不同預(yù)處理方式對紅棗環(huán)磷酸腺苷提取率的影響

賈文婷 楊慧 吳洪斌

摘要：環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是機(jī)體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)，能調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的多種功能活動，開發(fā)利用前景廣闊。以新疆地區(qū)紅棗為原料，采用超微粉碎法和真空冷凍干燥法對紅棗進(jìn)行預(yù)處理，通過響應(yīng)面法建立了水浴提取環(huán)磷酸腺苷的二次多項數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，通過比較2種不同的預(yù)處理方式，得到的結(jié)果如下：超微粉碎法處理后cAMP提取率為318.31 μg/g，真空冷凍干燥處理后cAMP提取率為239.35 μg/g。

關(guān)鍵詞：新疆紅棗;環(huán)磷酸腺苷;提取;超微粉碎法;真空冷凍干燥法;響應(yīng)面分析

環(huán)磷腺苷（cAMP）是細(xì)胞內(nèi)的重要物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，是生命信息傳遞的“第二信使”[1-2]。它在動物體內(nèi)可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗損傷、抗缺血和缺氧能力，是動物體內(nèi)一種廣泛存在的、具有生理活性的重要物質(zhì)[3-5]。目前，紅棗中cAMP的含量是已知植物中最高的，隨著紅棗深加工及副產(chǎn)物綜合利用產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展以及醫(yī)療和保健行業(yè)對cAMP需求量的增大，使用不同方法從紅棗中提取cAMP的研究越來越多，因此，深入研究如何高效、低耗、環(huán)保地從紅棗中提取cAMP具有重要意義[6]。

本研究以新疆地區(qū)紅棗為原料，采用超微粉碎法、真空冷凍干燥法2種不同方式進(jìn)行預(yù)處理，水浴法提取cAMP，通過單因素及響應(yīng)面試驗，利用 Design-Expert中BBD統(tǒng)計軟件，以紅棗cAMP提取率為響應(yīng)值，獲得2種預(yù)處理方式的最佳工藝，并通過高效液相色譜法測定其提取率，以期為提高cAMP提取率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅棗，購自新疆石河子市農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 超微粉碎機(jī)、真空冷凍干燥機(jī)、烘箱、高效液相色譜儀、電子天平、臺式低速離心機(jī)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2.2 試劑 cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%）、甲醇（色譜純）、磷酸二氫鉀（優(yōu)級醇）、果膠酶、纖維素酶。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，加適量蒸餾水制成15 μg/mL的溶液，搖勻，經(jīng) 0.45 μm 的濾膜過濾即得對照品溶液[7]。

1.3.2 樣品的制備 精密稱取采用不同預(yù)處理方式處理后的棗粉10.00 g，加入440 mL超純水，于90 ℃下水浴提取2次，每次1 h，合并提取液，于離心機(jī)中3 000 r/min離心15 min，取上清液減壓濃縮至100 mL，過0.45 μm微孔濾膜[8]，得樣品溶液。

1.3.3 色譜條件 ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（3.5 μm，4.6 mm×150 mm），柱溫為30 ℃，以 V水 ∶ V乙腈=40 ∶ 60）為流動相，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子檢測，霧化氣（N2）壓力設(shè)為0.28 MPa;干燥氣（N2）的流速設(shè)為10 L/min，干燥氣（N2）的溫度設(shè)為350 ℃。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式監(jiān)測反應(yīng)質(zhì)荷比（m/z）為330.10～136.00。碎裂電壓為140 V;碰撞能量為25 V。

1.3.5 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 取“1.3.1”節(jié)中配制的cAMP對照溶液，加超純水配制成1.00 mg/mL的混合儲備液，于4 ℃保存;使用時用超純水稀釋，配制成cAMP質(zhì)量濃度為0.01、1、10、50、100、500、1 000 ng/mL 的混合對照品溶液[9]。標(biāo)樣圖譜如圖1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超微粉碎法最佳工藝

2.1.1 單因素試驗結(jié)果 影響紅棗超微粉碎的主要參數(shù)有物料水分含量（%）、單次打粉時間（s）、打粉次數(shù)（次）。分別對這幾個參數(shù)進(jìn)行單因素試驗，（1）在單次打粉時間為10 s、打粉次數(shù)為5次的條件下，分別測定物料含水量為6%、8%、10%、12%、14%時的cAMP提取率;（2）在物料含水量為10%、打粉次數(shù)為5次的條件下，分別測定單次打粉時間為8、10、12、14、16 s時的cAMP提取率;（3）在物料含水量為10%、單次打粉時間為10 s的條件下，分別測定打粉次數(shù)為1、3、5、7、9次時的cAMP提取率。從表1可以看出，cAMP提取率隨物料含水量的增加先增大后減小，在物料含水量為10%時達(dá)到最大值;cAMP提取率隨單次打粉時間的增加先增大后減小，在單次打粉時間為10 s時達(dá)到最大值;cAMP提取率隨打粉次數(shù)的增加先增大后減小，在打粉次數(shù)為5次時達(dá)到最大值。因此，選擇物料含水量為8%、10%、12%，單次打粉時間為5、10、15 s，打粉次數(shù)3、5、7次進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)前期單因素試驗的結(jié)果，選取物料水分含量（A）、單次打粉時間（B）、打粉次數(shù)（C）作為自變量，產(chǎn)品的cAMP提取率（Y1）作為因變量，進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗，各因子的水平設(shè)置及編碼值見表2。

利用Design-Expert軟件設(shè)計試驗方案，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

2.1.3 響應(yīng)面結(jié)果分析 應(yīng)用Design-Expert 7.0.0 軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到的模擬回歸方程為：

響應(yīng)面的回歸顯著性方差分析結(jié)果見表4，可以看出，該回歸模型具有極顯著性（P<0.000 1），失擬項（P=0.100 2>0.05）不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.989 5，大于0.9，說明模型相關(guān)度較好[10]。分別以物料水分含量、單次打粉時間、打粉次數(shù)作響應(yīng)面與等高線分析，由圖2至圖4可知，打粉次數(shù)（C）對環(huán)磷酸腺苷提取率的影響較大，表現(xiàn)為對應(yīng)曲線較陡;物料水分含量（A）和單次打粉時間（B）對應(yīng)曲線較平緩，表明它們對環(huán)磷酸腺苷的提取效果影響較小，這與回歸分析的結(jié)果（表4）相吻合。