高效液相色譜法測定麝香心腦樂片中葛根素的含量

彭振宇，巫明慧，翟宏宇

（吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林 長春 130033）

麝香心腦樂片是由丹參、三七、紅花、淫羊藿、葛根、郁金、冰片、麝香、人參莖葉總皂苷9味中藥制成的糖衣片劑，具有活血化瘀，開竅止痛的功效，臨床主要用于冠心病，心絞痛，心肌梗塞，腦血栓等疾病的治療[1]。近些年來，臨床應(yīng)用麝香心腦樂片治療冠心病心絞痛取得滿意效果[2]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，麝香心腦樂片能夠顯著降低急性心肌梗死模型犬的血清乳酸脫氫酶和肌酸磷酸激酶的含量，具有明顯的抗心肌缺血作用[3]。其標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成分制劑第十三冊，僅有簡單的理化鑒別項(xiàng)，并未對處方中任何一味藥進(jìn)行定量研究。本文采用HPLC法對其處方內(nèi)葛根中指標(biāo)性成分——葛根素進(jìn)行定量研究，為麝香心腦樂片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

LC-2010C高效液相色譜儀，日本SHIMADZU；BT 125D型分析天平，德國Sartorius；KQ 700DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料

葛根素（批號：110854-201509，含量93.7%）對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈，色譜純，F(xiàn)isher；其他試劑均為分析純，水為超純水。

麝香心腦樂片中各味藥材（丹參、三七、紅花、淫羊藿、葛根、郁金、冰片、麝香、人參莖葉總皂苷）購自吉林省同仁大藥房有限公司，由吉林省藥品檢驗(yàn)所中藥專家溫立義進(jìn)行了基源鑒定。麝香心腦樂片3批，購自吉林大藥房，批號分別為20140201、20140601、20140901。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

LC-2010C高效液相色譜儀；Diamonsil C18 （4.6×250 mm，5 μm）色譜柱；甲醇-水(29：71)為流動相；流速1.0 mL.min-1，柱溫35 ℃，檢測波長為250 nm。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取葛根素對照品適量，加30%乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品20片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇100 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備

根據(jù)處方中的比例及工藝，制備缺葛根的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法依法制成葛根的陰性對照溶液。

2.5 方法學(xué)考察

在上述的色譜條件下，分別精密吸取對照品、供試品和陰性對照品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，陰性對照溶液在與葛根素對照品色譜峰保留時間處無色譜峰，表明陰性對照物無干擾，見圖1。

2.5.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液1、3、5、10、15 μL注入色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以葛根素的含量（μg）和相應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性回歸，計算回歸方程。

Y =6.13×106X-14132.66，r＝1.0000，結(jié)果表明葛根素在0.0892～1.3380 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A),sample(B) and negative sample without Moutan Cortex (C)

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，供試品色譜峰峰面積的RSD為0.37%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0，6，8，12，18 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，葛根素色譜峰峰面積的RSD為1.39%，表明供試品溶液中葛根素在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次樣品，按“2.3”項(xiàng)下的方法分別制備供試品溶液6份，照“2.1”項(xiàng)下方法測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，葛根素峰面積的RSD為1.34%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.5.5 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取樣品0.5 g（含量6.02 mg·g-1），共6份，分別加入葛根素對照品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計算葛根素的回收率。結(jié)果顯示，葛根素的回收率為99.70%，RSD為0.54%。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.5.6 耐用性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中選取了不同廠家色譜柱（Kromasil C18、Gemini C18、Apollo C18）及不同廠家和型號的高效液相色譜儀（LC 20A、Agilent 1200）對各供試品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，不同廠家色譜柱和不同儀器均能對樣品進(jìn)行較好分離，適用性良好。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品測定

按照2.3項(xiàng)下方法制備3批樣品的供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，分別計算含量，結(jié)果見表2。

表2 含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 提取方法的考察

考慮到處方中藥味較多，成分復(fù)雜，為了減少測定過程中其他成分的干擾，筆者采用不同濃度甲醇和不同濃度的乙醇分別進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，采用甲醇提取雜峰較多；而采用乙醇提取所得的色譜峰相對較少，基線平穩(wěn)，采用30%乙醇提取時含量最高，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道相一致[4-9]。實(shí)驗(yàn)中還采用超聲和回流兩種方式分別進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，相同的提取時間下超聲提取和回流提取所得到的峰面積差不多，超聲提取30 min所得的峰面積最高，增加提取時間并未顯著提高含量，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選取30%乙醇超聲30 min進(jìn)行提取。

3.2 測定波長的選擇

采用紫外-可見分光光度計對葛根素對照品溶液在200～400 nm下進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示在250 nm附近葛根素具有最大吸收，參考《中國藥典》“葛根”項(xiàng)下葛根素的檢測波長[10]，最終選用250 nm作為測定波長。

3.3 小結(jié)

本文建立了采用HPLC法對麝香心腦樂片中葛根素含量測定方法，方法簡單，快捷，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，為麝香心腦樂片中葛根的質(zhì)量控制提供了一定的理論依據(jù)。