BnaBZR1和BnaPIF4基因調(diào)控甘藍(lán)型油菜弱光光效的機(jī)制

馮 韜 譚 暉 官 梅 官春云,*

和基因調(diào)控甘藍(lán)型油菜弱光光效的機(jī)制

馮 韜1,2譚 暉1,2官 梅2官春云2,*

1遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 貴州遵義 563000;2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 國(guó)家油料改良中心湖南分中心, 湖南長(zhǎng)沙 410128

甘藍(lán)型油菜品系XY881和XY883是湘油15輻照誘變后連續(xù)自交篩選的2個(gè)種子含油量、光合效率和弱光敏感性等有明顯差別的子代品系。分別從XY881和XY883中克隆了蕓薹素唑抗性因子1 (brassinazole-resistant 1,) 和光敏色素互作因子4 (phytochrome interacting factor 4,)基因并進(jìn)行了序列結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能分析。結(jié)果表明, XY883的和基因存在結(jié)構(gòu)變異, 引起表達(dá)和調(diào)控模式的差異。XY883中的啟動(dòng)子具有124 bp的富含A / T的插入序列, 且XY883具有比XY881高的表達(dá), 并且在弱光和2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-BL)誘導(dǎo)下具有較少的表達(dá)變化。XY883中的5'-UTR區(qū)域存在可變剪接, 形成長(zhǎng)度分別為424 bp (U01)、239 bp (U02)和332 bp (U03)的3種5'-UTR, 在弱光和2,4-BL誘導(dǎo)下, XY883中3種可變剪接的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變化不一致。將的3個(gè)5'-UTR與CDS分別組合轉(zhuǎn)化擬南芥后其表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯差異, 但蛋白翻譯存在明顯差異, 表明的5'-UTR變異影響其翻譯過(guò)程。轉(zhuǎn)基因擬南芥出現(xiàn)株高增加、葉片狹長(zhǎng)且光合作用下降的表型, 共轉(zhuǎn)化能減弱造成的光合作用下降; 轉(zhuǎn)和基因?qū)τ筒说挠绊懪c擬南芥相似, 但表型不如擬南芥明顯, 表明BnaPIF4是油菜光合作用的負(fù)調(diào)控因子, 而B(niǎo)naBZR1可對(duì)BnaPIF4的光合負(fù)調(diào)控產(chǎn)生拮抗; 這與XY881和XY883中兩基因表達(dá)調(diào)控模式及其光合表型相吻合。

甘藍(lán)型油菜;;; 可變剪接; 插入突變

植物中轉(zhuǎn)錄因子PIF4和BZR1互作是植物油菜素內(nèi)酯信號(hào)與光信號(hào)互作的核心節(jié)點(diǎn)[1], 同時(shí)二者互作也是介導(dǎo)植物對(duì)弱光照等非生物脅迫響應(yīng)的節(jié)點(diǎn)[2]。油菜素內(nèi)酯通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)BZR1和BZR2 (BES1)的表達(dá)和磷酸化[3], 并通過(guò)磷酸化等方式串聯(lián)與之互作的其他因子調(diào)控下游基因表達(dá), 調(diào)控植物生長(zhǎng), 最后形成完整的反饋回路平衡植物內(nèi)源油菜素內(nèi)酯的合成[4]。擬南芥和水稻中BZR1/2以單體或復(fù)合體形式與PIF4互作, 介導(dǎo)下游的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5]。植物中PIF4蛋白在光照條件下穩(wěn)定性較弱, 極易發(fā)生泛素化降解, 因此植物PIF4在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控也是相關(guān)信號(hào)互作中重要的調(diào)節(jié)方式。

甘藍(lán)型油菜是世界范圍內(nèi)最重要的油料作物之一[6], 但其具有極為復(fù)雜的異源二倍體基因組[7], 不同甘藍(lán)型油菜對(duì)低光等非生物脅迫的抗性有極大的多態(tài)性[8], 但油菜相關(guān)和的表達(dá)調(diào)控與功能均不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn), 從甘藍(lán)型油菜湘油15中克隆基因發(fā)現(xiàn)其A03染色體上的同源拷貝相較測(cè)序品種中雙11號(hào)存在著內(nèi)含子突變[9], 這表明在甘藍(lán)型油菜中基因可能存在著更多的突變。甘藍(lán)型油菜品系XY881和XY883由相同親本湘油15經(jīng)輻照誘變后連續(xù)自交篩選而得, 其中XY881基本保持了湘油15的原有特征, XY883則表現(xiàn)為更高的光合效率, 更高的種子含油量和油酸含量, 但同時(shí)種子含油量的穩(wěn)定性較低、對(duì)低光寡照脅迫更為敏感。在XY881和XY883中進(jìn)行和基因克隆、序列特征、表達(dá)和功能分析, 對(duì)探明油菜中和的表達(dá)調(diào)控規(guī)律及其在低光照脅迫中扮演的角色具有重要意義, 同時(shí)也將為闡明甘藍(lán)型油菜對(duì)低光照脅迫響應(yīng)存在差異的分子機(jī)制提供一些新的理論支持。

本文克隆了兩品系甘藍(lán)型油菜中和基因并進(jìn)行了完整的比較分析, 確定了甘藍(lán)型油菜品系XY883中和基因存在的可變剪接和啟動(dòng)子插入突變, 并通過(guò)酵母雜交、表達(dá)分析和植物遺傳轉(zhuǎn)化等方式確認(rèn)了XY883]中和基因突變對(duì)基因表達(dá)和蛋白翻譯的影響, 并初步確定了和在擬南芥和油菜中的功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

甘藍(lán)型油菜品種(系)湘油15、XY881、XY883以及野生型擬南芥由國(guó)家油料改良中心(湖南)提供。分別于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園試驗(yàn)基地和室內(nèi)植物光照培養(yǎng)箱中(KBW240, BINDER, 美國(guó)) (16 h/8 h光周期)種植受試材料, 以常規(guī)水肥管理。在植物培養(yǎng)箱中設(shè)置光源100 μmol m–2s–1模擬強(qiáng)光照, 20 μmol m–2s–1模擬弱光照, 試驗(yàn)基地中以遮光網(wǎng)遮光模擬弱光脅迫。

1.2 取樣和測(cè)試

分別于甘藍(lán)型油菜品系XY881和XY883種子萌發(fā)后45、120、200和220 d對(duì)根、莖、葉、花、角果及完成遺傳轉(zhuǎn)化后的甘藍(lán)型油菜和T2代擬南芥葉片隨機(jī)取樣, 以液氮速凍后儲(chǔ)存于-80℃冰箱, 用于RNA和蛋白提取。對(duì)經(jīng)不同處理的甘藍(lán)型油菜品系XY881和XY883完全成熟的種子隨機(jī)取樣, 以索氏抽提測(cè)試含油量, 以氣相色譜法[10]測(cè)試脂肪酸組成。

1.3 DNA提取、RNA提取與cDNA合成

使用CTAB-PVP提取液從甘藍(lán)型油菜葉片中提取基因組DNA。使用TRIzol RNA Extraction Kit (TransGen Biotech Co., Ltd.)從甘藍(lán)型油菜和擬南芥樣品中提取總RNA。使用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit (TransGen Biotech Co., Ltd.)進(jìn)行第1鏈cDNA合成。

1.4 基因克隆

從BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org/brad/)獲取甘藍(lán)型油菜和基因及轉(zhuǎn)錄本序列并進(jìn)行序列染色體步移分析。截取和起始密碼子上游1 kb序列為啟動(dòng)子克隆區(qū)域, 根據(jù)序列特征設(shè)計(jì)用于和啟動(dòng)子及全長(zhǎng)mRNA克隆的引物(表1), 以PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa, 日本)進(jìn)行PCR。

表1 基因克隆引物

1.5 RT-qPCR與WB

以RT-qPCR檢測(cè)和基因表達(dá), 以WB檢測(cè)BnaPIF4、BnaBZR1及1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase, RuBPCase)等蛋白表達(dá)。以為內(nèi)參基因, 采用2–ΔΔCt法以RT-qPCR檢測(cè)和各拷貝表達(dá), 根據(jù)序列特征設(shè)計(jì)所需引物(表2), 各試驗(yàn)均3次技術(shù)重復(fù)。

分別以HA-tag (ab18181, Abcam, Inc., 美國(guó))(1∶1000)和RbcL抗體(AS03037, Agrisera, Ins., 瑞典) (1∶2000)為一抗進(jìn)行WB, 檢測(cè)連接HA標(biāo)簽的BnaPIF4蛋白和RuBPCase蛋白, 以ECL發(fā)光法進(jìn)行印跡, 隨后以GS800掃描儀(Bio-Rad Company, 美國(guó))掃描蛋白光密度。

1.6 載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

用于擬南芥和甘藍(lán)型油菜和遺傳轉(zhuǎn)化的載體來(lái)源于國(guó)家油料改良中心(湖南)。分別以3種基因的5￠-UTR替換載體中的的5'-UTR序列, 隨后將攜帶HA標(biāo)簽的CDS序列插入載體。以農(nóng)桿菌侵染介導(dǎo)進(jìn)行擬南芥和甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化。

表2 RT-qPCR引物

1.7 酵母雜交實(shí)驗(yàn)

分別以作為酵母單雜交和雙雜交的AD質(zhì)粒, 以為酵母雙雜交的BD質(zhì)粒, 以為酵母單雜交的BD質(zhì)粒, 共轉(zhuǎn)化酵母菌株用于鑒定BnaPIF4和BnaBZR1之間的互作關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 弱光和2,4-BL處理下XY881與XY883重要農(nóng)藝性狀

對(duì)大田栽培的XY881和XY883分別進(jìn)行遮光和2,4-BL處理, 并統(tǒng)計(jì)其有效光合葉RuBPCase活性、全株總角果數(shù)、每角果種子粒數(shù)、成熟種子含油量、油酸含量及種子千粒重(圖1)。

遮光處理下XY881和XY883表現(xiàn)出明顯的敏感性差異, XY883葉片中RuBPCase含量下降較XY881更明顯, 與之對(duì)應(yīng)的XY883每角果中種子粒數(shù)和種子含油量也由明顯下降, 而XY881每角果粒數(shù)和種子含油量均無(wú)明顯下降。2,4-BL處理對(duì)XY881與XY883的影響規(guī)律相似, 油菜葉片中RuBPCase含量明顯上升, 光合作用加強(qiáng), 與之對(duì)應(yīng)的全株總角果數(shù)和每角果種子粒數(shù)明顯增多, 但整體而言XY883受影響更明顯。無(wú)論弱光照脅迫或2,4-BL處理均未對(duì)XY881和XY883種子千粒重及種子油脂中油酸比例。由此推測(cè)弱光和2,4-BL處理下主要通過(guò)影響光合作用水平, 調(diào)控XY881和XY883種子油脂合成的底物, 該過(guò)程中XY881和XY883存在油菜素內(nèi)酯信號(hào)響應(yīng)因子表達(dá)水平差異。

2.2 兩品系甘藍(lán)型油菜(XY881和XY883)中BnaBZR1和BnaPIF4基因克隆和結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步理解和在XY881和XY883對(duì)弱光和2,4-BL響應(yīng)差異中的作用, 本文從XY881和XY883中分別克隆和的全長(zhǎng)mRNA和全長(zhǎng)基因, 并從中亞克隆啟動(dòng)子、CDS和5￠-UTR等元件, 并對(duì)兩品系中和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖2)。

圖1 弱光和2,4-BL處理下XY881和XY883重要農(nóng)藝性狀

A: 種子含油量; B: 種子油酸含量; C: 單株總角果數(shù); D: 每角果種子粒數(shù); E: 成熟種子千粒重; F: 葉片RuBPCase含量。*< 0.05, **< 0.01。

A: oil content of seed; B: oleic acid content of seed; C: total number of silique per plant; D: number of seeds per silique; E:1000-seed weight of mature seeds; F: RuBPCase content in leaves. *< 0.05, **< 0.01.

圖2 XY881和XY883中BnaPIF4和BnaBZR1基因結(jié)構(gòu)

A:和全長(zhǎng)mRNA; B:和全長(zhǎng)CDS; C:和啟動(dòng)子; D:三種5'-UTR; E:全長(zhǎng)基因; F: XY881和XY883中和突變結(jié)構(gòu)示意。1: XY881中; 2: XY883中; 3: XY881中; 4: XY883中; 01~03: XY883中三種5'-UTRs; M1: 2K plus DNA marker; M2: 2K DNA marker。

A: cloning of mRNA ofand; B: cloning of CDS ofand; C: cloning of promoter ofand; D: cloning of 5'-UTR of; E: cloning of full-lengthgene; F: the mutation structure ofandin XY881 and XY883. 1:of XY881; 2:of XY883; 3:of XY881; 4:of XY883; 01–03: three 5'-UTRs offrom XY883; M1: 2K plus DNA marker; M2: 2K DNA marker.

基因結(jié)構(gòu)分析顯示, XY881中和基因與親本湘油15一致, 而XY883中和基因分別存在可變剪接和啟動(dòng)子插入突變。XY883中可變剪接共形成3種含有不同5￠-UTR的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, 分別為U01 (424 bp)、U02 (239 bp)和U03 (332 bp) (圖2-D); 該可變剪接均發(fā)生于親本基因的第一外顯子內(nèi), 3個(gè)5￠-UTR拷貝具有相同的剪接邊界序列(AGGT和AGAC), 第一剪接點(diǎn)分別位于+97 bp、+191 bp和+415 bp位置。XY883中基因在啟動(dòng)子-470 bp位置內(nèi)存在一個(gè)124 bp長(zhǎng)度的富A/T堿基插入突變。

2.3 BnaBZR1啟動(dòng)子插入突變功能

為進(jìn)一步確認(rèn)XY883中基因啟動(dòng)子區(qū)域的插入突變有何功能, 分別以PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)鑒定插入序列中的啟動(dòng)子元件(圖3-A); 將和的CDS克隆到載體(AD-PIF4和AD-BZR1), 將的CDS克隆到載體(pGBK-PIF4), 將和啟動(dòng)子克隆到載體(pHIS2-pPIF4、 pHIS2-pBZR1.1和pHIS2-pBZR1.2) , 分別進(jìn)行酵母雜交, 驗(yàn)證BnaPIF4與BnaBZR1之間的互作關(guān)系是否受啟動(dòng)子突變影響(圖3-B); 以RT-qPCR檢測(cè)XY883和XY881中基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律的異同點(diǎn)(圖3-C, D)。

圖3 BnaBZR1啟動(dòng)子插入突變、基因表達(dá)和BnaBZR1與BnaPIF4互作

A:啟動(dòng)子插入突變序列分析; B:和酵母雜交分析; C: XY881和XY883中時(shí)空表達(dá); D: 弱光和2,4-BL處理下XY881和XY883中表達(dá)。DAG表示種子萌發(fā)后天數(shù)。

A: sequence analysis of insertion mutation regions in the promoter of; B: analysis of the interaction betweenandby yeast hybridization; C: the temporal and spatial gene expression ofin XY881 and XY883; D: the expression ofin XY881 and XY883 under poor light stress and 2,4-BL treatment. DAG means days after seed germination.

分析發(fā)現(xiàn),基因啟動(dòng)子區(qū)124 bp的插入突變中含有大量的啟動(dòng)子元件, 包含多個(gè)TATA盒、2個(gè)CAAT盒、1個(gè)MRE 結(jié)構(gòu)域及2個(gè)Skn-1結(jié)構(gòu)域。酵母雜交結(jié)果表明, BnaBZR1與BnaPIF4蛋白可相互結(jié)合, BnaBZR1能結(jié)合啟動(dòng)子, 而B(niǎo)naPIF4不能結(jié)合啟動(dòng)子,基因啟動(dòng)子插入突變不影響B(tài)naPIF4與啟動(dòng)子的結(jié)合關(guān)系。XY883中啟動(dòng)子插入突變會(huì)明顯提高其表達(dá)量, 苗期和苔期XY883中表達(dá)明顯高于XY881, 葉片和莖等光合作用部位XY883中表達(dá)明顯高于XY881。XY883中表達(dá)穩(wěn)定, 不受低光和2,4-BL的明顯誘導(dǎo), 而XY881中表達(dá)受到低光和2,4-BL明顯誘導(dǎo), 刺激后XY881中表達(dá)明顯提高, 這表明啟動(dòng)子插入突變可能提高本底表達(dá)水平, 同時(shí)造成表達(dá)對(duì)環(huán)境的響應(yīng)減弱, 插入突變序列影響表達(dá)具體通過(guò)何種方式尚需進(jìn)一步研究, 由插入突變中大量啟動(dòng)子元件來(lái)看, 該插入突變可能引入了上游轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn), 加強(qiáng)了啟動(dòng), 但同時(shí)由于啟動(dòng)子元件的增加造成光響應(yīng)和油菜素內(nèi)酯響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)抑制, 降低了表達(dá)對(duì)低光和2,4-BL的響應(yīng)。

2.4 可變剪接影響B(tài)naPIF4基因表達(dá)和翻譯

通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)XY881和XY883中基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律以及在弱光脅迫和2,4-BL處理下不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)的響應(yīng)(圖4-A, B)。將BnaPIF4可變剪接形成的不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別克隆到載體上, 重組載體結(jié)構(gòu)如圖4-C, 隨后將重組載體轉(zhuǎn)化擬南芥, 觀察表型并檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)情況及光合酶RuBPCase含量(圖4-D~F)。

圖4 BnaPIF4可變剪接對(duì)基因表達(dá)和翻譯的影響

A: XY881和XY883中時(shí)空表達(dá); B: 弱光和2,4-BL處理下XY881和XY883中表達(dá); C: 含不同5'-UTRs重組載體結(jié)構(gòu); D: 轉(zhuǎn)基因擬南芥中mRNA和蛋白表達(dá); E: 轉(zhuǎn)擬南芥表型; F: 轉(zhuǎn)擬南芥RuBPCase含量。DAG表示種子萌發(fā)后天數(shù)。

A: temporal and spatial gene expression ofin XY881 and XY883; B: the expression ofin XY881 and XY883 under poor light stress and 2,4-BL treatment; C: construction ofvector with different 5'-UTRs; D: the mRNA expression ofand the protein expression of BnaPIF4; E: the phenotype of transgenic; F: the RuBPCase protein content of transgenic. DAG means days after seed germination.

時(shí)空表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)XY881和XY883中總表達(dá)量模式無(wú)明顯差異,表達(dá)均為隨生育進(jìn)程表達(dá)量逐漸降低, 有明顯的組織特異性, 主要表達(dá)于地上部分, 葉中表達(dá)量最高。低光照和2,4-BL處理誘導(dǎo)表達(dá), 且XY883中表達(dá)量增幅遠(yuǎn)大于XY881, 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)弱光和2,4-BL的響應(yīng)具有明顯差別, 其中轉(zhuǎn)錄本U01 (具有U01結(jié)構(gòu)5￠- UTR, 即親本無(wú)突變轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)響應(yīng)最明顯, U03轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物次之(具有U03結(jié)構(gòu)5￠-UTR), U02轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(具有U02結(jié)構(gòu)5￠-UTR)無(wú)明顯響應(yīng)。擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)不同的5￠-UTR在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下不影響的CDS轉(zhuǎn)錄, 但不同的5￠-UTR對(duì)BnaPIF4蛋白合成具有顯著影響, 其中U01與對(duì)照AtADH5具有相近的高水平BnaPIF4蛋白合成, U02和U03具有明顯偏低的BnaPIF4蛋白合成量。轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出葉片狹長(zhǎng)、莖伸長(zhǎng)、早花及結(jié)實(shí)減少等表型, 轉(zhuǎn)不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, 效應(yīng)具有差異, U01轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物影響最大, U03次之, U02影響最小, 葉片光合關(guān)鍵酶RuBPCase含量的下降也表現(xiàn)U01最明顯, U03次之, U02相對(duì)野生型無(wú)明顯下降。BnaPIF4本身是bHLH家族重要的轉(zhuǎn)錄因子, 其下游存在大量的響應(yīng)基因,不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的蛋白合成能力具有差異, 由此推測(cè), 環(huán)境因素可能影響XY883中的剪接過(guò)程, 調(diào)控不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的比例, 一方面在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)上游因子的調(diào)控, 一方面在蛋白水平傳導(dǎo)和改變對(duì)下游響應(yīng)基因的調(diào)控水平, 通過(guò)自身在轉(zhuǎn)錄和翻譯上平衡的調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)控XY883對(duì)環(huán)境的綜合響應(yīng), 這可能是XY883相對(duì)親本湘油15在正常光照條件下具有更高的光合效能且對(duì)弱光等環(huán)境因素更敏感的原因之一。

2.5 甘藍(lán)型油菜和擬南芥中BnaPIF4和BnaBZR1功能

為進(jìn)一步驗(yàn)證和的功能, 分別對(duì)擬南芥和甘藍(lán)型油菜親本湘油15進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化, 觀察過(guò)表達(dá)和后的表型(圖5)。

轉(zhuǎn)基因擬南芥相較野生型表現(xiàn)出葉片狹長(zhǎng)、莖伸長(zhǎng)、早花且結(jié)實(shí)率降低, 葉片中RuBPCase含量明顯下降的表型, 成熟種子的含油量也明顯下降,不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的效應(yīng)存在差異, 轉(zhuǎn)U01和U03擬南芥種子含油量下降明顯, 轉(zhuǎn)U02擬南芥種子含油量則無(wú)明顯下降, 這與3種轉(zhuǎn)錄物對(duì)擬南芥葉片RuBPCase含量的影響一致。轉(zhuǎn)基因擬南芥相較野生型具有明顯更大的生物量, 生育期適度縮短, 總結(jié)實(shí)量上升, 但葉片RuBPCase含量和種子含油量無(wú)明顯變化。共轉(zhuǎn)化和基因擬南芥仍保持轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片狹長(zhǎng)和早花的特征, 但植株生物量明顯提升, 葉片RuBPCase含量和種子含油量相對(duì)野生型無(wú)明顯變化。綜合來(lái)看, 在擬南芥中表現(xiàn)為光合作用的負(fù)調(diào)控因子;表現(xiàn)生長(zhǎng)促進(jìn)作用, 提升擬南芥生物量;對(duì)的光合作用負(fù)效應(yīng)具有拮抗作用。在親本湘油15中過(guò)表達(dá)會(huì)讓其主莖相對(duì)更細(xì)長(zhǎng), 葉片也更狹長(zhǎng), 開(kāi)花略有提前; 在湘油15中過(guò)表達(dá)會(huì)提高其生物量, 提早花期, 增加開(kāi)花量, 但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異; 湘油15過(guò)表達(dá)和后葉片RuPBCase含量亦無(wú)明顯變化。整體而言,和過(guò)表達(dá)對(duì)甘藍(lán)型油菜的影響和擬南芥基本一致, 但對(duì)甘藍(lán)型油菜的影響遠(yuǎn)小于擬南芥, 這可能與甘藍(lán)型油菜復(fù)雜的雙二倍體基因組中存在大量同源拷貝有關(guān), 單一基因過(guò)表達(dá)影響遠(yuǎn)不如擬南芥明顯。

3 討論

甘藍(lán)型油菜品系XY883和XY881均來(lái)源于親本湘油15, XY881基本保持了親本特性, XY883的RuBPCase含量、種子含油量、種子油酸含量和結(jié)實(shí)量相較親本均明顯提升, 弱光脅迫對(duì)XY881和湘油15影響較小, 而對(duì)XY883影響十分明顯, 這表明XY883和XY881的表型差異可能源于光響應(yīng)元件的差異。2,4-BL對(duì)XY881和XY883的調(diào)控規(guī)律基本一致, 均提升RuBPCase含量, 促進(jìn)光合, 但影響幅度差異明顯, 2,4-BL對(duì)和基因具有一致的誘導(dǎo)作用, 誘導(dǎo)效應(yīng)存在品系差異[11], 這表明和的表達(dá)調(diào)控介導(dǎo)油菜素甾類信號(hào)和光信號(hào)通路的互作可能是XY881和XY883光合作用和弱光敏感性等差異的原因。

植物中BZR1是油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子, 其通過(guò)核質(zhì)穿梭調(diào)控下游靶基因表達(dá), 并通過(guò)反饋回路影響植物油菜素甾醇合成來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)[12], 可見(jiàn)油菜中自身的表達(dá)調(diào)控同樣可以影響油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑。XY883中啟動(dòng)子中的插入突變引入了多個(gè)具有轉(zhuǎn)錄因子特征的元件, 本底表達(dá)水平明顯高于XY881, 但弱光脅迫和2,4-BL處理對(duì)XY883中的誘導(dǎo)效應(yīng)較弱, 造成在脅迫和2,4-BL處理下兩品系油菜中表達(dá)水平接近, 這可能是由于啟動(dòng)子插入突變之后增強(qiáng)了啟動(dòng), 同時(shí)對(duì)上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合, 抑制了弱光和2,4-BL的響應(yīng)元件工作, 但具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探索, 另一方面, XY883中對(duì)弱光和2,4-BL鈍感, 導(dǎo)致內(nèi)源油菜素內(nèi)酯合成的反饋調(diào)節(jié)失效, 造成XY883對(duì)弱光照等不利環(huán)境因素的調(diào)節(jié)能力下降。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)基因油菜表型

A: 轉(zhuǎn)基因擬南芥; B: 轉(zhuǎn)基因擬南芥RuBPCase含量; C: 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子含油量; D: 轉(zhuǎn)基因油菜; E: 轉(zhuǎn)基因油菜中和表達(dá); F: 轉(zhuǎn)基因油菜RuBPCase含量。

A: the phenotype of transgenicand; B: the RuBPCase protein content of transgenicand; C: the oil content of transgenicseed; D: the plant of transgenicL.; E: the gene expression ofandin transgenicL.; F: the RuBPCase content of leaves of transgenicL.

PIF4是植物光信號(hào)通路中的核心轉(zhuǎn)錄因子之一,它通過(guò)響應(yīng)光質(zhì)變化[13]和熱脅迫[14]等調(diào)節(jié)植物植物開(kāi)花和生長(zhǎng)等生物學(xué)過(guò)程。PIF4是介導(dǎo)光信號(hào)與植物激素途徑相互作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子, 如與赤霉素信號(hào)[15]、油菜素內(nèi)酯信號(hào)[16]和生長(zhǎng)素信號(hào)[17]等產(chǎn)生互作。在XY883中選擇性剪接形成3種具有不同5'-UTR的轉(zhuǎn)錄物, 弱光和2,4-BL對(duì)這3種轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)效應(yīng)具有明顯差別, 在轉(zhuǎn)基因擬南芥中這3種轉(zhuǎn)錄物也表現(xiàn)明顯不一致的翻譯效率, 并導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥產(chǎn)生不同的RuBPCase含量, 這表明XY883中的剪接調(diào)控可能是其與XY881存在明顯光合水平和弱光敏感性差異的原因。XY883中通過(guò)可變剪接形成不同轉(zhuǎn)錄物, 造成轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的變化量存在明顯差異, 在正常光照下XY883中低翻譯水平的U02和U03轉(zhuǎn)錄物相對(duì)比例較高, 弱光下高翻譯水平的U01轉(zhuǎn)錄物比例明顯上升, 而B(niǎo)naPIF4在擬南芥和油菜中都表現(xiàn)出光效負(fù)調(diào)控因子的特征, 這可能是XY883在常光下表現(xiàn)明顯高于親本光合效能, 而弱光下光合效能明顯降低的原因。

酵母雜交實(shí)驗(yàn)表明, BnaBZR1蛋白與BnaPIF4相互作用, BnaBZR1與的啟動(dòng)子相互作用, 但BnaPIF4不與的啟動(dòng)子相互作用, 這表明BnaBZR1可能調(diào)節(jié)的表達(dá), 而B(niǎo)naPIF4可能不直接調(diào)控的表達(dá)。PIF4和BZR的互作是植物油菜素內(nèi)酯信號(hào)和光信號(hào)互作的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn), BnaBZR1與BnaPIF4的互作模式可能意味著油菜中油菜素內(nèi)酯信號(hào)與光信號(hào)的互作存在方向性偏好。前期研究顯示在甘藍(lán)型油菜中和均存在大量同源拷貝[9,18], 因此在功能上可能存在大量的冗余, 二者在甘藍(lán)型油菜光效調(diào)節(jié)中可能存在更復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò), 需要進(jìn)一步對(duì)二者同源拷貝及上下游調(diào)控因子進(jìn)行發(fā)掘和探索。

總體來(lái)看, 甘藍(lán)型油菜中涉及油菜素內(nèi)酯和光信號(hào)互作因子存在著基因多態(tài)性, 由此介導(dǎo)的油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑和光信號(hào)途徑互作等方面差異可能是不同品系甘藍(lán)型油菜光合效能差異的原因, 兩信號(hào)途徑之間互作的平衡可能是篩選穩(wěn)定的高產(chǎn)油油菜品種的重要指標(biāo)。

4 結(jié)論

甘藍(lán)型油菜品系XY883相對(duì)親本湘油15, 分別存在的可變剪接和啟動(dòng)子的插入突變, 導(dǎo)致兩基因在不同條件下的表達(dá)出現(xiàn)不同于親本的變化規(guī)律。在擬南芥和油菜中表現(xiàn)光合負(fù)效應(yīng)因子的特點(diǎn), 而可對(duì)此負(fù)效應(yīng)形成拮抗, 擬南芥受和遺傳轉(zhuǎn)化影響較甘藍(lán)型油菜更大。

[1] Oh E, Zhu J Y, Wang Z Y. Interaction between BZR1 and PIF4 integrates brassinosteroid and environmental responses., 2012, 14: 802–809.

[2] Bai M Y, Shang J X, Oh E, Fan M, Bai Y, Zentella R, Sun T P, Wang Z Y. Brassinosteroid, gibberellin and phytochrome impinge on a common transcription module in., 2012, 14: 810–817.

[3] Gudesblat G E, Russinova E. Plants grow on brassinosteroids., 2011, 14: 530–537.

[4] Ryu H, Hwang I. Brassinosteroids in plant developmental signaling networks., 2013, 56: 267–273.

[5] Wang W, Bai M Y, Wang Z Y. The brassinosteroid signaling network—a paradigm of signal integration., 2014, 21: 147–153.

[6] USDA FAS (Foreign Agricultural Service), 2016. Oilseeds: World Markets and Trade. https://www.fas.usda.gov/data/oilseeds-world-markets-and-trade.

[7] Chalhoub B, Denoeud F, Liu S, Parkin I A, Tang H, Wang X, Corréa M. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithicoilseed genome., 2014, 345: 950–953.

[8] M?lmann J A, Hagen S F, Bengtsson G B, Johansen T J. Influence of high latitude light conditions on sensory quality and contents of health and sensory-related compounds in swede roots (L. ssp.Metzg.), 2018, 98: 1117–1123.

[9] 馮韜, 官春云. 甘藍(lán)型油菜光敏色素互作因子4 (BnaPIF4)基因克隆和功能分析. 作物學(xué)報(bào), 2019, 45: 204–213. Feng T, Guan C Y. Cloning and characterization of phytochrome interacting factor 4 (BnaPIF4) gene fromL., 2019, 45: 204–213 (in Chinese with English abstract).

[10] Wei F, Gao G Z, Wang X F, Dong X Y, Li P P, Hua W, Wang X, Wu X M, Chen H. Quantitative determination of oil content in small quantity of oilseed rape by ultrasound-assisted extraction combined with gas chromatography., 2008, 15: 938–942.

[11] 馮韜, 譚暉, 徐江林, 官春云. 油菜素內(nèi)酯在不同生育期對(duì)兩品系甘藍(lán)型油菜的生長(zhǎng)調(diào)控. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2019, 41: 904–913. Feng T, Tan H, Xu J L, Guan C Y. Epibrassinolide regulation on oilseed rape (L.) in different period., 2019, 41: 904–913 (in Chinese with English abstract).

[12] Wang Z Y, Nakano T, Gendron J, He J X, Chen M, Vafeados D, Yang Y L, Fujioka S, Yoshida S, Asami T, Chory J. Nuclear- localized BZR1 m llklediates brassinosteroid-induced growth and feedback suppression of brassinosteroid biosynthesis., 2002, 2: 505–513.

[13] Casson S A, Franklin K A, Gray J E, Grierson C S, Whitelam G C, Hetherington A M. Phytochrome B and PIF4 regulate stomatal development in response to light quantity., 2009, 19: 229–234.

[14] Kumar S V, Lucyshyn D, Jaeger K E, Alós E, Alvey E, Harberd N P, Wigge P A. Transcription factor PIF4 controls the thermosensory activation of flowering., 2012, 484: 242–245.

[15] Lucas M D, Davière J M, Mariana R F, Pontin M, Manuel J I P, Lorrain S, Fankhauser C, Blázquez M A, Titarenko E, Prat S. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation., 2008, 451: 480–484.

[16] Stella B G, Miguel D L, Cristina M, Ana E R, Davière J M, Prat S. BR-dependent phosphorylation modulates PIF4 transcriptional activity and shapes diurnal hypocotyl growth., 2014, 28: 1681–1694.

[17] Franklin K A, Lee S H, Patel D, Kumar S V, Spartz A K, Gu C, Ye S Q, Yu P, Breen G, Cohen J D, Wigge P A, Gray W M. PHYTOCHROME-NTERACTING FACTOR 4 (PIF4) regulates auxin biosynthesis at high temperature., 2011, 108: 20231–20235.

[18] 馮韜, 官春云. 甘藍(lán)型油菜蕓薹素唑耐受因子(BnaBZR1/ BnaBES1)全長(zhǎng)CDS克隆與生物信息學(xué)分析. 作物學(xué)報(bào), 2018, 44: 1793–1801. Feng T, Guan C Y. Cloning and characterization of brassinazole-resistant (BnaBZR1 and BnaBES1) CDS fromL., 2018, 44: 1793–1801 (in Chinese with English abstract).

Mechanism ofandregulating photosynthetic efficiency in oilseed rape (L.) under poor light

FENG Tao1,2, TAN Hui1,2, GUAN Mei2, and GUAN Chun-Yun2,*

1College of Biology and Agriculture, Zunyi Normal College, Zunyi 563000, Guizhou, China;2College of Agronomy, Hunan Agricultural University / National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan, Changsha 410128, Hunan, China

Double-low seed rapeL. varieties XY881 and XY883 screened from the same parent Xiangyou 15 have significant differences in seed oil content, photosynthetic efficiency, and poor light sensitivity. Brassinazole-resistant 1 () and phytochrome interacting factor 4 ()genes were cloned from XY881 and XY883, respectively, and their sequence structure, gene expression and gene function were analyzed. There were structural mutations in theandof XY883, causing differences in gene expression and regulation. The promoter ofin XY883 had a 124 bp A/T-rich insertion mutation, and XY883 had a higher expression ofthan XY881, and fewer expression changes under low light and 2,4-epibrassinolide(2,4-BL) treatment. Splicing differences ofin the 5'-UTR region were found in XY883, and the alternative splicing resulted in three 5'-UTRs of 424 bp (U01), 239 bp (U02), and 332 bp (U03). Under the induction of low light and 2,4-BL treatments the changed of three alternative splicedtranscripts in XY883 had significant differences. The three 5'-UTRs combined with the CDS ofwere transformed into. There was no significant difference ingene expression, but a significant difference in protein expression, indicating that the 5'-UTR mutation ofaffects protein synthesis.Transgenicshowed a phenotype with increased plant height, narrow leaves, and decreased photosynthesis. Co-transformation whitcould attenuate the decrease in photosynthesis caused by. The effects ofandgenes onL. were similar to those on, while the phenotype was not as obvious as that of, suggesting thatis a negative regulator of photosynthesis in rapeseed, andcan antagonize the negative regulation of photosynthesis by, while is consistent with the regulation pattern and photosynthetic phenotype of the two genes in XY881 and XY883.

L.;;; alternative splicing; insertion mutation

10.3724/SP.J.1006.2020.94198

本研究由國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2015CB150206)資助。

This study was supported by the National Basic Research Program of China (973 Program) (2015CB150206).

官春云, E-mail: guancy2011@aliyun.com

E-mail: 812298771@qq.com

2019-12-16;

2020-03-24;

2020-04-03.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200403.0932.002.html