綿羊背最長(zhǎng)肌組織中TMOD4基因表達(dá)差異研究

張?chǎng)? 孫洪新 劉月

摘要：研究旨在比較分析不同發(fā)育階段綿羊背最長(zhǎng)肌中TMOD4基因的表達(dá)水平。采用qRT-PCR和Western-Blot技術(shù)檢測(cè)綿羊1、7、13 月齡3個(gè)階段背最長(zhǎng)肌中TMOD4基因mRNA和蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，TMOD4的mRNA在1月齡綿羊背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)量最高，13月齡次之，7月齡較低于13月齡，其中1月齡與7月齡、13月齡之間差異極顯著（P<0.01），7月齡與13月齡之間差異顯著（P<0.05）。TMOD4蛋白水平在1月齡中最高，7月齡次之，13月齡中最低，1月齡與7月齡和13月齡之間差異極顯著（P<0.01），7月齡與13月齡之間差異顯著（P<0.05）。結(jié)果表明，TMOD4基因與綿羊背最長(zhǎng)肌組織發(fā)育相關(guān)。

關(guān)鍵詞：綿羊;TMOD4基因;背最長(zhǎng)肌;表達(dá)水平

原肌球調(diào)節(jié)蛋白4（tropomodulin4，TMOD4）基因編碼修飾蛋白——TMOD4蛋白在骨骼肌細(xì)胞中與肌動(dòng)蛋白慢速生長(zhǎng)末端結(jié)合，阻止其延展或聚合，維持肌動(dòng)蛋白絲的穩(wěn)定，在原肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用中發(fā)揮了重要作用[1]。

TMOD基因家族共有4個(gè)亞型，分別是TMOD1、TMOD2、TMOD3和TMOD4[2]。TMOD1主要表達(dá)于終分化細(xì)胞[3]，TMOD2主要在神經(jīng)元表達(dá)[4]，TMOD3普遍表達(dá)[5]，TMOD4在骨骼肌和心臟中高度表達(dá)[6]。已有研究表明，TMOD4與TMOD1高度相同，功能相似。TMOD1的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞的收縮功能減弱，小鼠上TMOD1的超表達(dá)或抑制表達(dá)會(huì)造成心肌功能異常，轉(zhuǎn)基因小鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超表達(dá)TMOD1會(huì)造成小鼠胚胎的發(fā)育異常[7]。有研究顯示，在成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞中的TMOD1通過減少肌特異性基因的表達(dá)而抑制了肌源性分化[8]，表明TMOD1可能在肌源性細(xì)胞的分化中起到抑制作用。TMOD4和TMOD1的序列相似并且蛋白功能可相互替換[9]，并且TMOD1大量存在于有纖維分裂后的終末分化細(xì)胞中，包括橫紋肌、紅細(xì)胞、晶狀體纖維細(xì)胞和神經(jīng)元[4]。

TMOD4是哺乳動(dòng)物骨骼肌中主要的TMOD亞型，在心肌中的作用與TMOD1相當(dāng)[10-11]。在非洲爪蟾早期肌纖維細(xì)胞中TMOD4基因與肌纖維細(xì)胞早期分化高度相關(guān)[12]，已有研究證明豬背最長(zhǎng)肌中TMOD4參與調(diào)控脂肪沉積與肌纖維發(fā)育[13-14]。TMOD4基因共有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，其啟動(dòng)子上游序列有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：MEF2A和C/EBPδ，而這2個(gè)位點(diǎn)的靶基因分別與肌纖維生長(zhǎng)和脂肪分子生成有關(guān)，當(dāng)TMOD4高表達(dá)時(shí)，促進(jìn)脂肪沉積，抑制肌纖維發(fā)育;低表達(dá)時(shí)，抑制脂肪生成，促進(jìn)肌纖維生長(zhǎng)[14]。以上研究說明，TMOD4與肉質(zhì)高度相關(guān)，但目前沒有任何關(guān)于綿羊的TMOD4基因的表達(dá)研究，本研究比較不同月齡綿羊背最長(zhǎng)肌組織中TMOD4的mRNA和蛋白水平，目的是為TMOD4表達(dá)水平與綿羊肌肉發(fā)育相關(guān)性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來自河北連生農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司種羊場(chǎng)，所選試驗(yàn)動(dòng)物為寒泊羊一代，相同月齡綿羊在相同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)，滿足正常的生長(zhǎng)營養(yǎng)需求。選擇1月齡、7月齡的公綿羊各3只，13月齡公綿羊2只，于目標(biāo)日齡當(dāng)天屠宰，采集8個(gè)樣品的背最長(zhǎng)肌組織，置于液氮中速凍，之后存放于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

5X All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）試劑盒（G492，100×20 μL）;EvaGreen 2× qPCR MasterMix-no DYE 熒光定量試劑盒（MasterMix-S，4×1.25 mL）;兔抗人TMOD4多克隆抗體，Affinity Biosciences常州市祥泰生物科技有限公司;鼠抗人GAPDH單克隆抗體;Western試劑盒（內(nèi)含山羊抗兔及山羊抗鼠IgG）;ND-1000核酸蛋白測(cè)定儀;組織蛋白裂解液和 PMSF;BCA蛋白定量試劑盒;微量移液器（Eppendorf，德國）;凝膠成像系統(tǒng)（MiniBis，以色列）;PCR 擴(kuò)增儀（Bio-Rad，美國）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏-96，瑞士）;電泳儀（六一生物，中國）;酶標(biāo)儀（RT-6000 型號(hào)）;Western 全自動(dòng)蛋白分析系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 本試驗(yàn)采用Trizol試劑盒說明書提取綿羊背最長(zhǎng)肌的總RNA，DEPC水溶解，電泳檢測(cè)RNA完整性，測(cè)定總RNA的濃度和純度，調(diào)整濃度至500 ng/μL，-80 ℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 通過參考文獻(xiàn)和查詢NCBI數(shù)據(jù)庫選取TMOD4基因的引物序列，內(nèi)參基因選用GAPDH。所有引物由生工生物工程股份有限公司石家莊分部合成，引物序列見表1。

1.3.3 cDNA合成 總RNA反轉(zhuǎn)錄采用5X All-In-One RT Master Mix試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在200 μL離心管中配制反應(yīng)液，總體積為 20 μL。反轉(zhuǎn)錄體系及條件：RNA Template 2 μg，AccuRT Reaction Mix（4） 2 μL，加無酶水補(bǔ)足至 8 μL。置于PCR儀中42 ℃孵育2 min或室溫孵育5 min，取出后置于冰上冷卻，加入AccRT Reaction Stopper（5×） 2 μL，5×All-ln-One RT Master Mix 4 μL，無酶水 6 μL，總體積為20 μL。將PCR管短暫離心混勻置于PCR儀中，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。反應(yīng)完成后取出cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試驗(yàn)全程冰上進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。按照Eva Green 2×q PCR Master Mix-no DYE熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行操作（表2、表3），采用羅氏-96熒光定量PCR儀對(duì)不同月齡綿羊背最長(zhǎng)肌組織內(nèi)TMOD4基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，觀察擴(kuò)增的熔解曲線。采用 Excel 軟件處理實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，按照2-ΔΔCT相對(duì)定量計(jì)算公式，分析綿羊不同月齡背最長(zhǎng)肌組織中TMOD4基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 Western-Blot 采用RIPA蛋白裂解液（強(qiáng)）提取背最長(zhǎng)肌組織總蛋白，樣品質(zhì)量與裂解液量的比例為1 g ∶ 10 mL，BCA法測(cè)定蛋白濃度。樣品的制備方法與傳統(tǒng)Western Blot相同，根據(jù)Western全自動(dòng)蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)說明書進(jìn)行后續(xù)操作。結(jié)束后用Western全自動(dòng)蛋白表達(dá)分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取和qRT-PCR

測(cè)定的RNA濃度在1 000 ng/μL左右，D260 nm/D280 nm比值為1.9～2.0。采用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA條帶清晰（圖略），28S rRNA和18S rRNA比值接近2 ∶ 1，表明所提取的總RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

由圖1可知，根據(jù)最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件建立內(nèi)參基因GAPDH和目的基因TMOD4的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸系數(shù)（r2）分別為0.993和0.991，斜率分別為-3.231和-3.228，目的基因與內(nèi)參基因差值均<0.1，說明CT值和模板起始濃度對(duì)數(shù)值之間具有良好的線性關(guān)系，內(nèi)參基因和目標(biāo)基因有很高的擴(kuò)增效率。擴(kuò)增曲線符合標(biāo)準(zhǔn)的“S”形曲線，目的基因和內(nèi)參基因的熔解曲線均呈單峰，無非特異性擴(kuò)增及引物二聚體。

2.2 不同月齡公綿羊背最長(zhǎng)肌TMOD4基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖2表明，不同月齡對(duì)TMOD4基因mRNA相對(duì)表達(dá)量有極顯著影響（P<0.01）。在1月齡表達(dá)量最高且極顯著高于13月齡和7月齡（P<0.01），13月齡和7月齡之間差異顯著（P<0.05）。

2.3 不同月齡綿羊背最長(zhǎng)肌TMOD4蛋白相對(duì)表達(dá)量

采用Western全自動(dòng)蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)的Western-blot技術(shù)檢測(cè)不同月齡綿羊背最長(zhǎng)肌組織TMOD4蛋白表達(dá)量，目的蛋白TMOD4和內(nèi)參蛋白GAPDH條帶清晰，不同月齡間內(nèi)參蛋白條帶面積和灰度基本一致，符合內(nèi)參蛋白恒定表達(dá)的特性。蛋白條帶面積和灰度值大小采用Western全自動(dòng)蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)自帶的分析軟件進(jìn)行分析計(jì)算，TMOD4與內(nèi)參對(duì)比，進(jìn)行半定量分析。由圖3和圖4可知，月齡的差異對(duì)TMOD4蛋白相對(duì)表達(dá)量有極顯著影響（P<0.01）。綿羊在1月齡時(shí)，TMOD4蛋白的相對(duì)表達(dá)量最高，平均值為2.05;13月齡時(shí)表達(dá)量最低，平均值為0.34。隨月齡的增加，綿羊背最長(zhǎng)肌TMOD4蛋白相對(duì)表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)，1月齡最高，與7月齡、13月齡表達(dá)量差異極顯著（P<0.01）;7月齡次之，與13月齡差異顯著（P<0.05）;13月齡最低。

3 討論

TMOD4是哺乳動(dòng)物骨骼肌中主要的TMOD亞型，在心肌中的作用與TMOD1相當(dāng)。TMOD4基因共有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，其啟動(dòng)子上游序列有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：MEF2A和C/EBPδ，而這2個(gè)基因分別與肌纖維生長(zhǎng)和脂肪分子生成有關(guān)，當(dāng)TMOD4高表達(dá)時(shí)，促進(jìn)脂肪沉積，抑制肌纖維發(fā)育;低表達(dá)時(shí)，抑制脂肪生成，促進(jìn)肌纖維生長(zhǎng)[14]。本研究中，綿羊在1月齡時(shí)，TMOD4 mRNA表達(dá)水平最高，其次是13月齡，最低是7月齡，TMOD4 mRNA水平隨月齡增加大幅下降最后趨于平緩略微上升;綿羊在1月齡時(shí)TMOD4蛋白水平最高，在7月齡時(shí)次之，13月齡最低，TMOD4蛋白水平隨月齡增加呈大幅下降趨勢(shì)且后期趨于平緩。試驗(yàn)所選綿羊?yàn)楹囱?，具有較高的產(chǎn)肉能力，而TMOD4作為參與決定肉質(zhì)的重要基因之一，表達(dá)量趨勢(shì)可以解讀為在綿羊發(fā)育早期主要是脂肪沉積抑制肌纖維發(fā)育，而中后期則主要促進(jìn)骨骼肌的發(fā)育并且抑制脂肪生成。喬永等研究湖羊不同月齡脂肪沉積發(fā)現(xiàn)，在綿羊早期脂肪沉積最快[15]，本研究結(jié)果與之相似。

Nworu等對(duì)非洲爪蟾胚胎細(xì)胞進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TMOD4基因在骨骼肌組織早期肌原纖維至關(guān)重要，控制骨骼肌發(fā)育[16]。TMOD4在終末分化細(xì)胞中也大量存在，在橫紋肌中，TMOD4與原肌球蛋白協(xié)同作用，結(jié)合并限制肌動(dòng)蛋白細(xì)纖維尖端肌動(dòng)蛋白單體交換，在骨骼肌快速收縮中占主導(dǎo)地位。本研究中TMOD4在早期綿羊背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)量最高，為肌纖維發(fā)育和骨骼肌的生長(zhǎng)做準(zhǔn)備，并且羔羊活潑好動(dòng)，骨骼肌收縮迅速，所以此階段綿羊TMOD4表達(dá)量最高。隨著月齡增加，綿羊骨骼肌發(fā)育完全，肌纖維粗壯，肌間脂肪減少，活動(dòng)減少，TMOD4表達(dá)水平降低。

本研究初步探討了TMOD4在綿羊不同月齡間的表達(dá)差異和大體趨勢(shì)，相關(guān)TMOD4對(duì)肉質(zhì)品質(zhì)的影響還有待于進(jìn)一步研究。

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