野生Paxillus ammoniavirescens 菌的分子鑒定及生物學特性研究

杜 萍，凃 慧，蔣佳穎，崔寶凱，戴玉成＊

(1.長江師范學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學院，重慶 408100；2.北京林業(yè)大學微生物研究所，北京 100083)

Paxillus ammoniavirescens (Contu & Dessi) 在分類學上屬于擔子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、牛肝菌目（Boletales）、網(wǎng)褶菌科（Paxillaceae）、網(wǎng)褶菌屬（Paxillus）。Paxillus Fr.屬在北半球分布廣泛，與多種寄主樹木如楊、樺、櫟、椴樹、云杉、冷杉等形成外生菌根關系[1-2]。

網(wǎng)褶菌屬種類富含褐色色素，受傷則變褐棕色，Paxillus involutus (Batsch) Fr.是“舒筋散”中藥的重要成分之一，有治腰腿疼痛、手足麻木、祛風散寒、舒筋活絡等功效。該屬很多種類在記載中有毒[3]或生吃有毒[4-5]，可出現(xiàn)胃腸道病癥[3]，但在我國北方一些地區(qū)卻廣泛采食[6]。P.involutus 在前蘇聯(lián)時期曾被大量腌制后食用，在中歐、德國等地均有食用，但在德國和波蘭等國曾發(fā)生食用者中毒現(xiàn)象[7]。據(jù)報道，攝入該菌后可造成免疫溶血甚至致命[8-9]。肖冬來等人[10]已在P.ammoniavirescens 中檢測出有溶血素蛋白。然而，根據(jù)不同國家的觀察者的經(jīng)驗，對該菌和其他近緣種是否有害的評估是不同的?！岸拘浴痹u估的差異可能取決于物種的差異鑒定。

P.involutus 是研究最廣泛的外生菌根 (ECM)真菌之一。該菌在北半球發(fā)生普遍，與許多針葉樹和落葉樹形成外生菌根[2]。該菌在形態(tài)學、生理學和生態(tài)學等有關表型性狀上表現(xiàn)出明顯的變異，也是傘菌綱外生菌根菌生態(tài)學或生理學研究的一個重要模式種[11]。在生物修復重金屬污染方面，植物和真菌形成的菌根共生體已顯示出巨大的應用潛力[12]。菌根真菌可提高宿主植物對重金屬的耐受性，在緩解植物受重金屬毒害方面具有重要作用[13-15]。P.involutus 不僅能與耐鎘植物灰楊(Populus tremula ×P.alba) 形成外生菌根，提高灰楊對Cd2+的吸收和耐受能力[16]，其本身也具有較強的Cd2+富集能力[17]?？果}菌根菌Paxillus 在鹽脅迫下具有維持K+/Na+平衡的能力，可提高樹木耐鹽性[18]。

Paxillus 屬的特點是難以進行物種鑒定，導致再生困難，因此，需要大量的菌種[1]。為了更好地了解、保護、開發(fā)大型野生食用菌資源，有必要對該物種的分類問題進行深入研究。目前，內(nèi)轉錄間隔區(qū)ITS (internal transcribed spacer) 基因序列分析法廣泛應用于野生真菌的鑒定和分類中，是一種非常可靠的方法。目前，國內(nèi)缺少對網(wǎng)褶菌屬的分子系統(tǒng)研究，已有資料多是關于其可食性和生態(tài)學特性方面[19-20]。國外對網(wǎng)褶菌屬研究較多，常將P.involutus 作為外生菌根菌研究的模式種[21]。目前，關于P.involutus 和P.rubicundulus P.D.Orton 的基因組已經(jīng)完全測序[22-23]。本研究從黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學院校園內(nèi)分離獲得一株野生網(wǎng)褶菌屬菌株，擬通過分子鑒定以及生物學特性研究，為進一步開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

供試野生菌樣品（圖1）于2014 年9 月采自黑龍江省牡丹江市黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學院校園內(nèi)云杉（Picea asperata Mast.）樹根部周圍，菌樣編號為DP20140901。

圖1 野生蘑菇新鮮子實體Fig.1 Fresh fruiting bodies of the wild mushroom

1.2 子實體形態(tài)觀察

取子實體完整部分，觀察并描述其表面性狀、結構、顏色、質(zhì)地，進行形態(tài)學特征初步鑒定。

1.3 菌種分離

采用子實體組織分離法分離菌種，在PDA 平板上培養(yǎng)8～10 d 后，挑取菌落邊緣菌絲體進行轉接和純化培養(yǎng)，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品rDNA ITS 區(qū)段的PCR 擴增、測序及分析

1.4.1 樣品基因組DNA 提取與檢測 菌絲體培養(yǎng)、收集及DNA 提取和檢測方法詳見文獻[24]。

1.4.2 樣品rDNA ITS 區(qū)段的PCR 擴增與測序 采用真菌通用引物ITS5: 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′；ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′，由英駿生物技術有限公司（invitrogen）合成[25]。PCR 擴增體系為：10 × Buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgCl24 μL，4 mmol dNTPs 3 μL，5 U·μL-1Taq DNA polymerase 0.5 μL，10 μmol·L-1引 物 各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 31.5 μL，反應總體積為50 μL。擴增條件：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30 個循環(huán)；最后于72 ℃延伸8 min，終止溫度為4 ℃。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物和Marker 上樣量均為5 μL，電泳結果于Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)成像。PCR 擴增產(chǎn)物送交華大基因（北京）公司測序。

1.4.3 ITS 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構建 將測序獲得的ITS 序列通過NCBI 進行Blast 搜索，分析同源性。選擇與供試菌株ITS 序列相似度99%以上的23 條序列，以黑木耳Auricularia heimuer F.Wu,B.K.Cui, Y.C.Dai 的ITS 序列[26]為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Clustal X 1.83 程序進行多序列匹配排列，然后通過MEGA-X 程序中的Neighbor-Joining (NJ) 方法、采用Jukes-Cantor 計算模型構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1 000 次Bootstrap 可信度分析，Kimura 2-parameter 法計算遺傳距離，空位作為完全缺失處理。

1.5 生物學特性分析

1.5.1 碳源對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響 試驗碳源：麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖為分析純。此外，采用市售玉米粉作為碳源之一。

無碳基礎培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，蛋白胨2 g，瓊脂18 g，水1 L。分別以等量的（2%）麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖加入到無碳基礎培養(yǎng)基中。對P.ammoniavirescens 母種培養(yǎng)基中碳源進行單因素篩選試驗。各設4 個重復。接種菌餅后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)。接種2 d 后開始記錄菌絲體生長速度，觀察記錄菌落特征、生長勢等。其中菌絲體生長速度= 菌落半徑（mm）/菌絲生長天數(shù)（d）。菌絲體日均生長速度差異顯著性采用SPSS 16.0 軟件中Duncan 式新復極差法進行分析。

1.5.2 氮源對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響 試驗氮源：牛肉膏、硫酸銨、酵母膏、蛋白胨為分析純。此外，采用市售麥麩和黃豆粉作為有機氮源。

無氮基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，瓊脂18 g，水1 L。分別以等量的（0.2%）牛肉膏、麥麩、硫酸銨、酵母膏、黃豆粉、蛋白胨加入到無氮基礎培養(yǎng)基中。對卷邊網(wǎng)褶菌母種培養(yǎng)基中氮源進行單因素篩選試驗。其余方法同上。

1.5.3 溫度對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響 將含有最適碳源和氮源的無菌培養(yǎng)基制成平板，接種菌餅后，分別置于21、23、25、27、29、31 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，其余方法同上。

1.5.4 pH 對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響 采用1 mol·L-1HCl 或NaOH 溶液，將含有最適碳源和氮源的液體培養(yǎng)基（可溶性淀粉20 g，蛋白胨2 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，水1 L）調(diào)配為pH 2.0～8.0 共13 個處理（間隔0.5），每250 mL 三角瓶裝液量為30 mL，每個處理4 次重復，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)兩周測量菌絲體干質(zhì)量，并記錄菌絲體長勢、菌絲體及發(fā)酵液顏色變化等。

1.5.5 碳源、氮源、無機鹽對Paxillus ammoniavirescens菌絲體生長的影響 從碳源（可溶性淀粉）、氮源（蛋白胨）和無機鹽（KH2PO4和MgSO4）中各選出3 個水平，進行四因素三水平的正交試驗，以確定各組分的最佳使用量。250 mL 三角瓶的裝液量為50 mL，滅菌前用1 mol·L-1HCl 或NaOH 溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)液為pH 4.5，接種菌餅后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)20 d，其余方法同1.5.4。

2 結果與分析

2.1 子實體形態(tài)觀察

菌蓋半球形，平展或中央下凹近漏斗狀，邊緣內(nèi)卷，直徑4～15 cm。幼菇菌蓋表面微粘，成熟后干燥，中央多成龜裂狀。菌蓋多絨至平滑，黃至紅褐色。菌肉厚，黃褐色，傷后變紅變褐黑色。菌褶延生，黃褐色，傷后初轉紅再轉黑褐色。菌柄圓柱狀，上下同粗，長4～8 cm，直徑1～2 cm，表面光滑，顏色同菌蓋，實心。子實體有特異性氣味。經(jīng)查閱圖鑒，初步判定為網(wǎng)褶菌屬種類[20]。

2.2 ITS 序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)測序獲得菌株ITS 區(qū)域核苷酸序列總長為746 bp，將樣品ITS 序列（序列號是MG571758）輸入NCBI 系統(tǒng)，用Blast 進行搜索比對，結果有23 株核酸序列與其具有99%以上的相似度，分別來自英國、美國、德國、法國、加拿大、澳大利亞、愛爾蘭、西班牙、意大利、波蘭等國家，沒有發(fā)現(xiàn)中國的報道；宿主及生長環(huán)境有椴樹（Tilia）、櫟樹（Quercus）、樺樹（Betula）、楊樹（Populus）、公園、草原等地（表1）。當物種的rDNA ITS 區(qū)序列與比對序列同源性≥99%時，可認為相同種[27]。因此，鑒定該株野生菌為Paxillus ammoniavirescens。它的5.8 S 和內(nèi)轉錄間隔區(qū)2（ITS 2）具有高度保守性，5.8 S 編碼序列一般為158 bp，ITS 2 一般為229 bp；內(nèi)轉錄間隔區(qū)1（ITS 1）序列中度保守，在275 bp 左右；18 S和28 S 基因序列變化幅度較大。ITS 序列在655～746 bp 左右。

從圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，所有分析菌株共分為4 類，即P.ammoniavirescens，P.obscurisporus，P.involutus 和P.cuprinus，而實驗菌株與P.ammoniavirescens 種類聚為一枝，因此，被鑒定為P.ammoniavirescens。

2.3 碳 源 對Paxillus ammoniavirescens 菌 絲 體 生長的影響

由表2、圖3 可見，P.ammoniavirescens 菌絲體在供試碳源培養(yǎng)基上均能生長，菌絲體顏色因碳源種類不同而呈淺黃至黃灰色（圖3）。在0.05 水平上，菌絲體日均生長速度差異顯著（表2），其中在可溶性淀粉和葡萄糖培養(yǎng)基上日均生長速度最快，菌絲體濃密，長勢強；其次是甘露醇、蔗糖為碳源的培養(yǎng)基，菌絲體較密，生長整齊，與玉米粉培養(yǎng)基上的菌絲體日均長速差異不顯著；而在無碳基礎培養(yǎng)基（CK）上生長速度最慢，菌絲體稀疏，顏色淺，長勢弱。可見，P.ammoniavirescens菌絲體生長對碳源的需求量較大，且來源廣泛。此外，菌絲體顏色因碳源種類不同而呈淺黃至黃灰色，說明碳源種類不同影響 P.ammoniavirescens 菌絲體的顏色。

2.4 氮 源 對Paxillus ammoniavirescens 菌 絲 體 生長的影響

表1 本研究中使用的物種來源和ITS 區(qū)域的GenBank 序列號信息Table 1 A list of species, origin and GenBank accession number of ITS sequences used in this study

試驗菌株菌絲體在不同氮源培養(yǎng)基上均能生長，顏色因培養(yǎng)基種類不同而呈淺黃至黃褐色，并有不同程度的褐色素分泌。在0.05 水平上，菌絲體的日均生長速度差異顯著（表3），其中在蛋白胨培養(yǎng)基上日均生長速度最快，菌絲體濃密，粗壯，邊緣生長整齊，菌絲體日均生長速度為0.857 mm·d-1；其次是麥麩和黃豆粉為氮源的培養(yǎng)基，但菌絲體生長較稀疏；在酵母膏培養(yǎng)基上菌絲體生長濃密，但長速較慢。而在無氮基礎培養(yǎng)基（CK）中生長速度最慢，菌絲體稀疏，顏色淺，可見，P.ammoniavirescens 菌絲體生長對氮源種類要求較嚴格。

圖2 基于ITS 序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

圖3 Paxillus ammoniavirescens 菌絲體在不同碳源培養(yǎng)基上的生長情況Fig.3 Paxillus ammoniavirescens growing on various carbon media

2.5 溫度對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響

由表4 可見，試驗菌株通過不同溫度試驗表明，試驗菌株在21～29 ℃范圍內(nèi)均能生長，其中25 ℃時生長速度最快，長勢最好，其次為27 ℃，而31 ℃時菌絲體不生長，表明P.ammoniavirescens菌絲體生長對溫度要求嚴格，過高或過低均不利，且適宜生長溫度范圍較窄。

表2 碳源對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響Table 2 Effect of carbon sources on mycelial growth of Paxillus ammoniavirescens

表3 氮源對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響Table 3 Effect of nitrogen sources on mycelial growth of Paxillus ammoniavirescens

2.6 pH 對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響

由表5 可以看出，試驗菌株菌絲體在pH 2.0～6.0 范圍內(nèi)均能生長，其中在pH 4.5 時長勢最好，菌絲體干質(zhì)量均高于其他處理；當pH 大于5.0 時菌絲體生長速度逐漸減慢，菌絲體生物量減少，當pH≥6.5 時菌絲體幾乎不生長，說明P.ammoniavirescens 喜歡偏酸性環(huán)境條件，且適宜生長的酸堿度范圍較窄。

表4 溫度對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響Table 4 Effect of temperature on mycelial growth of Paxillus ammoniavirescens

表5 酸堿度對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響Table 5 Effect of pH on mycelial growth of Paxillus ammoniavirescens

表6 不同碳源、氮源、無機鹽用量對Paxillus ammoniavirescens 菌絲體生長的影響Table 6 Effect of different amount of carbon, nitrogen and inorganic salt on mycelial growth of Paxillus ammoniavirescens

圖4 Paxillus ammoniavirescens 菌絲體在不同碳源、氮源和無機鹽用量培養(yǎng)基中的生長情況Fig.4 The growth of Paxillus ammoniavirescens mycelia in liquid media with different amount of carbon, nitrogen and inorganic salt

2.7 菌絲體培養(yǎng)最適碳源、氮源及無機鹽用量

由表6 可以看出，P.ammoniavirescens 菌絲體在不同碳源、氮源、無機鹽用量的培養(yǎng)基中長勢良好，菌絲體及發(fā)酵液顏色變化不明顯（圖4）。其中配方4 的菌絲體干質(zhì)量最大，為80 mg，與配方1、2、5、6 和8 的菌絲體干質(zhì)量差異不明顯，與配方3、7 和9 的菌絲體干質(zhì)量差異顯著。由正交試驗優(yōu)化的菌絲體培養(yǎng)的最佳組合為：A2B1C2D3，即可溶性淀粉20 g，蛋白胨2 g，KH2PO43.0 g，MgSO44.5 g，水1 L，pH 4.5。由極差分析可知，各營養(yǎng)因素對菌絲體干質(zhì)量影響的大小順序為：可溶性淀粉＞KH2PO4＞MgSO4＞蛋白胨。

3 討論

通過rDNA ITS 序列測定和分析，證明試驗菌株為P.ammoniavirescens。在歐洲，Paxillus 屬可分為P.involutus complex 和P.rubicundulus，后者主要發(fā)生在濕地生境中，且只與榿木（Alnus spp.,Betulaceae）有關[32]。而P.involutus complex 種類則分布在更多樣的生境中，并與多種樹種有一定的聯(lián)系。因此，寄主特異性是鑒別P.rubicundulus 的一種有效特征，但在P.involutus 復合種中進行種類鑒別仍然十分困難[21]。Fries[33]認為P.involutus存在著3 個相互兼容的類群，第一類子實體主要分布在針葉林和落葉林中（森林組），第二組和第三組主要分布在公園和花園區(qū)域（公園組）。然而，這些群體的子實體之間沒有明顯的形態(tài)學差異，因此，被稱為P.involutus 同形種（隱蔽種）。不同作者對rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育分析[1,11,21,31]證實了5 種不同的物種存在于P.involutus complex 中: P.involutus,P.ammoniavirescens, P.cuprinus, P.obscurosporus和P.vernalis Watling (1969)。其中，根據(jù)形態(tài)特征進行鑒別是極其困難的。

Hedh et al.[11]鑒 定EU078741，AY585915，AY585917 為P.validus，而Jargeat et al.[21]則鑒定是P.ammoniavirescens，Anderson & Parkin[28]鑒定AM084700 為 P.involutus，且 與 AY585915 有99.7%的相似度，在NCBI 中比對AY585915 也是P.involutus，即同一號菌株AY585915 曾被鑒定為3 個不同種，進一步說明在P.involutus 復合種中進行種類鑒別十分困難。

本研究發(fā)現(xiàn)，P.ammoniavirescens 在可溶性淀粉培養(yǎng)基上氣生菌絲體生長旺盛，在葡萄糖、麥芽糖、甘露醇培養(yǎng)基上分泌較多褐色素，菌絲顏色較深，而在蔗糖、可溶性淀粉和玉米粉培養(yǎng)基上分泌褐色素較少，顏色淺。在氮源篩選中發(fā)現(xiàn)多數(shù)菌絲體在培養(yǎng)中后期有黃褐至黑褐色素形成，尤其在牛肉膏和硫酸銨培養(yǎng)基中分泌較多褐色素，說明培養(yǎng)基成分影響菌絲體的顏色和褐色素的形成。P.ammoniavirescens 菌絲體培養(yǎng)中后期氣生菌絲旺盛，濃密、粗壯、分枝明顯，初期灰褐色，隨培養(yǎng)時間的延長而呈黃褐色，褐色素分泌嚴重，并有少許硬質(zhì)顆粒（菌核）形成（圖5）。P.ammoniavirescens 子實體受傷會變褐棕色，而菌絲體在固體培養(yǎng)基中分泌的褐色素可能與其有關，或許具有某種特殊的藥用成分。

圖5 Paxillus ammoniavirescens 培養(yǎng)中后期菌落特征Fig.5 Colony of Paxillus ammoniavirescens in the middle and late stage of culture

Jargeat 等[21]采用完全固態(tài)MP（麥芽浸粉、蛋白胨）培養(yǎng)基（C+，含有18 種無機鹽和6 種抗生素）和僅含2.5 g·L-1葡萄糖作為碳源的MP 培養(yǎng)基（C-）于24 ℃條件下培養(yǎng)P.involutus、P.ammoniavirescens 和P.cuprinus 的菌絲體35 d，發(fā)現(xiàn)在C+培養(yǎng)基上3 種菌絲體均產(chǎn)生棕色色素，在基質(zhì)中擴散，并在菌絲上形成串珠（硬質(zhì)顆粒）。P.cuprinus 氣生菌絲灰褐色，有褐色液滴，菌絲體日均生長速度為0.398～0.655 mm，在富含高碳量的培養(yǎng)基（葡萄糖、麥芽提取物、酪蛋白）中菌絲體更致密，由于色素產(chǎn)量高，培養(yǎng)基會產(chǎn)生棕色染色。P.involutus 在加富培養(yǎng)基中，色素生成少，無褐色液滴，菌絲日均生長速度為0.463～0.773 mm。而絕大多數(shù)P.ammoniavirescens 菌株生長迅速，在3～4 周內(nèi)可覆蓋整個培養(yǎng)基，在加富培養(yǎng)基和貧瘠培養(yǎng)基上均有濃密的棉絮狀氣生菌絲、褐色液滴和硬的顆粒（菌核）。菌絲體日均生長速度為0.587～0.950 mm。本研究中菌絲體日均生長速度均快于這3 個種，但與P.ammoniavirescens更接近，這與ITS 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育關系顯示的該野生菌株為P.ammoniavirescens 的分析結果相吻合。

4 結論

本研究通過ITS 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育關系分析，證明該野生菌株為Paxillus ammoniavirescens。利用單因子試驗篩選出了P.ammoniavirescens 菌絲體生長的適宜碳源為可溶性淀粉，適宜氮源為蛋白胨，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，最適pH 為4.5。由正交試驗優(yōu)化的液體菌種培養(yǎng)的最佳配方為可溶性淀粉20 g、蛋白胨2 g、KH2PO43.0 g、MgSO44.5 g、水1 L。在此培養(yǎng)條件下可獲得平均干質(zhì)量為80 mg 的菌絲體，明顯高于其他配方。菌絲體在固體和液體培養(yǎng)基中的顏色差異較大，在固體培養(yǎng)基中的顏色因碳氮源種類不同而不同，分泌褐色素的程度有差異；在液體培養(yǎng)基中無褐色素分泌，菌絲體和培養(yǎng)液均呈鮮黃色。該研究結果將為P.ammoniavirescens 種的菌絲體液體深層發(fā)酵培養(yǎng)、人工馴化栽培及藥用成分開發(fā)利用提供理論基礎，并可作為外生菌根菌在生物修復重金屬污染、抗逆境脅迫等方面得以應用。