影響酵母除磷的相關(guān)因素分析及優(yōu)化研究

陳思華　梁順智　郭海芬　黃美靜　柯德森

摘要：以一種耐高糖高活性干酵母為研究對象，采用鉬酸銨分光光度法對其在不同碳源及是否破碎細胞壁等多種條件下培養(yǎng)的除磷率進行分析。對酵母進行固定化，并對固定化酵母的除磷率變化，以及固定化酵母的可重復(fù)使用性能進行分析。結(jié)果表明：在一定時間內(nèi)，酵母菌破碎細胞壁后的除磷率顯著增大;沒有碳源時酵母菌除磷率最低，果糖為碳源時除磷效果比蔗糖和葡萄糖為碳源時的好，差異達到顯著水平;酵母菌固定化之后的除磷率顯著高于不固定化時的;重復(fù)使用對固定化酵母菌除磷效果具有顯著影響。研究結(jié)果可為酵母菌應(yīng)用于污水中磷的處理和控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：酵母;除磷;固定化;碳源;破壁

中圖分類號：X131 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-672X（2020）06-0-03

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2020.06.072

Study on analysis and optimization of factors affecting phosphorus removal in yeast

Chen Sihua，Liang Shunzhi，Guo Haifen，Huang Meijing，Ke Desen

（School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou Guangdong 510006，China）

Abstract：A high-sugar-resistant and highly active dry yeast was studied by ammonium molybdate spectrophotometry to analyze its phosphorus removal rate with different carbon sources and cell wall broken. Then immobilized the yeast and analyzed the rate and reusable performance. The results showed that the dephosphorization rate of yeast after breaking cell wall increased significantly in a certain period of time; it was the lowest when there was no carbon source， and the dephosphorization effect of fructose as carbon source was better than that of sucrose and glucose as carbon source. The rate after immobilization was higher than that without immobilization， and the effect of repeated use on phosphorus removal of immobilized yeast was significant. The results can provide the basis for the application of yeast to the treatment and control of phosphorus in sewage.

Key Words：Yeast;Phosphorus removal;Immobilization;Carbon source;Cell wall broken

水是人類賴以生存與經(jīng)濟社會發(fā)展不可替代的基礎(chǔ)性資源[1]。而目前我國水體富營養(yǎng)化情況日益嚴(yán)重，湖泊污染問題尤為突出[2]?？偭椎葼I養(yǎng)鹽超標(biāo)是水體富營養(yǎng)化最直觀的表現(xiàn)[3]。磷過量輸入可使湖庫浮游藻類異常增殖，水體溶解氧和透明度顯著降低，衍生的藻毒素、嗅味物質(zhì)等會對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害[4]。因此，對水體中的磷含量進行控制十分必要。磷在廢水中的形式可分為無機磷和有機磷，聚磷酸鹽或有機磷最后都會部分或全部轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽，因此，在廢水除磷過程中主要關(guān)注正磷酸鹽[5]。目前最常用的除磷方法是化學(xué)沉淀法和生物法[6]。在生物法中，除磷微生物常為聚磷菌（PAOs）和反硝化除磷菌（DPB）[7-10]。而酵母菌既具有單細胞生長快、能形成很好的絮體適應(yīng)于各種不同的反應(yīng)器等特點，又具有真菌細胞大、代謝旺盛、耐酸、耐高滲透壓、耐高濃度的有機底物等特性[11]。近年來出現(xiàn)了對酵母菌在除磷方面的研究，如渡部貴志[12]研究可大量吸收磷的酵母菌，其吸收磷的情況受PHO機制所控制;王琰[5]篩選出高效除磷酵母菌BZ，并考察了溫度、碳源種類、pH、碳磷比、溶解氧、微量元素對BZ除磷效能的影響。但目前對酵母菌除磷方面的研究仍然較少。本研究旨在以常規(guī)的酵母菌為模式生物，對酵母菌在不同處理下的水體脫磷效果上進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

耐高糖高活性干酵母（購買自安琪酵母股份有限公司）;葡萄糖;蔗糖;果糖;50 g/L三氯乙酸溶液;3 mol/L硫酸和25 g/L鉬酸銨等體積混合液;0.01 mol/Lα-1，2，4-氨基萘酚磺酸鈉溶液;0.59 mol/L磷酸鹽緩沖液;0.05 mol/L氯化鈣溶液;70 g/L海藻酸鈉溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同條件實驗設(shè)計

對酵母菌設(shè)計4個處理：①破壁（重復(fù)6次）與不破壁（重復(fù)2次）;②使用不同碳源：葡萄糖（重復(fù)6次），蔗糖（重復(fù)6次），果糖（重復(fù)4次）與無碳源（重復(fù)2次）;③固定化（重復(fù)4次）與不固定化（重復(fù)2次）;④固定化重復(fù)使用0、1、2、3次（均重復(fù)3次）。以等體積相同濃度的磷酸鹽溶液和等質(zhì)量的酵母菌和碳源混合（m酵母菌：m碳源=3：2）。

1.2.2 無機磷的測定

每隔一定時間取樣，采用鉬酸銨分光光度法測其660 nm處的分光光度值，計算磷的含量，結(jié)果表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。前3個處理以0～60 min磷含量下降的速率表示除磷效率，第4個處理以0～18 min磷含量下降的速率表示除磷效率。

1.2.3 酵母菌固定方法

采用海藻酸鈣包埋法對酵母菌進行固定[13]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以各平行實驗的平均值表示實驗結(jié)果，以單因素方差分析判斷實驗組之間的差異顯著程度。

2 結(jié)果

2.1 破碎細胞壁對酵母菌除磷效果的影響

將酵母菌破壁，與不破壁的酵母菌在同樣條件下進行除磷對比，結(jié)果可見：不破碎細胞壁時除磷率為13.26±5.04%，破碎細胞壁時為28.64±2.67%，如圖1所示。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，得P<0.01，說明破碎細胞壁與否對酵母菌除磷效果具有極顯著性差異。在其他條件相同且適宜的情況下，破碎細胞壁更有利于酵母菌在一定時間內(nèi)的除磷。

2.2 不同碳源對酵母菌除磷效果的影響

將酵母菌于其他條件相同的情況下，在不同碳源中進行除磷實驗，分析重復(fù)得到的除磷率平均值，結(jié)果可見：果糖為42.40±14.43%，葡萄糖為28.64±2.67%，蔗糖為30.90±4.20%，無碳源供給時為12.48±1.54%，如圖2所示。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，得P<0.01，說明碳源種類不同對酵母菌除磷效果具有極顯著性差異。LSD分析可知，果糖為碳源時除磷率顯著大于蔗糖、葡萄糖和無碳源時的，無碳源條件下酵母菌除磷率最低。

2.3 固定化對酵母菌除磷效果的影響

將酵母菌進行固定化，與未固定化的酵母菌在同一條件下進行除磷實驗，分析重復(fù)得到的除磷率平均值，從結(jié)果可見：未固定化時為13.26±5.04%，固定化時為29.86±4.50%，如圖3所示。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，得P<0.05，說明對酵母菌進行固定化處理更有利于酵母菌在一定時間內(nèi)的除磷，其差異達到顯著性。

2.4 固定化酵母菌的重復(fù)多次除磷效果分析

將酵母菌進行固定化，進行連續(xù)三次重復(fù)除磷實驗。分析3次重復(fù)得到的除磷率平均值，從結(jié)果可見：固定化酵母菌第一次使用時除磷效率為20.22±4.19%，重復(fù)使用1、2、3次的除磷效率分別為11.79±6.70%、5.62±4.12%和6.58±5.79%，如圖4所示。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，得P<0.05，說明重復(fù)使用對固定化酵母菌除磷效果具有顯著性影響。觀察固定化酵母菌的外觀，第一次使用時海藻酸鈣凝膠球小，隨著重復(fù)使用次數(shù)增加，凝膠球變大，在重復(fù)使用2次時開始破裂。

3 討論與結(jié)論

由圖1可見，破碎細胞壁更有利于酵母菌在一定時間內(nèi)的除磷。王琰[5]研究發(fā)現(xiàn)，液相中磷是通過胞外聚合物（EPS）的吸附作用和酵母菌細胞對磷的吸收和轉(zhuǎn)化作用去除的，酵母菌BZ除磷系統(tǒng)中最主要的磷去除途徑是細胞對磷的吸收和轉(zhuǎn)化作用。酵母菌之所以能除磷，和細胞中含有能將無機磷轉(zhuǎn)化為磷酸酯等有機磷的酶密切相關(guān)，如3-磷酸甘油醛脫氫酶。破壁后細胞表面通透性增加[14]，無機磷無須通過細胞壁，更易于被細胞吸收;且細胞結(jié)構(gòu)很有可能遭到破壞，胞內(nèi)酶釋放到液相中，直接催化無機磷的轉(zhuǎn)化，因此在相同時間內(nèi)破除細胞壁后酵母菌除磷率提高。

在圖2中，無碳源提供時酵母菌除磷率最低。一方面，糖原是酵母菌除磷系統(tǒng)中主要的儲能物質(zhì)，葡萄糖先消耗ATP被磷酸化，然后合成糖原[5]。因此，液相中無葡萄糖等單糖或二糖提供時，酵母菌體內(nèi)對磷酸的需求量減少，除磷率下降;此外，酵母菌的生命活動，如對磷的吸收和轉(zhuǎn)化作用，需要外界提供能源，碳源在此是唯一的能源，沒有能源提供時，酵母菌難以對無機磷進行吸收和轉(zhuǎn)化，因此無碳源提供時除磷率最低。果糖為碳源時除磷率在其中顯著最大的原因尚未清楚，有待進一步的探究。而蔗糖和葡萄糖為碳源時除磷率顯著小于果糖為碳源時，可能是由于酵母菌中存在非?；钴S的轉(zhuǎn)化酶，當(dāng)蔗糖為碳源時，可迅速將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖[15]。

在圖3中，對酵母菌進行固定化處理時除磷率顯著大于未固定化時的。一方面，海藻酸鈣對無機磷有一定的吸附作用[16];另一方面，將酵母菌固定化則導(dǎo)致酵母菌集中，在特定區(qū)域的濃度更高，催化無機磷轉(zhuǎn)化的酶的濃度也因此更高，所以對無機磷的吸收也更快。

重復(fù)使用次數(shù)對固定化酵母菌除磷效果具有顯著性差異，固定化酵母菌第一次使用時的除磷率顯著大于重復(fù)使用第2、3次時的，這與海藻酸鈣凝膠球的大小和破裂情況密切相關(guān)。采用海藻酸鈣包埋法對酵母菌進行固定，營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣不易傳遞到凝膠珠內(nèi)部，這樣包埋于海藻膠粒中的生長細胞，存在于膠粒表面區(qū)域的易于優(yōu)先繁殖，導(dǎo)致傳質(zhì)阻力的增加和膠粒破裂引起細胞泄漏[16]。且酵母菌在膠粒中正常發(fā)酵并產(chǎn)生氣體，隨著酵母菌的繁殖產(chǎn)生的氣體也隨之增加，由于膠?？臻g相對小、孔徑有限，無法使氣體及時釋放，一定程度上也造成膠粒的破裂。膠粒中酵母菌濃度減小，對無機磷的吸附作用也下降，故而除磷率降低。這暴露了海藻酸鈣包埋法的一些缺點，在今后的研究中可采取一些改良的方法以提高重復(fù)使用的固定化酵母菌的除磷效果，如史沫男的海藻酸鈉-鐵凝膠球[17]，牛曼的殼聚糖-海藻酸鈉凝膠球[18]。

本研究對購買自安琪酵母股份有限公司的耐高糖高活性干酵母進行破碎細胞壁、在三種不同碳源及無碳源的情況下培養(yǎng)、固定化、固定化重復(fù)使用的四種處理時的除磷效果方面進行了研究。酵母菌破碎細胞壁后的除磷率顯著大于不破碎細胞壁時的;不提供碳源時酵母菌除磷率最低，果糖為碳源時除磷效果顯著比蔗糖和葡萄糖時的好;酵母菌固定化之后的除磷率顯著高于不固定化時的;重復(fù)使用次數(shù)對固定化酵母菌除磷效果具有顯著性差異。對于酵母菌在不同處理下的除磷效果上的研究可為酵母菌應(yīng)用于污水中磷的處理和控制提供參考。

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收稿日期：2020-03-30

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313531）;廣州大學(xué)省級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（基于固定化酶技術(shù)的水體脫磷工藝研究，S201911078065）。

作者簡介：陳思華（1999-），女，漢族，本科生，研究方向為生物科學(xué)。

通訊作者：柯德森（1966-），男，漢族，博士，教授，研究方向為氧代謝和抗氧化。