阿爾茲海默癥轉(zhuǎn)基因鼠生長過程中海馬theta節(jié)律及行為學的實驗研究*

譚如欣，王欣，殷濤，劉志朋

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院 生物醫(yī)學工程研究所，天津 300192)

1 引 言

阿爾茲海默癥(AD)是一種通常發(fā)病于老年期的慢性、原發(fā)性、不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為記憶力受損，學習功能和語言功能出現(xiàn)障礙，早期易與正常衰老相混淆，晚期能出現(xiàn)嚴重的行為障礙，生活不能自理等。AD的主要病理特征為淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)，并伴隨有神經(jīng)毒性炎癥和小膠質(zhì)細胞紊亂等[1-2]。針對AD疾病的治療目前仍然是一個難題。

神經(jīng)調(diào)控是采用物理刺激或藥物手段改變中樞神經(jīng)、外周神經(jīng)或自主神經(jīng)系統(tǒng)活性，從而改善患者的癥狀。神經(jīng)調(diào)控對改善AD認知障礙具有重要意義，并已取得一定進展。

目前，已有多項研究顯示AD患者和AD轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)電活動存在異常，為通過調(diào)控神經(jīng)活動治療AD提供了依據(jù)[3-5]。神經(jīng)振蕩表征的是局部場電位(localfieldpotentials，LFPs)記錄到的周期性波動的或節(jié)律性的神經(jīng)系統(tǒng)活動。大腦皮層電活動中包含多個頻段的神經(jīng)振蕩。海馬腦區(qū)是空間記憶和陳述性記憶的關鍵腦區(qū)，海馬神經(jīng)振蕩節(jié)律尤其是海馬theta節(jié)律被認為與學習記憶、注意力、動機等高級神經(jīng)活動密切相關[6-8]。海馬theta節(jié)律的頻率在 4～7 Hz，一般認為神經(jīng)振蕩theta節(jié)律的產(chǎn)生與內(nèi)側(cè)隔閡對海馬中間神經(jīng)元和錐體神經(jīng)元的抑制性輸入有關[9]。

然而，AD行為認知異常發(fā)展過程中的行為學和電生理變化還需要大量的實驗探究。本研究對AD轉(zhuǎn)基因鼠和同源WT鼠進行行為學及在體電生理研究，對比不同月齡段AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT鼠的空間認知行為和海馬區(qū)DG和PP的局部場電位，旨在探討AD患者認知功能障礙與海馬神經(jīng)元同步化電活動的關系，獲得海馬theta節(jié)律在AD發(fā)展過程中的變化特點，為神經(jīng)調(diào)控AD電活動提供實驗依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 實驗動物

10只AD轉(zhuǎn)基因鼠(5XFAD)，10只同源WT鼠，均購置于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，動物飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，室溫為(24±2)℃，按照明/暗各12 h提供照明，自由飲食。

2.2 實驗分組

10只AD轉(zhuǎn)基因鼠分為兩組，2月齡AD組6只和5月齡AD組4只；同時將10只同源WT鼠分為兩組，2月齡對照組6只和5月齡對照組4只。2月齡AD組和2月齡WT對照組進行行為學和在體電生理實驗。5月齡AD組和5月齡WT對照組依次進行水迷宮實驗和在體電生理實驗。

2.3 行為學實驗

采用直徑150 cm的Morris水迷宮對空間學習記憶能力進行測試。將水槽平均分成四個象限并進行標記，采用位于水槽正上方的高清攝像頭對小鼠運動軌跡進行捕捉，并經(jīng)Anymaze動物行為學記錄軟件進行分析處理。實驗流程分為訓練和測試。訓練一共5天，每天訓練4次，訓練時長為60 s。在第6天進行測試，小鼠從離平臺最遠的象限入水，記錄小鼠穿越原始平臺區(qū)域次數(shù)。觀察指標還包括小鼠在訓練時逃避潛伏期，小鼠游泳速度，小鼠在測試時穿越平臺次數(shù)，平臺象限百分比。

2.4 在體電生理實驗

使用腹腔注射烏拉坦(1.2 g/kg)對小鼠進行麻醉，將小鼠固定在腦立體定位儀上，劃開小鼠頭皮，暴露整個頭骨。用少量過氧化氫溶液使前顱清晰后，對DG區(qū)進行定位。使用專用顱鉆在定位顱骨上開一直徑約為3 mm的小孔，并在顯微鏡下將記錄電極分別插入PP和DG區(qū)。信號采樣頻率為1 kHz，帶通為0.1～120 Hz，記錄信號20 min。

2.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用mean±SEM表示，局部場電位數(shù)據(jù)采用Matlab2016a進行分析處理，濾除50 Hz工頻干擾和低頻漂移，提取局部場電位功率譜密度。統(tǒng)計學分析使用SPSS 21.0版本，采用多因素方差分析，給出雙因素方差分析的單變量檢驗，差異顯著水平設定為P<0.05。

3 實驗結(jié)果

3.1 2月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠行為學對比

圖1為2月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠行為學實驗對比。由圖可知，在訓練的第一天，AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠的逃避潛伏期相同，從第二天開始，隨著訓練天數(shù)的增加，每一組的平均逃避潛伏期均表現(xiàn)出明顯的下降趨勢。第一天和第四天的逃避潛伏期具有顯著差異(P=0.018)，表明AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠尋找平臺能力的提高，反映了學習記憶的有效性。在訓練中，AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠逃避潛伏期和游泳速度均無顯著差異。在測試過程中，兩組小鼠的穿越平臺次數(shù)和平臺象限百分比均無顯著差異。行為學實驗結(jié)果顯示，在鼠齡為兩個月時，AD轉(zhuǎn)基因鼠并未出現(xiàn)行為異常，兩月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠在空間學習記憶能力和運動能力上與WT對照鼠無差異。

3.2 2月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠的在體電生理對比

圖2為小鼠局部場電位的功率譜密度曲線。由圖2(a)、圖2(b)可知，AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠的信號主頻均在theta頻段。由圖2(c)、圖2(d)可知，AD轉(zhuǎn)基因鼠的LFPs信號主頻明顯低于WT對照鼠，表現(xiàn)為AD轉(zhuǎn)基因鼠局部場電位功率頻譜相較于WT對照鼠整體左移，且在DG區(qū)和PP區(qū)均存在這種差異。

圖1 2月齡小鼠水迷宮(a).訓練逃避潛伏期;(b).訓練游泳速度;(c).穿越平臺次數(shù);(d).平臺象限百分比Fig.1 Water maze results for 2-month-old mice(a).escape latency;(b).swimming speed;(c).platform crossings;(d).quadrant dwell time

圖2 小鼠局部場電位功率譜密度曲線

(a).AD小鼠局部場電位功率譜密度曲線;(b).WT小鼠局部場電位功率譜密度曲線;(c).AD小鼠和WT小鼠在DG區(qū)的局部場電位功率譜密度對比;(d).AD小鼠和WT小鼠在PP區(qū)的局部場電位功率譜密度對比
Fig.2Local field potential power spectral density curve
(a).AD group local field potential power spectral density;(b).WT group local field potential power spectral density;(c).local field potential power spectral density in DG area;(d).local field potential power spectral density in PP area

為了量化兩組小鼠的theta節(jié)律變化，進一步提取了AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠的功率峰值和峰值對應的頻率值，功率峰值對應頻率反映了兩組小鼠LFPs的主頻分布情況，見圖3。由圖3(a)、圖3(b)可知，兩組小鼠DG區(qū)和PP區(qū)的功率峰值均無明顯差異。圖3(c)、圖3(d)分別為DG區(qū)和PP區(qū)的功率峰值對應頻率。其中，DG區(qū)AD轉(zhuǎn)基因鼠的功率峰值對應頻率為(2.78±0.78) Hz，WT對照鼠的功率峰值對應頻率為(3.66±0.56) Hz，兩者差異較大，具有統(tǒng)計學意義(P=0.015)；PP區(qū)AD轉(zhuǎn)基因鼠的功率峰值對應頻率為(2.72±0.72) Hz，WT對照鼠的功率峰值對應頻率為(3.66±0.56) Hz，兩者具有顯著差異(P=0.021)。結(jié)果表明，2月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠theta頻率的功率峰值與WT對照鼠無異，但功率峰值對應的頻率值明顯低于同齡WT對照鼠。由此可知，AD轉(zhuǎn)基因鼠在2月齡時已出現(xiàn)了海馬theta節(jié)律的異常。

圖3 小鼠局部場電位theta功率峰值和theta功率峰值對應頻率的統(tǒng)計結(jié)果(a).DG區(qū)theta功率峰值;(b).PP區(qū)theta功率峰值;(c).DG區(qū)theta功率峰值對應頻率;(d).PP區(qū)theta功率峰值對應頻率Fig.3 Statistical results of local field theta power peak and main frequency of theta power peak(a).theta power peak in DG area;(b).theta power peak in PP area;(c).main frequency of theta power peak in DG area;(d).main frequency of theta power peak in PP area

3.3 5月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠行為學對比

對5月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠的水迷宮空間學習記憶能力測試結(jié)果，見圖4。圖4(a)顯示兩組小鼠的逃避潛伏期均隨著天數(shù)的增加逐漸縮短(P<0.05)，反映了學習記憶的有效性。同時，5月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠的逃避潛伏期顯著長于同齡WT對照鼠(P=0.002)，表明AD轉(zhuǎn)基因鼠在5月齡時出現(xiàn)了空間學習記憶認知障礙。由圖4(b)可知，訓練期間兩組小鼠的平均游泳速度不受訓練天數(shù)影響，AD轉(zhuǎn)基因鼠的游泳速度比同齡WT對照鼠更慢，并具有顯著性差異(P=0.002)，可能是由于5月齡時的AD病變對小鼠運動功能產(chǎn)生了一定的影響，使得AD轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)了一定的運動障礙。圖4(c)和圖4(d)顯示AD轉(zhuǎn)基因鼠在測試過程中的穿越平臺次數(shù)和平臺象限百分比均低于WT對照鼠，再次驗證5月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)學習認知障礙。

3.4 2月齡與5月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠的電生理對比

由圖5可知，5月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠的theta功率峰值及總功率峰值均低于2月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠，反映了隨著鼠齡的增長，AD轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)活動變?nèi)酢?/p>

圖4 5月齡小鼠水迷宮(a).5月齡小鼠訓練逃避潛伏期;(b).5月齡小鼠訓練游泳速度;(c).5月齡小鼠測試穿越平臺次數(shù);(d).5月齡小鼠測試平臺象限百分比Fig.4 Water maze results for 5-month-old mice(a).escape latency;(b).swimming speed;(c).platform crossings;(d).quadrant dwell time

圖5 2月齡和5月齡AD小鼠電生理對比(a).DG區(qū)總功率峰值;(b).PP區(qū)總功率峰值;(c).DG區(qū)theta功率峰值;(d).PP區(qū)theta功率峰值Fig.5 Electrophysiological in vivo comparison between 2-month-old mice and 5-month-old mice(a).power peak in DG area;(b).power peak in PP area;(c).theta power peak in DG area;(d).theta power peak in PP area

4 討論

本研究對比了2月齡和5月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠的局部場電位功率特征和水迷宮測試的學習記憶行為表現(xiàn)，結(jié)果表明，5月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠顯示出明顯的學習記憶認知障礙，2月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠尚未出現(xiàn)認知障礙，但局部場電位已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的頻譜左移，反映出神經(jīng)電活動異常。

海馬theta節(jié)律與LTP和學習記憶能力以及空間記憶能力均有著較為密切的聯(lián)系。已有研究闡明海馬theta節(jié)律對空間位置的神經(jīng)編碼具有重要作用，海馬theta節(jié)律的喪失會導致大鼠的空間記憶缺陷[10]；theta節(jié)律可以同步神經(jīng)元，以使信息在神經(jīng)回路內(nèi)和神經(jīng)回路之間傳遞[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著水迷宮訓練天數(shù)的增加，海馬網(wǎng)絡峰值頻率逐漸增加，認為小鼠在空間學習過程中網(wǎng)絡活動的這些變化可能是導航學習的基礎[13]。

在本研究中觀察到的theta節(jié)律活動的變化與已有研究是一致的，theta節(jié)律振蕩或其耦合的變化是空間學習[13-14]和空間決策[15-17]的特征，表明了theta振蕩在認知過程中的作用。在圖1(b)和圖4(b)中，2月齡和5月齡WT對照鼠同組對比，在水迷宮空間學習時的游泳速度并無明顯變化，說明當動物編碼行為相關信息時，如在空間學習決策中，theta頻率與運動速度之間的關系是不耦合的[6,16,18]。本研究在獲得了正常動物在空間學習時行為學和海馬theta節(jié)律關系的基礎上，對比不同月齡階段AD轉(zhuǎn)基因鼠和WT對照鼠的神經(jīng)活動振蕩以及認知行為表現(xiàn)。圖1(c)和圖1(d)中，AD轉(zhuǎn)基因鼠在2月齡時雖然沒有表現(xiàn)出行為學異常，但在圖2中，其海馬區(qū)theta節(jié)律與WT對照鼠有著顯著的區(qū)別， AD轉(zhuǎn)基因鼠的theta峰值頻率明顯小于WT對照鼠，從theta節(jié)律上表現(xiàn)出AD轉(zhuǎn)基因鼠空間認知學習能力缺陷。另一方面，AD轉(zhuǎn)基因鼠的theta節(jié)律異常早于認知行為異常，在5月齡時，AD轉(zhuǎn)基因鼠在水迷宮實驗中表現(xiàn)出顯著的空間認知障礙，出現(xiàn)行為異常，結(jié)合AD轉(zhuǎn)基因鼠早期theta節(jié)律異常情況，說明theta節(jié)律除了能實時反映記憶任務的表現(xiàn)，還與空間認知缺陷存在密切聯(lián)系。這也提示我們對AD患者認知能力缺陷判斷時，在觀察早期AD患者記憶能力的同時，還要關注是否出現(xiàn)theta節(jié)律異常，從而進行早期干預治療。

5 結(jié)論

本研究通過比較不同月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠與WT對照鼠的電生理特征和認知行為表現(xiàn)，分析了AD轉(zhuǎn)基因鼠電生理異常和認知異常出現(xiàn)的時期。結(jié)果表明，AD轉(zhuǎn)基因鼠在2月齡時，電生理活動theta節(jié)律出現(xiàn)異常，但認知行為尚未出現(xiàn)異常；5月齡時，AD轉(zhuǎn)基因鼠相較于同源WT對照鼠，認知能力和運動能力均出現(xiàn)明顯的損傷。AD疾病在發(fā)展過程中，海馬電活動異常要早于認知功能障礙。本研究從宏觀上探究了AD患者認知功能障礙與海馬神經(jīng)元同步化電活動的關系，明確了海馬theta節(jié)律在AD發(fā)展過程中出現(xiàn)了變化，在以后的工作中，將深入研究闡明海馬theta節(jié)律與AD發(fā)展的關系。