基于高密度SNP遺傳圖譜的粳稻芽期耐低溫QTL鑒定

姜樹坤 王立志 楊賢莉 李 波 母偉杰 董世晨 車韋才 李忠杰 遲力勇 李明賢 張喜娟 姜 輝 李 銳 趙 茜 李文華,*

基于高密度SNP遺傳圖譜的粳稻芽期耐低溫QTL鑒定

姜樹坤1,*王立志1楊賢莉1李 波2母偉杰3董世晨3車韋才3李忠杰1遲力勇1李明賢1張喜娟1姜 輝2李 銳1趙 茜1李文華2,*

1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所/ 黑龍江省寒地作物生理生態(tài)重點實驗室/ 黑龍江省農(nóng)作物低溫冷害工程技術(shù)研究中心, 黑龍江哈爾濱 150086;2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150086;3哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150025

水稻直播由于省時、省工和節(jié)約成本而備受農(nóng)戶關(guān)注。然而, 芽期耐冷性不強致使現(xiàn)行推廣的許多優(yōu)良水稻品種不適于直播生產(chǎn)。因此, 挖掘鑒定芽期耐冷位點, 為后續(xù)的輔助育種提供基因資源就日益受到重視。本研究利用麗江新團黑谷和沈農(nóng)265構(gòu)建的重組自交系群體及其重測序構(gòu)建的包含2818個bin標(biāo)記的遺傳圖譜對水稻芽期的耐冷性進行QTL定位分析。共檢測到5個芽期耐冷QTL, 分布在水稻的1號、3號、9號和11號染色體上, 增效等位基因均來自耐冷親本麗江新團黑谷。這些QTL的LOD值的范圍從3.05到24.01, 表型貢獻率為8.0%~53.5%。其中, 表型貢獻率最大的主效QTL是, 位于11號染色體長臂端的21.24 Mb~22.03 Mb之間, 物理圖譜區(qū)間為790 kb。隨后利用“選擇作圖”的策略進行了QTL驗證和累加效應(yīng)分析, 明確了可以通過QTL的累加聚合實現(xiàn)芽期耐冷能力的遺傳改良, 聚合的增效QTL越多, 耐冷能力提升越明顯。上述研究結(jié)果不僅可以增強人們對芽期水稻耐冷能力遺傳基礎(chǔ)的認識和理解, 也可以為后續(xù)直播品種的遺傳改良提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

粳稻; 芽期耐冷性; 重測序; 遺傳圖譜; 數(shù)量性狀基因座

作為世界上最重要的糧食作物之一, 水稻起源于熱帶、亞熱帶, 相較小麥、大麥等作物, 對低溫更加敏感[1]。冷害是全球性自然災(zāi)害, 在世界許多國家均有發(fā)生, 尤以澳大利亞南部、日本、巴西、韓國、朝鮮為甚, 大規(guī)模冷害的發(fā)生會造成數(shù)十上百億公斤糧食的損失[2-6]。我國多數(shù)稻作區(qū)均有低溫冷害發(fā)生, 在華南和長江中下游的雙季稻區(qū), 春季的“倒春寒”和秋季的“寒露風(fēng)”常常引起低溫冷害[7]。東北地區(qū)平均3~4年就會遭遇一次大范圍的冷害, 造成水稻大量減產(chǎn), 危害糧食安全[8]。水稻萌發(fā)期、芽期、苗期、孕穗期、開花期和灌漿期易受低溫冷害影響[9-10], 與產(chǎn)量有直接或間接關(guān)系。20世紀90年代以來, 我國的水稻生產(chǎn)發(fā)生了較大的變化。一方面, 水稻生產(chǎn)目標(biāo)從追求產(chǎn)量向降低成本、提高經(jīng)濟效益轉(zhuǎn)變; 另一方面, 隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展, 農(nóng)村主要勞動力向城鎮(zhèn)轉(zhuǎn)移, 農(nóng)村勞動力緊缺已成為水稻生產(chǎn)發(fā)展的主要限制因素。在這樣的背景下, 水稻直播由于省時、省工和節(jié)約成本, 深得農(nóng)民的歡迎, 并迅速推廣。據(jù)不完全統(tǒng)計, 水稻直播面積在安徽省已達56.7萬公頃, 湖北省為49萬公頃, 江西省為43.3萬公頃, 江蘇省為69.3萬公頃, 浙江省為37.3萬公頃, 廣東省為10萬公頃, 黑龍江省的直播稻面積為40萬公頃[11-12]。華南雙季稻區(qū)早稻直播和東北高寒稻區(qū)的單季稻直播往往會遇到春季低溫天氣, 造成缺苗斷壟, 導(dǎo)致嚴重減產(chǎn)[9-12]。這就要求用于直播的水稻種子有較強的芽期耐低溫能力。而上述稻作區(qū)一直以育秧移栽為主, 芽期耐低溫能力長期不作為育種目標(biāo), 致使許多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的水稻品種由于芽期耐低溫能力弱而不能用作直播稻, 限制了直播稻的生產(chǎn)。因此, 水稻芽期耐冷性是其生長發(fā)育過程中不可忽視的重要性狀。

自從20世紀30年代, 科研人員開始研究水稻冷害以來, 已在冷害發(fā)生的氣象學(xué)原因、水稻耐冷的生理機制、遺傳解析和基因克隆等方面積累了大量的研究成果[1,13-19]。但與萌發(fā)期、苗期和孕穗期冷害相比, 人們在水稻芽期耐冷性方面的研究稍顯不足, 目前主要開展的是芽期耐冷基因的QTL定位研究。嚴長杰等[20]利用南京11和巴利拉的DH群體, 在7號染色體上鑒定出1個芽期冷害QTL。Zhang等[21]利用Lemont和特青的重組自交系群體, 在3號、7號和11號染色體上檢測到3個控制水稻芽期耐冷性的QTL。喬永利等[22]利用密陽23和吉冷1號的F2:3群體, 在2號、4號和7號染色體上檢測到3個芽期耐冷QTL。陳瑋等[23]利用Lemont和特青的重組自交系群體, 在1號、3號、7號和11號染色體上檢測到4個控制水稻芽期耐冷性的QTL。張露霞等[24]利用Asominori和IR24的重組自交系群體和相應(yīng)的染色體片段置換系, 在5號和12號染色體上檢測到3個芽期耐冷QTL。鞏迎軍等[25]利用越光和Kasalath的回交重組自交系群體, 在4號、6號和11號染色體上檢測到4個芽期耐冷QTL。林靜等[26]利用以秈稻9311為受體、粳稻日本晴為供體的染色體片段置換系, 在5號和7號染色體上鑒定出4個芽期耐冷QTL。Baruah等[27]利用栽培稻A58和野生稻W(wǎng)107的重組自交系群體, 在1號、11號和12號染色體上檢測到了3個芽期耐冷QTL。Ji等[28]利用TN1和春江06的DH群體, 在2號、4號和11號染色體上鑒定出3個芽期耐冷QTL。周勇等[29]利用秈稻9311為受體、粳稻日本晴為供體的染色體單片段置換系, 在除1號和11號染色體以外的10條染色體上檢測出18個芽期耐冷QTL。楊洛淼等[30]利用空育131和東農(nóng)422的重組自交系群體, 在4號染色體上檢測到1個芽期耐冷QTL。朱金燕等[31]利用廣陸矮4號為受體, 日本晴為供體的染色體片段置換系, 在1號、6號、8號、9號和10號染色體上檢測到8個芽期耐冷QTL。Yang等[32]利用華粳秈74為受體, 南洋占為供體的染色體片段置換系, 在5號和6號染色體上鑒定了2個芽期耐冷QTL。Zhang等[33]利用249份秈稻種質(zhì)資源材料結(jié)合5K水稻芯片進行芽期耐冷的GWAS分析, 在1號、3號、4號、5號、6號、10號和12號染色體上共檢測到13個芽期耐冷相關(guān)區(qū)域。

雖然人們對芽期耐冷性進行了較多的QTL鑒定分析, 而且在水稻的12條染色體上均檢測到了QTL的存在, 但鑒定到的QTL多為微效QTL, 進行精細定位和后續(xù)研究難度較大。同時, 由于研究所用的遺傳群體和試驗環(huán)境等方面的不同, 研究結(jié)果不盡相同, 因此有必要采用與以往不同的遺傳群體和更高密度的遺傳圖譜來對已報道的芽期耐冷QTL進行驗證, 并檢測新的芽期耐冷位點。本研究利用麗江新團黑谷和沈農(nóng)265構(gòu)建的重組自交系群體, 結(jié)合重測序技術(shù)構(gòu)建的高密度bin遺傳圖譜, 挖掘控制芽期耐冷性的QTL, 以期為直播稻的耐冷設(shè)計育種提供有用的“基因資源”, 同時為闡明水稻芽期耐冷的遺傳和分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2004年, 以芽期耐冷性強的云南地方粳稻品種麗江新團黑谷(LTH)為母本, 芽期耐冷性弱的北方超級稻品種沈農(nóng)265 (SN265)為父本配制雜交組合, 2005—2013年分別在遼寧沈陽(2005—2006, 2008—2009)、海南三亞(2008)和黑龍江哈爾濱(2011—2015)三地, 采用單粒傳法(single seed descent, SSD)套袋自交11代獲得包含144個株系的穩(wěn)定遺傳重組自交系群體(recombinant inbred lines, RILs)。

參照Huang等[34]報道的重測序手段, 采用“滑動窗口”法構(gòu)建了麗江新團黑谷和沈農(nóng)265的重組自交系群體bin遺傳圖譜。該bin連鎖圖譜共包含58,738個重組熱點, 平均每個株系405個重組熱點。最終產(chǎn)生了2818個重組bin標(biāo)記(圖1-A), 這些標(biāo)記覆蓋了大部分的重組熱點(圖1-B), 平均每條染色體上覆蓋235個bin標(biāo)記, 標(biāo)記區(qū)間平均為128.8 kb[35]。

1.2 芽期耐冷性評價方法

親本麗江新團黑谷(LTH)、沈農(nóng)265 (SN265)和144份重組自交系群體材料存放于種子儲藏柜中待用, 儲藏條件為溫度5°C, 相對濕度為10%。評價芽期耐冷性參照韓龍植等[36]的方法略作修改, 每個株系3次重復(fù), 利用3次的平均值進行后續(xù)分析。首先將種子從儲藏柜中取出, 在50°C恒溫干燥箱內(nèi)高溫處理48 h, 使其充分干燥并打破種子休眠。每次重復(fù)挑選飽滿粒100粒, 經(jīng)0.1%的氯化汞溶液消毒10 min, 自來水沖洗3~4次, 去離子水洗滌3次, 于墊雙層濾紙的直徑9 cm培養(yǎng)皿中, 加入10 mL去離子水。蓋上培養(yǎng)皿蓋, 在30°C恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒MGC-250)內(nèi)催芽2~3 d。然后從恒溫箱中取出, 用去離子水沖洗1~2次。從發(fā)芽的種子中精心挑選芽長約1~2 cm的種子50粒, 種植于邊長2 cm的營養(yǎng)缽盆中, 缽盆中事先放置配制好的營養(yǎng)育苗土。28°C光照培養(yǎng)箱(上海一恒MGC-450HP)內(nèi)放置1 d后, 轉(zhuǎn)入大型人工氣候箱(日本三江平原項目援建霜凍害實驗室)內(nèi)處理48 h, 溫度條件為2°C。處理后, 將試驗材料轉(zhuǎn)移到溫度為20~30°C, 并有陽光的地方, 使其恢復(fù)生長, 每天適量澆水。恢復(fù)10 d后, 調(diào)查秧苗生長狀態(tài)。按照圖2的標(biāo)準(zhǔn)給處理后的秧苗恢復(fù)狀態(tài)賦值, 共分為5級: 恢復(fù)后幼芽枯死的賦值為0; 恢復(fù)后幼芽停止發(fā)育, 出現(xiàn)畸形的賦值為1; 恢復(fù)后有一定生長能力, 葉色較淡, 但發(fā)育非常緩慢的賦值為2; 恢復(fù)后生長能力較強, 葉色淡, 發(fā)育較緩慢的賦值為3; 恢復(fù)后葉色較深, 能夠快速生長的賦值為4。并按照不同級別進行加權(quán)計分。芽期耐冷級別=(0×0級的株數(shù)+1×1級的株數(shù)+2×2級的株數(shù)+3×3級的株數(shù)+4×4級的株數(shù))/處理的材料總株數(shù)。

圖1 麗江新團黑谷-沈農(nóng)265重組自交系群體的物理圖譜(A)和基因型(B)

物理圖譜位置基于日本晴參考基因組(MSU Rice Genome Annotation Project Release 7), 黃色表示沈農(nóng)265; 藍色表示麗江新團黑谷。

Physical position is based on MSU Rice Genome Annotation Project Release 7 sequence. Yellow: SN265 genotype; Blue: LTH genotype.

圖2 水稻芽期冷害評價等級標(biāo)準(zhǔn)

1.3 芽期耐冷性的QTL鑒定和QTL效應(yīng)分析

采用R/qtl的CIM方法進行QTL定位, 采用命令進行排列組合1000次的LOD閾值(α=0.05)確定, 當(dāng)實際求得的LOD值大于LOD閾值時, 就認為該區(qū)段存在1個QTL, 其置信區(qū)間為LOD峰值向下1個LOD值單位的區(qū)間[37]。

為了進一步驗證本試驗定位結(jié)果的準(zhǔn)確性, 同時評價篩選到的QTL累加效應(yīng), 利用“選擇作圖”策略進行QTL驗證和累加效應(yīng)分析[38]。首先將控制芽期耐冷的其他QTL位點根據(jù)分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進行非增效基因的固定, 以此來避免其他QTL對后續(xù)分析的影響, 然后在RILs群體中篩選目標(biāo)QTL區(qū)間的重組交換單株, 進而對QTL進行驗證和累加效應(yīng)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本的芽期耐冷性比較及群體的芽期耐冷性分布

課題組前期的研究表明, 麗江新團黑谷與沈農(nóng)265在多個不同時期的耐冷相關(guān)性狀上存在顯著差異, 麗江新團黑谷具有更優(yōu)秀的綜合耐冷特性。本研究中, 2個親本在2°C低溫處理2 d并恢復(fù)10 d后, 沈農(nóng)265的平均芽期耐冷等級僅為0.813, 而麗江新團黑谷高達3.188 (圖3和圖4), 差異達到極顯著水平。重組自交系群體的芽期耐冷性等級分布范圍為0.313~3.688, 平均值為1.699, 標(biāo)準(zhǔn)差為0.767。整體上呈現(xiàn)近似正態(tài)分布, 并表現(xiàn)出較強的超親分離(圖4)。

圖3 親本麗江新團黑谷和沈農(nóng)265芽期不經(jīng)冷處理(A)和冷處理后(B)的比較

圖4 重組自交系群體的芽期耐冷性分布

2.2 群體芽期耐冷性的QTL分布與效應(yīng)

利用R/qtl軟件共檢測到5個控制水稻芽期耐冷性的QTL, 分布在水稻的1號、3號、9號和11號染色體上, 這些QTL的增效等位基因均來自于麗江新團黑谷(表1和圖5)。表型貢獻率最大的主效QTL是(LOD值為24.01), 位于11號染色體長臂端的21.24 Mb~22.03 Mb之間, 區(qū)間大小0.79 Mb。另外兩個貢獻率大于15%的主效QTL是(LOD值為5.36)和(LOD值為8.58), 分別位于水稻第9染色體上19.90 Mb~22.30 Mb之間和11號染色體上8.53 Mb~9.93 Mb之間, 區(qū)間大小分別為2.40 Mb和1.40 Mb。兩個微效QTL是(LOD值為3.26)和(LOD值為3.05), 分別位于水稻1號染色體上0.43 Mb~0.93 Mb之間和3號染色體上29.40 Mb~32.87 Mb之間, 區(qū)間大小分別為0.50 Mb和0.61 Mb。沒能從沈農(nóng)265中檢測到芽期耐冷性的增效等位QTL。

表1 利用麗江新團黑谷-沈農(nóng)265的重組自交系群體檢測的芽期耐冷QTL信息

a在水稻物理圖譜上的位置(單位: Mb)。

aPositions in physical linkage map (unit: Mb). LTH: Lijiangxintuanheigu.

圖5 控制芽期耐冷性的QTL在染色體上的位置分布

: 低溫誘導(dǎo)的鋅指蛋白[46];: 參與冷脅迫的E3泛素連接酶[47];,: 低溫誘導(dǎo)的AP2/ EREBP轉(zhuǎn)錄因子基因[48];: 芽期耐冷QTL[27]。

: cold inducible zinc finger protein[46];: a rice E3-Ubiquitin Ligase in the modulation of cold stress response[47];: cold inducible AP2/EREBP transcription factor gene[48];: a QTL for cold tolerance at bud stage[27].

2.3 芽期耐冷性QTL的驗證和累加效應(yīng)分析

我們對檢測到的芽期耐冷QTL進行了驗證并評價了這些QTL的互作和累加效應(yīng)。首先, 將控制芽期耐冷性的其他QTL利用分子標(biāo)記輔助進行非增效基因的固定, 然后在重組自交系群體中篩選目標(biāo)區(qū)間(待評價QTL區(qū)間)為增效等位基因的單株, 進而對這5個QTL進行驗證。隨后, 利用類似的策略, 通過標(biāo)記輔助選擇出不同QTL組合的單株, 進行QTL的互作分析和累加效應(yīng)評價。不導(dǎo)入任何芽期耐冷QTL株系的芽期低溫抗性等級為0.80 (圖6和圖7-A, X), 含有1個QTL株系的芽期低溫抗性等級從1.03到2.33 (圖6和圖7-C~F), 含有的株系具有最高的芽期低溫抗性等級(圖6和圖7-G)。含有2個QTL株系的芽期低溫抗性等級從1.67到2.82 (圖6和圖7-H~M), 含有株系的芽期低溫抗性等級普遍較高(2.44~2.82), 2個QTL之間的作用總體上表現(xiàn)為簡單的加性效應(yīng), 互作效應(yīng)較弱。由于受群體規(guī)模的影響, 并沒有覆蓋到全部的3個QTL聚合類型, 篩選到的6個類型含有3個QTL株系的芽期低溫抗性等級從1.33到2.98 (圖6和圖7-N~S), 與兩個QTL聚合的規(guī)律類似, 含有株系的芽期低溫抗性等級普遍較高(2.52~2.98), 3個QTL之間的作用總體上也表現(xiàn)為簡單的加性效應(yīng)。4個QTL聚合的株系檢測到3個類型, 均含有和, 它們的芽期低溫抗性等級從3.00到3.06 (圖6和圖7-T~V)。共檢測到同時聚合5個QTL的株系8個, 它們的芽期低溫抗性等級從2.94到3.50 (圖6和圖7-W)。通過上述分析, 基本確定了芽期耐低溫QTL在重組自交系群體中聚合時主要表現(xiàn)為加性效應(yīng)。

圖6 芽期耐冷QTL的驗證和聚合效應(yīng)分析使用的重組單株基因型

“-”: 缺失。“-”: missing.

3 討論

3.1 水稻芽期耐冷性評價方法的比較

水稻芽期耐冷能力是決定水稻直播成苗率和整齊度的重要農(nóng)藝性狀, 尤其是在北方稻區(qū)和南方雙季稻早稻進行直播栽培的重要抗逆性狀。近年來, 隨著直播技術(shù)的改良, 越來越多的地區(qū)在水稻直播時選擇“芽種直播”或“盲谷播種”, 使得芽期耐冷特性成為決定品種是否適宜直播栽培的關(guān)鍵因素。因此, 準(zhǔn)確評價試驗材料的芽期耐冷特性就變得越來越重要。芽期耐冷鑒定方法中比較常用的是利用低溫培養(yǎng)箱處理萌芽后的種子, 并利用秧苗成活率作為評價指標(biāo), 這種方法簡單、直觀、結(jié)果可靠[22-33]。本研究對這種方法進行了進一步的改進, 主要包括以下幾個方面: 一是低溫處理的溫度和時間, 前人報道中, 多采用5°C 5 d[22-33], 本研究采用了2°C 2 d,既滿足了低溫處理的低溫條件, 又縮短了處理時間。二是低溫處理后的秧苗培養(yǎng)方式, 前人多使用全程水培[22-25], 本研究選擇土培, 這樣更接近水稻直播生產(chǎn)實際。三是芽期冷害等級的評價方式, 前人多是簡單地將處理緩苗后的秧苗成活率作為芽期耐冷性鑒定的指標(biāo)[22-25], 本研究為了更全面地反映每一個株系的綜合抗性, 采用了不同級別加權(quán)合計的方式評價某一株系整體的耐冷水平。通過上述改進, 不僅縮短了處理時間, 而且還提高了鑒定的精準(zhǔn)度。

3.2 重測序技術(shù)和高密度bin標(biāo)記遺傳圖譜在水稻QTL分析中的應(yīng)用

隨著重測序成本的大幅下降和測序數(shù)據(jù)利用技術(shù)的日益成熟, 利用重測序技術(shù)結(jié)合“滑動窗口”法構(gòu)建bin遺傳圖譜已成為水稻[39-41]、玉米[42-43]、高粱[44]等作物農(nóng)藝性狀遺傳研究的重要技術(shù)手段。與傳統(tǒng)的分子標(biāo)記相比, 重測序獲得的SNP標(biāo)記具有高基因組覆蓋度和高密度的優(yōu)勢, 它不僅顯著提高了QTL鑒定和定位的準(zhǔn)確性和精確性, 而且能夠為后續(xù)的基因功能研究提供相對較小的染色體區(qū)間參考。本研究利用包含2818個bin標(biāo)記的遺傳圖譜分別將控制水稻芽期耐冷性的QTL定位到了0.50 Mb~2.40 Mb的區(qū)間內(nèi), 最小的物理區(qū)間分別是500 kb ()和790 kb (), 相對較大的物理區(qū)間也僅分別是1.40 Mb ()、2.40 Mb ()和3.47 Mb (), 這遠遠小于傳統(tǒng)分子標(biāo)記高達5~10 cM的定位區(qū)間(約4 Mb~10 Mb)。500 kb左右的QTL定位區(qū)間雖然離直接完成基因克隆尚有一定的差距[45], 但是也為后續(xù)的精細定位提供了足夠小的物理區(qū)間。此外, 傳統(tǒng)的QTL分析作圖群體主要是秈-粳亞種間雜交得到的, 少數(shù)為秈-秈交群體, 很少使用兩個粳稻作為親本材料的遺傳群體, 主要是因為粳稻亞種內(nèi)的多態(tài)性遠遠小于秈稻亞種內(nèi), 與秈-粳亞種間的多態(tài)性相比, 更是差距極大[46]。重測序技術(shù)成為解決這一問題的有效手段, 使得利用粳-粳交群體也可以構(gòu)建高密度的遺傳圖譜, 為研究粳稻食味品質(zhì)、孕穗期障礙型冷害等要求雙親均為粳稻的實驗提供了極大的便利。

圖7 控制芽期耐冷性的QTL效應(yīng)及在LTH-SN265重組自交系群體中的聚合效果分析

A: 親本沈農(nóng)265 (SN265); B: 親本麗江新團黑谷(LTH); C~G:、、、和的芽期耐冷效應(yīng); H:和的芽期耐冷聚合效應(yīng); I:和的芽期耐冷聚合效應(yīng); J:和的芽期耐冷聚合效應(yīng); K:和的芽期耐冷聚合效應(yīng); L:和的芽期耐冷聚合效應(yīng); M:和的芽期耐冷聚合效應(yīng); N:、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); O:、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); P:、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); Q:、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); R:、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); S:、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); T:、、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); U:、、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); V:、、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); W:、、、和的芽期耐冷聚合效應(yīng); X: 無QTL的株系表型。

A: Shennong 265 (SN265); B: Lijiangxintuanheigu (LTH); C–G: Cold tolerance effect of,,,, andat bud stage; H: Cold tolerance cluster effect ofandat bud stage; I: Cold tolerance cluster effect ofandat bud stage; J: Cold tolerance cluster effect ofandat bud stage; K: Cold tolerance cluster effect ofandat bud stage; L: Cold tolerance cluster effect ofandat bud stage; M: Cold tolerance cluster effect ofandat bud stage; N: Cold tolerance cluster effect of,,andat bud stage; O: Cold tolerance cluster effect of,,andat bud stage; P: Cold tolerance cluster effect of,,andat bud stage; Q: Cold tolerance cluster effect of,,andat bud stage; R: Cold tolerance cluster effect of,,andat bud stage; S: Cold tolerance cluster effect of,,andat bud stage; T: Cold tolerance cluster effect of,,,andat bud stage; U: Cold tolerance cluster effect of,,andat bud stage; V: Cold tolerance cluster effect of,,,andat bud stage; W: Cold tolerance cluster effect of,,,,andat bud stage; X: none QTL line.

3.3 耐冷QTL全部來自LTH的可能原因及利用RIL群體進行QTL聚合評估的可行性

本研究中發(fā)現(xiàn)SN265和LTH構(gòu)建的重組自交系群體存在芽期耐冷性的超親分離, 但檢測到的耐冷QTL全部來自LTH, 其原因主要是QTL檢測時, 為了盡可能降低假陽性, 使用了相對較高的LOD閾值(3.0)。如果將LOD閾值降低到2.4, 能檢測到一個可能的QTL-, 其LOD值僅為2.45, 表型貢獻率很小, 僅為5.8%, 加性效應(yīng)值為?0.13。該QTL的耐冷增效等位基因來自沈農(nóng)265, 但由于表型貢獻率太小, 還需要構(gòu)建該QTL的高世代回交群體進行真?zhèn)悟炞C。此外, 對檢測的QTL進行效應(yīng)評價, 尤其是對QTL進行聚合效果分析是QTL用于水稻育種實踐的重要前提。但是, 一般而言, 由于重組自交系中導(dǎo)入片段相對較多, 排除遺傳背景的噪音影響難度很大, 很可能影響QTL累加效應(yīng)評估。所以, 重組自交系較少用于QTL的累加效應(yīng)評估。本研究采用了“選擇作圖”的方法進行QTL的累加效應(yīng)分析, 該方法的關(guān)鍵就是充分發(fā)揮已構(gòu)建的高密度物理圖譜和詳細的群體基因型數(shù)據(jù)將目標(biāo)QTL以外的其他QTL進行基因型固定, 以盡可能排除遺傳背景的影響。我們之前也成功利用這一方法分析了水稻根系的QTL聚合效果[38]。當(dāng)然, 以選擇作圖分析QTL聚合效果的能力肯定不如近等基因系或染色體片段代換系, 但在沒有更高級的遺傳群體時, 仍不失為一種有效手段。

3.4 本研究鑒定的水稻芽期耐低溫QTL與其他研究結(jié)果的比較和育種應(yīng)用潛力

隨著農(nóng)村勞動力的大規(guī)模轉(zhuǎn)移和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的不斷攀升, 水稻直播生產(chǎn)越來越受到黑龍江省地廣人稀的農(nóng)業(yè)主產(chǎn)區(qū)農(nóng)戶的重視。但是, 由于獨特的寒地生態(tài)環(huán)境, 黑龍江水稻直播不得不面對春季的低溫環(huán)境。水稻芽期耐冷性是在低溫下水稻幼芽細胞維持生活的能力, 從外觀上表現(xiàn)為幼芽誘發(fā)和維持綠苗的能力, 是水稻直播必具備的重要農(nóng)藝性狀[22]。本文從芽期耐冷性強的云南地方粳稻品種麗江新團黑谷中, 鑒定出5個控制芽期耐低溫能力的QTL, 同QTL數(shù)據(jù)庫(Q-TARO: http://qtaro.abr.affrc. go.jp/)搜集整理的耐冷相關(guān)QTL比對發(fā)現(xiàn),附近有一個已知的受冷誘導(dǎo)的鋅指蛋白基因, 該基因過量表達可以增強水稻耐冷性, 同時增加脯氨酸含量[47]。區(qū)間內(nèi)包含一個已知的耐冷相關(guān)基因, 它通過與互作來參與水稻的冷脅迫反應(yīng)[48]。區(qū)間內(nèi)包含2個成簇存在的耐冷相關(guān)基因, 分別是和, 二者均受冷誘導(dǎo), 參與水稻的冷脅迫反應(yīng)[49]。附近沒有發(fā)現(xiàn)已經(jīng)鑒定的冷害相關(guān)QTL和基因, 是一個新發(fā)現(xiàn)的位點。主效QTL-與Baruah等[27]鑒定的芽期耐冷QTL-位于相同的區(qū)間,來源于北海道地方品種A58。綜上可以看出, 控制水稻芽期耐冷性的QTL在不同遺傳背景條件下具有一定的重演性, 而且第11染色體上鑒定的主效位點具有較大的后續(xù)研究價值。我們也利用“選擇作圖”的方法評價了這些QTL的育種潛力和聚合效果, 發(fā)現(xiàn)芽期耐低溫QTL主要表現(xiàn)為加性效應(yīng), 非常適于水稻的分子輔助育種。而且主效QTL-不僅自身具有很大的遺傳效應(yīng), 而且在與其他QTL聚合時, 常常表現(xiàn)出更加突出的改良效果, 極具育種應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

構(gòu)建了麗江新團黑谷和沈農(nóng)265重組自交系群體包含2818個bin標(biāo)記的遺傳圖譜。利用此群體和bin標(biāo)記圖譜, 共檢測到5個芽期耐冷QTL, 分布在水稻的1號、3號、9號和11號染色體上, 表型貢獻率分別為8.0%、8.2%、16.6%、24.4%和53.5%, 增效等位基因均來自耐冷親本麗江新團黑谷。主效QTL-位于11號染色體長臂端的17.97 Mb~23.03 Mb之間。利用“選擇作圖”策略進行了QTL驗證和累加效應(yīng)分析, 明確了可以通過QTL的累加聚合實現(xiàn)芽期耐冷能力的遺傳改良, 聚合的增效QTL越多, 耐冷能力等級越高。

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Detection of QTLs controlling cold tolerance at bud bursting stage by using a high-density SNP linkage map inrice

JIANG Shu-Kun1,*, WANG Li-Zhi1, YANG Xian-Li1, LI Bo2, MU Wei-Jie3, DONG Shi-Chen3, CHE Wei-Cai3, LI Zhong-Jie1, CHI Li-Yong1, LI Ming-Xian1, ZHANG Xi-Juan1, JIANG Hui2, LI Rui1, ZHAO Qian1, and LI Wen-Hua2,*

1Institute of Crop Cultivation and Tillage, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences / Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Crop Physiology and Ecology in Cold Region / Heilongjiang Provincial Engineering Technology Research Center of Crop Cold Damage, Harbin 150086, Heilongjiang, China;2Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China;3Life Science and Technology College, Harbin Normal University, Harbin 150025, Heilongjiang, China

Direct seeded rice (DSR) has received much attention because of its time- and labour-saving and low-input demand. However, the long-term cultivation method of seedling-transplantation has led to loss of some low-temperature-tolerant genes expressed at the bud stage. It has made many currently popular rice varieties unsuitable for direct seeding production. Therefore, it is important to identify cold-tolerance genes at the bud stage and to provide genes for subsequent molecular marker assistant breeding. In this study, we used a recombinant inbred line population constructed by cross of Lijiangxintuanheigu (LTH) and Shennong 265 (SN265) and its linkage map containing 2818 markers to detect cold tolerance QTLs at the bud stage. A total of five QTLs were detected on rice chromosomes 1, 3, 9, and 11. All the cold tolerance alleles were from the cold-tolerant parent LTH. The LOD values of these QTLs ranged from 3.05 to 24.01, and the phenotypic variations ranged from 8.0% to 53.5%. Among them, the major QTLwas located in a 790 kb interval of 21.24 Mb to 22.03 Mb on the long arm of chromosome 11. Subsequently, the “selective mapping” strategy was used for QTL verification and pyramiding effect analysis. Genetic improvement of cold tolerance at the bud stage would be achieved through pyramiding more QTLs. These results not only promote people’s understanding of the genetic basis for cold tolerance at the bud stage in rice but also provide theoretical basis and technical guidance for genetic improvement of DSR varieties.

rice; cold tolerance at bud bursting stage; re-sequencing; genetic map; QTLs

10.3724/SP.J.1006.2020.92066

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0300105-5-2), 國家自然科學(xué)基金項目(31661143012), 國家重點研發(fā)項目黑龍江省級資助(768001), 黑龍江省自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金項目(YQ2019C020)和黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長期性基礎(chǔ)性項目(2018CQJC002, 2019CQJC002)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China(2018YFD0300105-5-2), the National Natural Science Foundation of China(31661143012), the Provincial Funding for the National Key Research and Development Program in Heilongjiang Province (768001), the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province of China (YQ2019C020), and the Heilongjiang Province Agricultural Science and Technology Innovation Project (2018CQJC002, 2019CQJC002).

姜樹坤, E-mail:sk_jiang@126.com, Tel: 023-68251264, 李文華, E-mail: nkylwh@163.com

E-mail: sk_jiang@126.com

2019-12-08;

2020-03-24;

2020-04-10.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200410.1430.006.html