草葉片中的表達(dá); C: 加上marker的ZmNHX7-YFP在煙草葉片中的表達(dá)。

A: localization of YFP fluorescence in tobacco leaves; B: localization of ZmNHX7-YFP fluorescence in tobacco leaves; C: localization of ZmNHX7-YFP and marker fluorescence in tobacco leaves.

2.5 ZmNHX7的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

2.5.1轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分子驗(yàn)證 提取擬南芥WT、、COM1~COM4的DNA和RNA進(jìn)行分子驗(yàn)證。用的特異性引物在WT和的cDNA中進(jìn)行擴(kuò)增, 其中WT可以擴(kuò)增出條帶,中未擴(kuò)增出條帶, 證明在突變體中已經(jīng)不能正常轉(zhuǎn)錄(圖5-A)。在WT、和COM1~ COM4的DNA中擴(kuò)增基因, COM1~COM4可以擴(kuò)增出條帶, 而WT和中沒有條帶, 證明基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入4個(gè)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系4 (圖5-B)。在WT、和COM1~COM4的cDNA中擴(kuò)增基因, COM1~COM4可以擴(kuò)增出條帶證明基因在轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系中正常轉(zhuǎn)錄(圖5-C)。

2.5.2轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株表型及鮮重統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)對擬南芥不同株系(WT、COM1~ COM4)表型觀察(圖6-A)和鮮重統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)(圖6-B),基因只對Li+敏感, 該基因突變后, 擬南芥在含有Li+的培養(yǎng)基上生長受限, 當(dāng)Li+濃度達(dá)到10 mmol L–1時(shí), 擬南芥的存活率顯著降低, 但轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)材料COM1~COM4與WT相比在表型與鮮重方面均無顯著差異, 說明的轉(zhuǎn)入可以緩解突變體對Li+的敏感性。另一方面基因?qū)a+不敏感, WT、和COM1~COM4在含有不同濃度Na+的培養(yǎng)基上表型和鮮重均無顯著差異, 這與之前的研究編碼一個(gè)專性的Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相一致, 缺失該基因擬南芥易受到Li+毒害, 但Na+對該缺陷型的影響不顯著[2,14]。在中轉(zhuǎn)入基因后可以明顯緩解Li+對擬南芥的毒害作用。

圖5 通過PCR鑒定ZmNHX7基因在擬南芥中的轉(zhuǎn)入與表達(dá)

A: RT-PCR檢測基因在WT和中的轉(zhuǎn)錄表達(dá); B:基因在不同擬南芥株系中的表達(dá); C:基因在不同擬南芥株系中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。M: D2000 plus DNA marker。

A: RT-PCR was used to verify the transcription ofgene in WT and; B: expression ofgene in differentlines; C: transcriptional expression ofgene in differentlines. M: D2000 plus DNA marker.

圖6 擬南芥不同株系表型圖及鮮重情況

A: WT、和COM1~COM4在含有0、5、15 mmol L–1LiCl, 75 mmol L–1NaCl的MS培養(yǎng)基上的生長表型圖; B: WT、和COM1~COM4在含有離子脅迫的培養(yǎng)基上生長7 d后的鮮重情況(數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD,= 20。圖柱上不同大寫字母表示在0.01水平上同一處理下的材料間差異顯著)。

A: germination and subsequent growth of wild type,and COM1–COM4 plants under MS agar medium and MS medium containing 5 or 15 mmol L–1LiCl, or 75 mmol L–1NaCl. B: the fresh weight of wild type,and COM1–COM4 after seven days of growth on medium containing ionic stress (the data are shown as mean ± SD,= 20. Bars superscripted by different capitals are significantly different at< 0.01 within a treatment).

2.5.3 根長情況分析 由不同株系擬南芥根長生長情況觀察(圖7)可知, 在Li+脅迫下, 擬南芥突變體根部的生長受到影響, 當(dāng)Li+濃度大于10 mmol L–1時(shí), 突變體的根部已停止生長, 轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系(COM1、COM4)與WT的根長在同種濃度的Li+脅迫下無顯著差異。在同濃度的Na+的處理下, WT、、COM1和COM4根長表型相近。由此可以證明基因的轉(zhuǎn)入可以緩解突變體對Li+的敏感性, 使擬南芥的根恢復(fù)正常生長。

圖7 擬南芥根長及其數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

A: WT、、COM1和COM4在含有0、5、10 mmol L–1LiCl, 50、100 mmol L–1NaCl的MS培養(yǎng)基上的根長表型圖; B: WT、、COM1、COM4在含有離子脅迫的培養(yǎng)基上生長7 d后的根長數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD,= 10。圖柱上不同大寫字母表示在0.01水平上同一處理下的材料間差異顯著)。

A: root length phenotype of WT,, COM1, and COM4 on MS medium containing 0, 5, 10 mmol L–1LiCl, and 50, 100 mmol L–1NaCl. B: the root length of WT,, COM1, and COM4 after seven days of growth on medium containing ionic stress (The data are shown as mean ± SD,= 10. Bars superscripted by different capitals are significantly different at the< 0.01 within a treatment).

3 討論

植物的正常生長離不開無機(jī)鹽, 但是鹽濃度過高會(huì)造成作物代謝不平衡、滲透脅迫及離子毒害, 進(jìn)一步引起氧化脅迫甚至死亡[27]。土壤中Li+含量過高會(huì)對作物產(chǎn)生毒害作用, 降低種子萌發(fā)率和葉綠素含量、影響干物質(zhì)積累和根系發(fā)育[5,28]、抑制花粉的產(chǎn)生和植物的節(jié)律運(yùn)動(dòng)。此外, Li+在細(xì)胞質(zhì)的積累過程中可能與蛋白質(zhì)相互作用并調(diào)節(jié)各種生化過程, 例如, Li+可能與三磷酸肌醇相互作用并抑制肌醇-1-磷酸酶活性, 因此破壞鈣依賴性信號傳導(dǎo)途徑[29]; Li+和K+具有相似的運(yùn)輸途徑, 因此Li+可能破壞依賴于K+的各種代謝功能[30]。為了使作物正常生長需要解除離子毒性, 將細(xì)胞內(nèi)多余的Li+排出體外。

已有報(bào)道AtNHX8是擬南芥陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一個(gè)專性Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 其在擬南芥的根、莖、葉、花等部位均有表達(dá), 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜, 它在解除植物體內(nèi)的Li+毒性及維持胞內(nèi)離子平衡等方面發(fā)揮重要的作用[2,14]。通過同源克隆的方法, 本研究在玉米基因組中鑒定到與擬南芥Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX8高度同源的基因, 該基因CDS全長3411 bp, 編碼1136個(gè)氨基酸, 同樣具有解除Li+毒性的作用。將ZmNHX7與AtNHX7和AtNHX8進(jìn)行蛋白序列比對發(fā)現(xiàn), 這些蛋白的N端高度保守, 這可能與它們的基因結(jié)構(gòu)相關(guān), 此類蛋白的N端對應(yīng)著跨膜區(qū), C端對應(yīng)著親水性尾巴[2,13]。有研究表明AtNHX7的C端親水區(qū)約含700個(gè)氨基酸, 其N端跨膜區(qū)和C端長鏈尾巴共同構(gòu)成一個(gè)同源二聚體結(jié)構(gòu), 無鹽脅迫時(shí), AtNHX7的C末端自抑制域與相鄰的激活域相互結(jié)合, 保持休眠狀態(tài), 在鹽脅迫下, AtNHX7蛋白C末端自抑制域被解除, 轉(zhuǎn)為活化狀態(tài), 把細(xì)胞內(nèi)過多的Na+排出細(xì)胞外, 從而減少Na+對細(xì)胞的危害, 使植物表現(xiàn)出較高的耐鹽性[31]。相較于的基因序列更長, 通過蛋白序列比對其多出的序列位于C端, 推測這部分序列可能編碼C端長鏈尾巴, 在鹽脅迫和離子毒害過程中使基因轉(zhuǎn)為活化狀態(tài), 對細(xì)胞內(nèi)金屬陽離子的外排過程發(fā)揮作用。

已有研究表明Li+對植物的毒害作用可能是由于植物細(xì)胞中的微管去磷酸化作用引起的[32]。這樣, Li+會(huì)影響葉片組織中ATP的生成, 而葉片組織中的ATP是植物組織中各種代謝過程的主要能源, ATP合成量的減少可能會(huì)使重要的細(xì)胞功能暫停, 進(jìn)一步會(huì)影響細(xì)胞的生理活性。因此較高濃度的Li+可能會(huì)影響細(xì)胞的伸長和分化, 從而降低葉面積并最終降低作物鮮重。例如, Jurkowska等[33]報(bào)道, Li+濃度達(dá)到25 mg kg–1時(shí)足以抑制燕麥的生長, 玉米和菠菜在Li+濃度達(dá)到40 mg kg–1的土壤中生長發(fā)育就會(huì)受到抑制。另外, 植物根在與Li+的接觸過程中改變了根的重力生長[34], 例如, 在富含Li+的土壤中種植玉米, 玉米的根尖受損, 根毛和根冠的發(fā)育受限[35]。在本研究中, 擬南芥基因突變后, 擬南芥解除Li+毒害的功能缺失, 比較相同濃度Li+培養(yǎng)基上的WT、和轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)純合株系的鮮重與根長情況,的鮮重降低和根長發(fā)育受限情況最為顯著, 但轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)純合株系在鮮重積累與根長發(fā)育等方面和WT相比均無顯著差異, 證明基因可以發(fā)揮離子解毒的功能, 將細(xì)胞內(nèi)多余的Li+排出體外, 維持細(xì)胞內(nèi)正常的離子平衡。有研究表明基因也可以將Na+排出細(xì)胞外, 在玉米抵御鹽脅迫的過程中也發(fā)揮了重要作用[36], 而在本研究中并沒有構(gòu)建相關(guān)的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系, 因此該結(jié)論需要進(jìn)一步研究論證。

4 結(jié)論

玉米陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZmNHX7與擬南芥Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX8親緣關(guān)系較近,在玉米各個(gè)時(shí)期組織部位均有表達(dá), 在V7時(shí)期的根和莖中表達(dá)量較高, 它被定位在細(xì)胞質(zhì)膜與核膜上, 在受到鹽離子脅迫時(shí)基因表達(dá)量上調(diào)。將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥突變體中, 經(jīng)篩選得到的純合轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系可以恢復(fù)突變體對Li+的敏感性。表明在解除Li+毒害和維持植物細(xì)胞內(nèi)離子平衡等方面發(fā)揮重要作用。

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Functional identification of maize cation/proton antiporter ZmNHX7

ZHANG Ling-Xiao1,2, JIAO Zhen-Zhen2, BU Hua-Hu2, WANG Yi-Ru2, LI Jian2,3, and ZHENG Jun1,2,*

1College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin, China

Plant cation/proton antiporters can maintain intracellular ion homeostasis and resist ion toxicity. In this study, a gene encoding a maize cation/proton antiporter was cloned and named as. The coding sequence ofwas 3411 bp, encoding a protein with 1136 amino acids.is ubiquitously expressed in various tissues of maize, With higher expression level in roots and stems at the V7 stage. The expression ofwas induced by NaCl and LiCl stresses. In phylogenetic tree ZmNHX7 showed a close relation with AtNHX7 and AtNHX8of. ZmNHX7 was located in cell membrane and nuclear membrane by confocal laser scanning microscopy analysis of the lower epidermis of tobacco leaves. Whengene was transformed into theT-DNA insertion mutant, the transgenic complementary lines could restore the tolerance ofto Li+. These results indicate thatencodes a plasma membrane cation/proton antiporter of maize, which plays an important role in reducing the toxicity of Li+to plants and maintaining intracellular ion homeostasis.

maize;; antiporter; ion toxicity

10.3724/SP.J.1006.2020.93062

本研究由國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0101002)資助。

This work was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0101002).

鄭軍, E-mail: zhengjun02@caas.cn

E-mail: 13522840682@163.com

2020-02-06;

2020-03-24;

2020-04-03.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200402.2005.004.html