青光安II號方有效組分對青光眼模型DBA/2J小鼠視網膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白表達的影響

李銀鑫 蔣鵬飛 曾志成 彭清華

〔摘要〕 目的 觀察青光安II號方有效組分對青光眼模型DBA/2J小鼠視網膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白表達的影響。方法 將8只（16只眼）雌性C57BL/6小鼠設為空白組（A組），48只（96只眼）雌性DBA/2J小鼠隨機分成6組，每組8只（16只眼），分別為：模型組（B組）、益脈康分散片組（C組）、青光安II號湯劑組（D組）、青光安II號有效組分低濃度組（E組）、青光安II號有效組分中濃度組（F組）、青光安II號有效組分高濃度組（G組），B、C、D、E、F、G組DBA/2J小鼠喂養(yǎng)38周齡建立青光眼模型后開始干預，干預4周后Western blot法檢測DBA/2J小鼠視網膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白的相對表達量。結果 干預4周后，與A組比較，B組RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白相對表達量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與B組比較，C、D、E、F、G組RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白表達減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與C組比較，D、E、F組RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白相對表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與C、D組比較，G組RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 青光安II號方有效組分能抑制Rho/ROCK信號通路及凋亡相關蛋白Caspase-3的表達，其中高濃度青光安II號方有效組分效果優(yōu)于益脈康分散片和青光安II號方湯劑，推測青光安II號方及其有效組分治療青光眼的機制可能與其抑制Rho/ROCK信號通路及視網膜細胞凋亡相關蛋白表達有關。

〔關鍵詞〕 青光眼;青光安II號方;DBA/2J小鼠;Rho/ROCK信號通路;細胞凋亡

〔中圖分類號〕R285.5;R775 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.006

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of the effective component of Qingguang'an II on the expression of RhoA， ROCK and Caspase-3 protein in the retina of DBA/2J mice with glaucoma. Methods Eight female C57BL/6 mice （16 eyes） were set as the blank group （Group A）， and 48 female DBA/2J mice （96 eyes） were randomly divided into 6 groups， with 8 rats （16 eyes） in each group. Theses groups were model group （group B）， Yimaikang Dispersible Tablet group （group C）， Qingguang'an II Decoction group （group D）， Qingguang'an II effective component low concentration group （Group E）， Qingguang'an II effective component middle concentration group （Group F）， Qingguang'an II effective component high concentration group （Group G）. Groups B， C， D， E， F and G were fed for 38 weeks after birth， and the glaucoma model was established. From week 39， all the groups were treated for 4 weeks， and the expression of RhoA， ROCK and Caspase-3 protein was detected by western blot. Results After 4 weeks intervention， compared with group A， the expression of RhoA， ROCK， and Caspase-3 protein in group B was significantly increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）; Compared with group B， the expression of RhoA， ROCK， and Caspase-3 protein in group C， D， E， F， G were decreased， and the difference was statistically significant （P<0.05）; Compared with groups C， the expression of RhoA， ROCK， Caspase-3 protein in group D， E and F was not statistically significant different （P>0.05）. Compared with group C， D， the expression of RhoA， ROCK， and Caspase-3 protein in group G was decreased， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The effective component of Qingguang'an II can inhibit the expression of Rho/ROCK signaling pathway and apoptosis-related protein Caspase-3 in retinal cells， and the effect of high concentration Qingguang'an II effective component is better than Yimaikang Dispersible Tablets and Qingguang'an II Decoction The mechanism of Qingguang'an II and its effective component for glaucoma may be related to its inhibition of Rho/ROCK signaling pathway and the expression of apoptosis-related proteins in retinal cells.

〔Keywords〕 Glaucoma; Qingguang'an II prescription; DBA/2J mice; Rho/ROCK signaling pathway; apoptosis

青光眼（glaucoma）是因視網膜神經節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGCs）及其軸突漸進變性，進而導致特征性視神經結構性損害并伴隨視力損失的一組視神經病變疾病[1]，本病都具有視神經損害這一病理結局，其原因是各種病理因素導致了RGCs的損傷、變性、凋亡[2]。目前，阻斷或降低RGCs凋亡、提高RGCs存活率逐漸成為青光眼研究的主流方向[3]。視神經損傷后，Rho/ROCK信號通路激活，視網膜及視神經RhoA和ROCK蛋白表達，凋亡相關蛋白Caspase-3表達逐漸升高，視網膜、視神經的形態(tài)學明顯改變，如視神經軸突腫脹、軸突數(shù)目減少、髓鞘松解變性、板層結構分離、神經間質基質密度降低等[4-6]。阻斷Rho/ROCK信號通路可抑制RGCs的凋亡，提高RGCs的存活率，從而起到保護神經的作用[7]。RhoA、ROCK蛋白是該信號通路上的重要蛋白，Caspase-3是凋亡相關蛋白。前期實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)，“血瘀水停”為青光眼早中期病機之一[4]，根據青光眼視神經損傷的中醫(yī)病理機制，對青光安顆粒劑的組方進行優(yōu)化，研發(fā)了青光安Ⅱ號方[2]。本實驗觀察了青光安Ⅱ號方及其低、中、高濃度有效組分對青光眼模型DBA/2J小鼠視網膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白表達水平的影響，希望能明確青光安II號方治療青光眼的部分機制。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?實驗動物 ?48只10周齡健康SPF級雌性DBA/2J小鼠，體質量18～22 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物質量合格證號：1100111911055898;8只10周齡健康SPF級雌性C57BL/6J小鼠，體質量18～22 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物質量合格證號：1107271911002463。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心實驗動物中心SPF級實驗室，標準化顆粒飼料飼養(yǎng)，自由進食、進水。

1.1.2 ?實驗藥物 ?青光安Ⅱ號湯劑：由枸杞子、黃芪、女貞子等道地藥材按規(guī)定比例用滅菌蒸餾水制成懸混液;青光安II號方有效組分懸混液：基于課題組既往中藥高通量篩選體系[8-9]經驗對青光安II號方中藥組分庫的篩選，提取出青光安II號方有效組分懸混液。益脈康分散片：湖南湘雅制藥有限公司，批號：1903119。

1.1.3 ?主要試劑及儀器 ?RIPA裂解液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G2002）;BCA蛋白定量檢測試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G2026）;β-actin（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB12001）;HRP標記山羊抗兔（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB23303）;兔抗-RhoA（北京博奧森生物技術有限公司，批號：20190586）;兔抗-ROCK（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：AF07053985）;兔抗-Caspase-3（北京博奧森生物技術有限公司，批號：AG07138921）;Tono-pen AVIA筆式眼壓計（美國Reichert公司）;微量可調移液器（廣州雷得生物技術有限公司）;脫色搖床（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：TSY-B）。

1.2 ?實驗方法

1.2.1 ?青光眼模型的建立 ?根據楊帆等[10-11]的實驗研究，采用DBA/2J小鼠喂養(yǎng)至38周齡自動成模。動態(tài)觀察DBA/2J小鼠眼壓、眼前節(jié)變化，38周齡時DBA/2J小鼠眼壓較前明顯升高，裂隙燈下可見角膜鈣化斑、虹膜色素脫失、瞳孔移位及部分并發(fā)白內障，則造模成功。

1.2.2 ?實驗分組 ?將8只（16只眼）雌性C57BL/6J小鼠設為空白組（A組），48只（96只眼）雌性DBA/2J小鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分成6組，分別為模型組（B組）、益脈康分散片組（C組）、青光安II號湯劑組（D組）、青光安II號方有效組分低濃度組（E組）、青光安II號方有效組分中濃度組（F組）、青光安II號方有效組分高濃度組（G組），并對所有實驗動物進行標號處理。

1.2.3 ?動物給藥 ?第38周齡時，各組開始灌胃給藥，連續(xù)4周，每日1次。其中A組和B組飼服12.91 mL/（kg·d）蒸餾水;C組飼服0.31 g/（kg·d）益脈康分散片懸混液;D組飼服9.67 g/（kg·d）青光安II號方懸混液;E、F、G組飼服0.85 g/（kg·d）、1.70 g/（kg·d）、3.40 g/（kg·d）青光安II號方有效組分懸混液（按“人-動物體表面積等效劑量比值表”折算，相當于成人等效劑量的1/2倍、1倍、2倍）。

1.2.4 ?取材 ?干預第4周后，將各組小鼠行頸椎脫臼處死，迅速取出眼球，在解剖顯微鏡下用眼科顯微器械沿角鞏膜緣剪開，除去眼前節(jié)及玻璃體，迅速剝離出視網膜組織，置入EP管中，標記組別、序號及眼別，再放入液氮罐中保存，供Western blot檢測各組視網膜RhoA、ROCK和Caspase-3蛋白相對表達量。

1.2.5 ?指標檢測方法 ?從液氮罐中取出視網膜組織，每組每兩張視網膜組織為1個樣本，每組檢測8個樣本。視網膜組織加入RIPA裂解液充分裂解、勻漿、離心，離心后取上層清液制成總蛋白溶液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度。根據測定樣品的吸光值，在標準曲線上查得其相應的蛋白含量。制備樣品并計算上樣量，然后進行蛋白變性。灌膠上樣后進行電泳，將蛋白質電泳到凝膠上。將修剪好的PVDF膜浸入甲醇中使其活化后進行轉膜，使凝膠上的蛋白質能轉移至膜上。室溫下將轉好的膜在脫色搖床上封閉，孵育各指標一抗（兔抗-RhoA、兔抗-ROCK、兔抗-Caspase-3多克隆抗體）、二抗（HRP標記-山羊抗兔）。在暗室環(huán)境下加入ECL溶液，充分反應后曝光，曝光后的膠片進行試劑顯影和定影。將定影后的膠片進行掃描存檔，并用PhotoShop整理去色，隨后采用AlphaEaseFC軟件分析系統(tǒng)進行灰度值分析，分析各目標蛋白的灰度值，即表示蛋白表達量。

1.3 ?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行分析。先進行正態(tài)性分布及方差齊性檢驗：若滿足正態(tài)性和方差齊性，則采用單因素方差分析;多重比較采用LSD法;若不符合正態(tài)分布或方差齊性，則采用秩和檢驗;計量資料以“x±s”表示。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ?眼壓檢測結果

8只（16眼）C57BL/6J小鼠在第10周至第38周眼壓一直波動在10～16 mmHg。48只（96眼）DBA/2J小鼠在第10周到第22周之間逐漸上升，到了第26周及以后，眼壓明顯上升。DBA/2J小鼠與C57BL/6J小鼠第10周到第38周不同時相點眼壓比較，見表1。

組內不同時點眼壓比較：由于C57BL/6J和DBA/2J組的各個時間點不符合正態(tài)分布，同一個小鼠重復測量8次，故用多個相關樣本的非參數(shù)Friedman檢驗。C57BL/6J組內不同時相點的眼壓比較差異均無統(tǒng)計學意義（？字2=8.676，P=0.282），說明C57BL/6J小鼠在第10周到第38周內眼壓是沒有顯著差異;DBA/2J組內不同時點眼壓比較差異有統(tǒng)計學意義（？字2=658.919，P=0.000），說明DBA/2J小鼠在第10周到第38周內眼壓是有顯著差異，眼壓隨著時間的增長而增加。

同一時間點不同組眼壓比較，經檢驗不符合正態(tài)分布，故用兩個獨立樣本非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗，從第14周開始，兩組小鼠的眼壓就開始差異有統(tǒng)計學意義（z=-2.495，P=0.011），之后的差異更加明顯（P<0.01），DBA/2J組從第14周開始明顯是高于C57BL/6J組。

2.2 ?眼前節(jié)檢查

眼前段裂隙燈檢查發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J小鼠從第10周到第38周之間，眼前段未見明顯異常，角膜透明，虹膜紋理清晰，瞳孔居中而圓，晶狀體透明，對復方托吡卡胺滴眼液反應靈敏，見圖1-2。

DBA/2J小鼠在第10周齡時即被發(fā)現(xiàn)有角膜鈣化斑，見圖3;隨著周齡延長角膜鈣化斑逐漸加重，到第18周齡時大多數(shù)DBA/2J小鼠出現(xiàn)明顯的角膜鈣化斑密集成片，見圖4;到第30周齡左右DBA/2J小鼠虹膜色素脫失播散，局部出現(xiàn)虹膜透照，虹膜基質萎縮，瞳孔后粘連，到第38周齡時虹膜色素脫失加重，瞳孔移位，部分并發(fā)白內障，見圖5。

2.3 ?Western blot檢測各組視網膜RhoA、ROCK和Caspase-3蛋白相對表達量

通過Western blot檢測各組視網膜RhoA、ROCK和Caspase-3蛋白相對表達量，發(fā)現(xiàn)各組蛋白數(shù)據均符合正態(tài)分布，方差齊同，經過單因素方差分析檢驗，各組RhoA、ROCK和Caspase-3蛋白相對表達差異具有統(tǒng)計學意義（F=16.507，P=0.000;F=36.241，P=0.000;F=15.068，P=0.000）。

各組RhoA、ROCK、Caspase-3兩兩比較：與空白組比較，模型組視網膜RhoA、ROCK、Caspase-3表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明青光眼視神經損害的發(fā)生發(fā)展中Rho/ROCK信號通路激活;與模型組比較，益脈康分散片組、青光安II號方湯劑組、青光安II號方有效組分低、中、高劑量組RhoA、ROCK、Caspase-3表達量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明益脈康分散片、青光安II號方及其不同濃度有效組分皆可通過抑制Rho/ROCK信號通路抑制視網膜神經節(jié)細胞的凋亡，減緩青光眼視神經損害;與益脈康分散片組比較，青光安II號方湯劑組、青光安II號方有效組分低、中濃度組RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白相對表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與益脈康分散片組和青光安II號方湯劑組比較，青光安II號方有效組分高劑量組RhoA、ROCK、Caspase-3表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2、圖6。

3 討論

青光眼的視神經保護對保存患者視力、減緩視功能損失具有重要意義。目前，常用的視神經保護藥物有鈣離子通道阻滯劑、抗氧化劑、抑制谷氨酸興奮性毒性藥物、神經營養(yǎng)因子等[12-13]，但治療效果大都不令人滿意，或者有不良反應產生，擁有豐富天然藥物資源的中醫(yī)藥在青光眼視神經保護領域擁有廣闊的前景，具有創(chuàng)新藥物的潛力。

青光眼相當于中醫(yī)的五風內障?！睹貍餮劭讫埬菊摼硪弧の屣L變內障》曰：“此眼初患之時，亦是臟腑虛勞，肝風為本?！鼻捌诨A和臨床研究中發(fā)現(xiàn)青光眼中晚期視神經病變患者肝腎虧虛與血瘀水停同存[2，14-22]，肝腎精血虧虛，則水血互累，血瘀水停，脈絡瘀滯，故青光眼晚期視神經病變基本病機總結為氣陰虧虛、脈絡瘀滯。根據青光眼視神經損傷的中醫(yī)發(fā)病機制，對青光安顆粒劑的組方進行優(yōu)化，研發(fā)出以滋補肝腎、益氣活血為治法的青光安Ⅱ號方[2]。青光安Ⅱ號方由枸杞、女貞子、燈盞花、黃芪等藥組成。本方重用枸杞、女貞子，取其滋補肝腎、益精明目之功;另加黃芪補氣健脾，生精養(yǎng)血，補益機體正氣，扶正以驅邪外出，寓有“正氣存內，邪不可干”之意，并能利水;燈盞細辛活血。全方補益扶正與活血利水驅邪同存，補通兼施，使目竅通暢，氣血調和。青光安II號方前期實驗研究表明：青光安II號方可抑制RGCs的凋亡，提高RGCs的存活率，起到保護視神經的作用[2];體外細胞學實驗表明，青光安II號方能夠很好地保護視網膜組織，維持視網膜神經節(jié)細胞的形態(tài)結構正常并減少其凋亡[20-22]。

近來多項研究表明，Rho/ROCK信號通路在降低眼壓、保護RGCs及改善眼部血流量方面為青光眼治療顯示了良好的前景。Rho/ROCK信號通路是中樞神經系統(tǒng)內的重要信號傳導系統(tǒng)，廣泛參與細胞生長、分化和細胞凋亡等一系列生物學過程。Rho/ROCK信號通路在青光眼的發(fā)病機制中的作用主要體現(xiàn)在視神經損傷后，Rho/ROCK信號通路的下游分子Crmp2在視神經上表達，視網膜及視神經上RhoA和ROCK蛋白相對表達量上調，凋亡相關蛋白Caspase-3表達逐漸升高[5-6]，出現(xiàn)視網膜、視神經的形態(tài)學明顯改變，如視神經軸突腫脹、軸突數(shù)目減少，髓鞘松解變性，板層結構分離，神經間質基質密度降低等[23-25];同時Rho激活下游的關鍵靶效應分子ROCK引起軸突生長錐塌陷，抑制軸突生長;也可作用于細胞骨架蛋白，進而抑制軸突末端生長錐的延伸及神經節(jié)再生。研究表明阻斷Rho/ROCK信號通路可抑制RGCs的凋亡，提高RGCs的存活率，從而起到保護神經的作用[7，26-27]。

本實驗以Rho/ROCK信號通路為切入點，通過檢測Rho/ROCK信號通路中的RhoA及其下游蛋白ROCK、凋亡相關蛋白Caspase-3，觀察青光安II號方有效組分對青光眼視神經損害小鼠模型視網膜RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白的相對表達量的影響，探析青光眼II號方及其有效組分基于Rho/ROCK信號通路的對青光眼實驗動物模型視網膜的保護作用。

本實驗采用了DBA/2J小鼠作為青光眼實驗動物模型。DBA/2J小鼠自發(fā)性青光眼模型是近年來基于轉基因技術的應用最為廣泛的年齡相關性、進展性自發(fā)性高眼壓實驗動物模型。DBA/2J小鼠第8～9月齡開始出現(xiàn)視網膜神經節(jié)細胞凋亡和視神經的變性，到第18月齡時，90%以上的視神經嚴重變性，視功能幾乎全部喪失。DBA/2J小鼠視網膜神經節(jié)細胞凋亡率最大可以達到90%以上[28]，是作為青光眼模型的良好造模實驗動物，在探討壓力相關性視神經節(jié)細胞凋亡、視神經變性機制和評估視神經保護藥物療效等方面應用廣泛。本實驗動態(tài)觀察DBA/2J小鼠與空白組C57BL/6J小鼠眼壓、眼前節(jié)變化，第14周開始DBA/2J小鼠眼壓與C57BL/6J小鼠眼壓組間比較具有差異性，且第38周齡時DBA/2J小鼠眼壓較前明顯升高，裂隙燈下可見角膜鈣化斑、虹膜色素脫失、瞳孔移位、部分并發(fā)白內障，表明DBA/2J小鼠青光眼實驗動物模型造模成功。

本研究發(fā)現(xiàn)青光眼動物模型DBA/2J小鼠視網膜RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白表達升高，益脈康分散片、青光安II號方湯劑及青光安II號方有效組分低、中、高劑量均可以降低DBA/2J小鼠視網膜RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白的表達，抑制其活性，其中青光安II號方有效組分高劑量組降低視網膜RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白的效果更為明顯。實驗研究表明在青光眼視神經損害的發(fā)生發(fā)展中Rho/ROCK信號通路激活，益脈康分散片、青光安II號方及其不同濃度有效組分皆可抑制DBA/2J小鼠視網膜RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白的表達，推測青光安II號方治療青光眼的機制可能與其抑制Rho/ROCK信號通路及視網膜細胞凋亡相關蛋白表達有關。

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