蝦肝腸胞蟲病的研究進展

姜宏波，陳裕文，陳啟軍

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110161）

1 肝腸胞蟲的發(fā)現(xiàn)和生物學(xué)特征

早在2001年，HUDSON等[1]通過透射電鏡在日本囊對蝦(Penaeus japonicus)的肝胰腺上皮細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種微孢子蟲，形態(tài)學(xué)上觀察與當(dāng)時已知的微孢子蟲均不一致，但是只介紹了形態(tài)特征并沒有進行深入研究，后期通過臨床癥狀和電鏡圖片比對推測這種微孢子蟲為蝦肝腸胞蟲 (Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)。2004年，研究者在泰國生長緩慢的斑節(jié)對蝦(P.monodon)肝胰腺小管上皮細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種未知微孢子蟲[2]，雖未命名但后期證實為EHP。直到2009年，TOURTIP等[3]才通過組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和分子技術(shù)等分析手段首次對EHP進行了命名。最終將其分類于真菌界、微孢子蟲門、單倍期綱、壺孢目、腸胞蟲科、腸胞蟲屬。同其他微孢子蟲相似，EHP也屬于嚴(yán)格細胞內(nèi)寄生。成熟的孢子呈卵圓形，大小為0.7μm×1.1μm。EHP基本結(jié)構(gòu)由胞壁、錨定盤、孢原質(zhì)、5～6圈極絲、1個細胞核、極膜層、多個核糖體、1個后液泡等組成[3]。胞壁由3層結(jié)構(gòu)組成，從外到內(nèi)分別是高電子密度外壁(2nm)，由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)組成的低電子密度的內(nèi)壁(10nm)和原生質(zhì)膜。孢子內(nèi)具有獨特的侵染裝置——極管(直徑在0.1～0.2μm)，與孢子頂端的錨定盤相連接(圖 1)[4]。

圖1 微孢子蟲的模式圖Figure 1 Ultrastructure of microsporidian spore

2 流行情況

自2013年以來，我國各地養(yǎng)殖的凡納濱對蝦先后出現(xiàn)EHP感染，感染率居高不下。陳祿芝等[5]對粵西地區(qū)凡納濱對蝦進行檢測發(fā)現(xiàn)，EHP的陽性檢出率為41.38%，在檢測樣品中，成蝦的EHP檢出率最高達93.75%。2015年浙江省舟山市大棚養(yǎng)殖的凡納濱對蝦270份病蝦樣本中，EHP檢出率高達85.19%[6]。2015年，王博雅等[7]在遼寧省營口市和盤錦市的對蝦中EHP檢出率達34.60%，在小蝦樣本中檢出的陽性率高達100%，而大蝦樣本中均未檢出。許杰等[8]在2015～2017年在天津市養(yǎng)殖凡納濱對蝦中均檢測出EHP，2015年陽性檢出率達57.33%，2016年陽性率高達70.19%。2019年，江蘇泥塘蝦的EHP患病率(79.5%)遠高于大棚養(yǎng)殖(56.3%)。此外，值得注意的是大棚正常養(yǎng)殖的蝦體中EHP的流行率(10.6%)遠低于泥塘正常養(yǎng)殖的蝦體(72.4%)[9]。2017年，國家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系開展的被動監(jiān)測結(jié)果顯示，EHP已在我國蝦類主要養(yǎng)殖區(qū)廣泛分布，在山東、河北、江蘇、上海、浙江、福建、廣東、海南和新疆均有不同水平的檢出。除我國外，泰國、印度、文萊、越南、委內(nèi)瑞拉、印度尼西亞和馬來西亞等國均有EHP檢出[10]。在印度東海岸西孟加拉邦的對蝦人工養(yǎng)殖中發(fā)病率高達84.9%，比在印度其他養(yǎng)殖區(qū)域檢出率高21.4%。

3 感染宿主和傳播途徑

EHP宿主廣泛，不僅僅感染凡納濱對蝦，目前已知感染的其他蝦類宿主有斑節(jié)對蝦、日本囊對蝦、羅氏沼蝦、南美藍對蝦(P.stylirostris)。除了蝦之外，在魷魚、沙蠶、商品化冷凍橈足類、商品化鹵蟲卵、商品化鹵蟲幼體、冰凍成體鹵蟲均檢測出可以攜帶EHP[11-12]。在EHP傳播試驗中表明，攜帶EHP的水體和投喂患病蝦的方式均可以使健康蝦感染[13]，也可以通過攝食攜帶EHP的鮮活餌料、病死蝦或環(huán)境中的孢子體進行水平傳播，不需要中間宿主就可以在對蝦中傳播，在幼蝦中也同樣如此[14-16]。通過垂直傳播試驗取樣，經(jīng)PCR方法和組織病理學(xué)切片技術(shù)手段證明了親本蝦可以向子代進行垂直傳播[17]。2017年，在伊朗西南部外來鳥814份糞便中，檢測出319個樣本呈現(xiàn)陽性，陽性比率達39.1%[18]。檢測出微孢子蟲主要包括比氏腸炎微孢子蟲和兔腦炎微孢子蟲屬。這兩種微孢子蟲均屬于人畜共患孢子蟲，推測攜帶有微孢子蟲的鳥類可能是該病的重要傳染源之一，EHP能否通過鳥作為載體尚需進一步研究。但由于EHP的宿主廣泛，傳播過程中不需要中間宿主，即可通過水體又可以通過攝食進行傳播，加大了EHP的預(yù)防難度。

4 主要危害

印度作為第二大對蝦生產(chǎn)國，由于EHP在蝦體中普遍檢出，有報道稱2014～2015年對蝦的年產(chǎn)量減少10%～20%，損失達數(shù)千萬美元[19]。研究表明，感染EHP后的對蝦死亡率與正常蝦沒有顯著差別，但感染后的蝦生長緩慢，出現(xiàn)攝食減少或者攝食后生長緩慢的現(xiàn)象，成為危害我國對蝦產(chǎn)業(yè)的主要原因之一。2017年河北省對蝦養(yǎng)殖病害調(diào)查報告表明[20]，蝦EHP陽性群體個體大小不均勻，小個體重量只有大個體蝦的十分之一?；加懈文c胞蟲病的蝦死亡率不高，但產(chǎn)量減產(chǎn)30%。劉雅梅等[21]發(fā)現(xiàn)EHP陽性群體體重偏差率是EHP陰性群體的2.34～3.45倍，體長相同時EHP陽性的體重波動變大。在越南，感染EHP的凡納濱對蝦后期幼體投入池塘后，在最初的25d內(nèi)，對蝦的生長速度保持在平均水平。但是隨著時間推移，對蝦的進食量減少50%～70%，肝胰腺變色，體積的生長只有未感染EHP蝦的10%～40%[22]。SANTHOSHKUMAR等[23]發(fā)現(xiàn)在特定的年齡，患病蝦的大小幾乎是未感染的蝦的一半。在120d時，正常蝦的體重約為20～23g，而在同期EHP感染蝦的體重約為8～13g。實驗室內(nèi)研究同樣發(fā)現(xiàn)，EHP感染的小蝦在30d后體重沒有增加，而正常蝦的體重在30d的試驗期間增加2g。除降低生長性能外，感染EHP的蝦可能引起免疫機能下降，機體更容易被細菌、病毒等微生物入侵，引起交叉感染。TANG等[24]在感染EHP的凡納濱對蝦的糞便中檢出了桿狀細菌。BIJU等[25]發(fā)現(xiàn)，在感染EHP的斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦中伴隨著細菌合并感染。ARANGUREN等[26]發(fā)現(xiàn)，EHP是導(dǎo)致凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死（AHPND）和敗血性肝胰腺壞死（SHPN）的一個風(fēng)險因素。感染EHP后引成的生長緩慢等癥狀勢必會影響到經(jīng)濟效益。2018年，RAVEENDRA[27]在統(tǒng)計印度養(yǎng)蝦池塘效益時發(fā)現(xiàn)，感染EHP的凡納濱對蝦的平均體重、每日增長量、總產(chǎn)量均顯著低于健康池塘。感染EHP的池塘可造成每池?fù)p失3.6～4.3萬盧比（折合人民幣約3500～4200元）。

圖2 微孢子蟲生活周期示意圖[28]Figure 2 The life cycle of microsporidian

5 生活史和入侵機制

微孢子蟲生活史大致分為3個部分[28]：（1）感染期。環(huán)境中的成熟孢子彈出極管，像“注射器”一樣刺入宿主細胞的細胞質(zhì)。孢原質(zhì)通過彈出的極管管腔釋放，極管先端形成芽體，芽體進入宿主細胞內(nèi)。（2）裂殖增殖期。芽體在侵入宿主細胞內(nèi)后的幾小時內(nèi)，保持最初的圓形，大小則逐漸增大，隨后芽體以二分裂或多分裂逐漸增大發(fā)育為裂殖體，然后變異為母孢子，此過程反復(fù)進行，母孢子數(shù)量增加，從而進入孢子增殖期。（3）孢子增殖期。母孢子以二分裂方式形成孢子母細胞，并由孢子母細胞發(fā)育為成熟的孢子，標(biāo)志著一個生活史的完成(圖2)。TOURTIP等[3]利用透射電鏡觀察到EHP在裂殖體階段的核分裂，同時也看到了多孢子的增殖形態(tài)，但未觀察到早期裂殖子時期以及感染期等階段。因此，關(guān)于EHP的生活史仍然需要繼續(xù)開展深入的研究工作。

關(guān)于微孢子蟲的入侵機理主要有兩個假說：一是微孢子蟲在一定外界環(huán)境的刺激下 (可能是溫度、Ca2+濃度、水壓變化等，具體的條件尚未清楚)，彈射出極管通過機械力刺破宿主細胞膜，然后將具有侵染性的孢原質(zhì)通過極管注入到宿主細胞質(zhì)內(nèi)部；二是極管彈出其頂端并未刺破宿主細胞膜，而是極管在細胞膜表面形成凹陷，然后將孢子的孢原質(zhì)注入到該凹陷結(jié)構(gòu)內(nèi)部，隨后內(nèi)陷結(jié)構(gòu)從細胞表面向內(nèi)脫落形成侵染泡，從而侵染宿主[29]。EHP的入侵途徑到底是哪種方式尚不清楚。JAROENLAK等[30]鑒定并描述EHP的第一個孢子壁蛋白(EhSWP1)。通過體外結(jié)合試驗、競爭試驗和誘變研究等表明EhSWP1是一種肝素結(jié)合蛋白，能夠與細胞表面肝素結(jié)合，肝素能夠被瘧原蟲和利什曼原蟲等胞內(nèi)寄生蟲識別，推測EHP主要通過肝素途徑入侵宿主。WANG等[31]在家蠶微孢子蟲的孢壁蛋白NbSWP16中，也預(yù)測到肝素結(jié)合位點。免疫電鏡定位顯示NbSWP16定位于孢子外壁，通過體外實驗阻斷NbSWP16后使得孢子粘附宿主細胞減少了20%以上。

程東遠等[32]通過原位雜交技術(shù)檢測了EHP在凡納濱對蝦不同組織間感染的差異性，結(jié)果在肝胰腺、中腸、血淋巴、鰓和肌肉中均出現(xiàn)陽性信號，但在肝胰腺和中腸內(nèi)容物的雜交信號強，而血淋巴、鰓和中腸上皮細胞雜交信號弱。SANTHOSHKUMAR等[23]對自然感染凡納濱對蝦的不同器官進行組織學(xué)和PCR檢測，檢測結(jié)果為肝胰腺最亮，鰓、血淋巴和心臟次之，腸道和肌肉也有條帶出現(xiàn)但較暗。推測主要寄生于肝胰腺上皮細胞，然后通過循環(huán)系統(tǒng)到達各個器官并逐漸積累，但仍需要進一步研究進行證實。

6 檢測方法

EHP個體微小，感染EHP的對蝦癥狀不明顯。因此，很難在現(xiàn)場確診。傳統(tǒng)的組織切片方法制作時間長，制作流程復(fù)雜，在肝腸胞蟲含量低的條件下不容易發(fā)現(xiàn)，不適合作為判斷是否感染發(fā)病的技術(shù)手段。相比之下，分子生物學(xué)方法具有快速、簡便和靈敏度高等特點，已成為實驗室檢測EHP的常規(guī)手段。目前常用的方法有普通PCR、巢式PCR、qRT-PCR、原位雜交、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)等方法。

6.1 PCR方法

由于組織切片方法檢測效率低，觀察困難，PCR方法已經(jīng)成為最常用的EHP檢測手段之一[33-37]。普通PCR針對肝腸胞蟲的特異性片段只進行一次擴增，目前針對EHP的檢測技術(shù)大多根據(jù)small subunit ribosomal RNA(SSU rRNA)序列設(shè)計引物進行檢測。但是在含有目的基因中混合Enterospora canceri和Hepatospora eriocheir兩種微孢子蟲時，會呈現(xiàn)假陽性的狀況，而且假陽性條帶的位置與目的條帶位置不易辨別，無法準(zhǔn)確判斷是否為EHP感染[33]。巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴增，增加了檢測的敏感性和特異性。JAROENLAK等[33]根據(jù)孢壁蛋白質(zhì)spore wall protein(SWP)序列設(shè)計引物，建立了巢式SWP-PCR檢測技術(shù)。SWP-PCR相比較SSU-PCR具有更好的準(zhǔn)確性。目前，全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站推薦檢測EHP病原也是巢式SWP-PCR檢測技術(shù)。此外，有學(xué)者以EHP的β-tubulin序列設(shè)計引物，建立巢式PCR也具有很好的敏感性和特異性[34]。

qRT-PCR是PCR反應(yīng)系統(tǒng)與熒光集團相結(jié)合，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR進程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析。劉珍等[35]研究發(fā)現(xiàn)蝦肝腸胞蟲SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的靈敏度要顯著高于常規(guī)PCR和巢式PCR。比較結(jié)果顯示，SYBR Green I熒光定量PCR至少比常規(guī)PCR定性檢測的靈敏度高1個數(shù)量級，是巢氏PCR靈敏度4倍。駱云慧等[36]建立TaqMan實時熒光定量PCR方法，該方法對EHP標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢測靈敏度為5.20×102copies·μL-1，比常規(guī)PCR高10倍。整個檢測反應(yīng)只需2h，提高了檢測效率和敏感性。此外，對白斑綜合征病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、高致病性副溶血弧菌、對蝦微孢子蟲感染的棉花蝦組織樣品等均沒有交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和可重復(fù)性，變異系數(shù)僅為0.94%～1.13%。張娜等[37]建立TaqMan熒光qPCR方法的檢測靈敏度較常規(guī)PCR方法至少高出1個數(shù)量級。宋增磊等[38]通過基于Taq-Man熒光qPCR的EHP檢測的并樣分析，國際標(biāo)準(zhǔn)中推薦的5∶1并樣檢測方式可以擴展到50∶1的檢測方式，可為群體中存在7%以上的感染率提供準(zhǔn)確性且低成本的檢測方案，其診斷特異性和診斷靈敏度與5∶1并樣檢測接近，縮短了檢測時間，節(jié)約了檢測成本。

6.2 原位雜交(in situ hybridization,ISH)

ISH技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、定位和相對定量檢測的優(yōu)勢，因此被經(jīng)常用于EHP的檢測。TANG等[22]利用ISH技術(shù)對凡納濱對蝦肝胰腺小管上皮細胞進行了檢測，發(fā)現(xiàn)了明顯的雜交信號。相比較組織學(xué)ISH對病原體的檢測更為敏感，組織學(xué)在細胞中未見明顯包涵體和EHP的孢子，而ISH呈現(xiàn)陽性。在含有白便的池塘中[23]，對20只蝦的肝胰腺進行了EHP ISH試驗，結(jié)果均呈陽性。探針對細胞質(zhì)內(nèi)嗜堿性包涵體反應(yīng)強烈，從ISH中析出的藍紫色沉淀物與H&E組織學(xué)觀察到的包裹體相一致。此外，檢測的肝胰腺樣品都患有敗血性肝胰腺壞死(SHPN)。原位雜交能夠直接顯示肝胰腺組織病灶的位置，感染患病越嚴(yán)重的區(qū)域，信號反饋也就越強烈。對于同一患病組織同時進行原位雜交檢測與H&E染色分析[16]，可以更好地估計EHP對組織侵染程度和定位，不足的是組織病理學(xué)是冗長而費時的過程。

6.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)

LAMP為新型核酸擴增方法，具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度和低成本等優(yōu)點，適用于生產(chǎn)中對蝦肝腸胞蟲的快速診斷。KARTHIKEYAN等[39]首次采用實時LAMP技術(shù)對蝦體內(nèi)EHP進行檢測和定量分析。實時LAMP技術(shù)可以檢測到10-3～10-1，實時PCR技術(shù)也可以檢測到10-3，巢式PCR顯示在10-2～10-0之間。孫妍等[40]比較LAMP法和常規(guī)PCR的靈敏度，LAMP法的檢出限為3.71個質(zhì)?？截悺う蘈-1，PCR方法的檢出限為371個質(zhì)?？截悺う蘈-1，靈敏度是普通PCR方法的100倍。LAMP方法可在1h內(nèi)得出檢測結(jié)果，反應(yīng)裝置要求不高且操作簡單。目前，科研工作者已開發(fā)出商品化試劑盒和儀器投入市場使用，非常適用基層和現(xiàn)場的EHP快速檢測。

表1 EHP檢測技術(shù)優(yōu)缺點比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of EHP detection technology

7 防治措施

EHP屬于胞內(nèi)寄生，目前沒有有效藥物進行治療。因此，在養(yǎng)殖過程中的預(yù)防顯得更為重要。養(yǎng)殖的環(huán)節(jié)眾多，每一個環(huán)節(jié)都可能引起EHP的感染，因此需要在養(yǎng)殖各個環(huán)節(jié)中多方面實施預(yù)防手段，進而減少EHP的感染。維持水體中的氨氮在一定濃度可以有效控制蝦體中EHP攜帶量[41]，但是并不能殺死EHP。研究表明，通過體外藥物作用和低溫等方式有效抑制EHP的極絲排放，如在-20℃冷凍2h，用15mg·L-1KMnO4處理15min，40mg·L-1的65%活性氯處理15min，20%乙醇作用15min均可100%抑制EHP極絲釋放[42]。KMnO4和活性氯可適用于農(nóng)業(yè)設(shè)備、管道、水箱、池塘等表面，乙醇可用于養(yǎng)殖場進出人員的消毒殺菌。但“失活的”肝腸胞蟲是否喪失侵染性，在環(huán)境條件改善后是否會重新侵染還需進一步研究證實。目前，尚未有研究表明有藥物可以殺滅蝦體內(nèi)的EHP。煙曲霉素對東方蜜蜂孢子蟲的具有良好的治療效果，但對EHP沒有治療效果[24]。PTASZYNSKA等[43]用蔗糖-卟啉類化合物混合的糖漿飼喂受感染的蜜蜂，與對照組的蜜蜂相比，孢子數(shù)量顯著減少。掃描電鏡下觀察試驗組蜜蜂中的EHP，EHP的孢壁表現(xiàn)出明顯的變形。因此，卟啉類藥物對微孢子蟲的作用機制可能是破壞其孢壁，孢壁失去了保護作用造成孢子死亡，這些藥物在防治EHP時是否有作用尚不清楚。將攜帶家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)的蠶卵進行高溫即時浸酸處理[44]，用real-time PCR對帶毒蠶卵進行定量檢測，經(jīng)對照組比較發(fā)現(xiàn)，高溫即時浸酸對家蠶微孢子蟲病有良好的防治作用。對于蝦卵可以嘗試采取類似措施，具體溫度和酸度及對應(yīng)蝦卵時間還需進一步試驗驗證是否具有顯著效果。RNA干擾技術(shù)在控制蜜蜂以色列急性麻痹病毒(IAPV)已嶄露頭角，RNA沉默機制已經(jīng)在蜜蜂微孢子蟲基因組中被發(fā)現(xiàn)[45-47]，這表明通過RNA干擾調(diào)控基因表達控制甚至殺滅微孢子蟲在防治方面具有潛在價值，值得開展深入研究。

8 展望

近些年，凡納濱對蝦肝腸胞蟲的感染率居高不下，造成對蝦生長緩慢，養(yǎng)殖戶經(jīng)濟效益顯著下降，已經(jīng)成為制約凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的最主要病害之一。但關(guān)于肝腸胞蟲仍有很多問題尚不清楚，這也阻礙了對肝腸胞蟲病的防治。因此，在接下來的研究工作中，明確EHP的傳播途徑和宿主范圍，做好預(yù)防措施，解析EHP的入侵機理，開發(fā)有效治療EHP的藥物，以及篩選抗EHP的對蝦優(yōu)良種質(zhì)是解決蝦肝腸胞蟲病的根本途徑。