北方地區(qū)3種蕨類孢子組培萌發(fā)率研究

孫曉梅 ，李 恒 ，孫戌男 ，劉雪婷 ，于立忠

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，沈陽110161；2.中國科學(xué)院 沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽110116；3.中國科學(xué)院 清原森林生態(tài)系統(tǒng)觀測研究站，遼寧 撫順113312）

蕨類植物也稱羊齒植物，是介于苔蘚植物和種子植物之間的一個獨具特色的高等植物類群，生活史為孢子體發(fā)達(dá)的異形世代交替[1]。其枝葉青翠、姿態(tài)奇特，在應(yīng)用于園林綠化、室內(nèi)觀賞的同時，還具有較高的食、藥用價值，在空氣、土壤和水體污染凈化與修復(fù)方面也具有特殊生態(tài)功能[2]。目前，全世界約有12000種蕨類植物，其中我國約有2600種[3]。面對如此豐富的蕨類資源，目前的開發(fā)利用明顯不到位，許多優(yōu)良的種類尚未得到有效利用[4]。尤其在北方地區(qū)，將野生蕨類植物運用于園林綠化之中以及盆栽觀賞并不多見，如遼寧省有記載的蕨類植物有100種左右，其中藥用蕨類植物有近40種[5]，而園林產(chǎn)業(yè)發(fā)展先進(jìn)的北京地區(qū)普遍應(yīng)用的蕨類植物僅有20世紀(jì)90年代開發(fā)的莢果蕨（Matteuccia struthiopteris）一種[6]。

孢子繁殖是蕨類植物自我繁衍和進(jìn)化的最主要途徑，也是蕨類植物進(jìn)行人工大規(guī)模培育及提高繁殖系數(shù)的最主要方法[7]。但是孢子萌發(fā)、原葉體形成、受精、孢子體形成與生長等受到諸多環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致自然界孢子萌發(fā)繁殖率低，成苗率極低[8]。與植物的自然繁殖方式相比，組培技術(shù)不僅能保持原有品種的優(yōu)良特性，而且還可以在短時間內(nèi)獲得大量的再生植株[9]，但蕨類植物孢子體的幼嫩部位通常包被鱗片，較難消毒，不宜作為外植體，而孢子十分適合作為外植體[29]。目前，越來越多的研究將孢子繁殖與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，在無菌環(huán)境下對蕨類孢子進(jìn)行培養(yǎng)，實現(xiàn)了多種蕨類植物的高效擴(kuò)繁。汪長水[10]對鳥巢蕨（Asplenium nidus）孢子進(jìn)行無菌培養(yǎng)，移栽成活率達(dá)到90%；徐艷等[11]探究了白玉鳳尾蕨（Pteris cretica）孢子的無菌培養(yǎng)，移栽成活率可達(dá)80%以上。本研究以北方地區(qū)3種蕨類植物掌葉鐵線蕨、粗莖鱗毛蕨、溪洞碗蕨孢子為材料，通過組織培養(yǎng)的方法，研究不同無機(jī)鹽濃度、不同種類激素和濃度、光照對孢子萌發(fā)的影響，以期探索不同蕨類植物孢子萌發(fā)的最適條件，為規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年8～9月，在位于遼寧省撫順市清原滿族自治縣大蘇河鄉(xiāng)長沙村的中國科學(xué)院清原森林生態(tài)系統(tǒng)觀測研究站采集掌葉鐵線蕨、粗莖鱗毛蕨、溪洞碗蕨的孢子，將孢子囊初見破裂的成熟孢子葉收集于信封中，待孢子自然脫落后常溫條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 不同濃度的赤霉素處理 將培養(yǎng)皿與濾紙置于高壓滅菌鍋中，121℃滅菌40min，將濾紙鋪在培養(yǎng)皿底部。取少量孢子接種于濾紙上，分別加入100，300，500mg·L-1（分別定義為：較低濃度、中等濃度、較高濃度）的赤霉素溶液培養(yǎng)，以潤濕濾紙并讓孢子均勻散布于濾紙上為準(zhǔn)，空白對照加入等量的無菌水培養(yǎng)，1個培養(yǎng)皿為1次重復(fù)，每個處理3次重復(fù)，置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25～27℃，光照時間14h·d-1，光照強度(1200±100)lx。于接種后3，6，9，12，15d觀察，每個培養(yǎng)皿取兩個不同位置的孢子液各一滴，混合后滴于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個視野，記錄孢子萌發(fā)率。

1.2.2 不同濃度的無機(jī)鹽、生長素、細(xì)胞分裂素處理 試驗釆用L9（34）正交設(shè)計，設(shè)置MS，1/2MS，1/4MS 3種無機(jī)鹽含量；0.1，0.5，1.0mg·L-13 種 NAA 生長素濃度，以及 0.1，0.5，1.0mg·L-13 種 6-BA 細(xì)胞分裂素濃度，共 9 種組合。均加入2%蔗糖、0.7%瓊脂，調(diào)節(jié)pH值至5.8。裝入三角瓶中高溫高壓滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻凝固備用。將掌葉鐵線蕨、粗莖鱗毛蕨孢子分別裝入2mL離心管中，加入2%NaClO水溶液，放入離心機(jī)中以10000r·min-1離心20min后，用無菌水沖洗5次，加無菌水稀釋到10mL離心管中，用血球計數(shù)板計數(shù)，控制溶液中的孢子密度為10000·mL-1。溪洞碗蕨孢子在上述滅菌條件未見萌發(fā)，故采用加入1%NaClO水溶液離心5min的方式滅菌，其余均與上述處理相同。用移液槍將孢子水溶液接種到三角瓶中，每瓶接種1mL，每個處理3次重復(fù)。20d后每個處理取1滴孢子液滴于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個視野，記錄孢子萌發(fā)率。

1.2.3 光照培養(yǎng)與暗培養(yǎng)處理 將3種蕨類孢子按1.2.2的滅菌方式處理，接種到1/2MS培養(yǎng)基中，均加入2%蔗糖、0.7%瓊脂，調(diào)節(jié)pH值至5.8。每瓶接種孢子水溶液1mL，一組直接放入培養(yǎng)室正常培養(yǎng)，光照強度為（1200±100）lx，一組放入不透光的封閉紙箱中暗培養(yǎng)，除光照外其他條件均相同，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)20d后用上述方法調(diào)查記錄孢子萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素處理對蕨類孢子萌發(fā)率的影響

2.1.1 赤霉素處理對掌葉鐵線蕨孢子萌發(fā)的影響 掌葉鐵線蕨孢子在5d時開始萌發(fā)，此時無菌水和較低濃度赤霉素（100mg·L-1）處理的萌發(fā)率分別達(dá)到53.67%和62.24%，而中等濃度與較高濃度顯著降低掌葉鐵線蕨孢子萌發(fā)率（p＜0.05）；隨萌發(fā)時間的增加，不同處理條件下掌葉鐵線蕨孢子萌發(fā)率逐漸增加，7～10d達(dá)到最大值（90.5%），15d時，掌葉鐵線蕨孢子萌發(fā)率略有下降，維持在 71.55%～83.57%（圖1）。

2.1.2 赤霉素處理對粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)的影響 粗莖鱗毛蕨孢子在5d時開始萌發(fā)，隨時間增加，萌發(fā)率逐漸提高。不同濃度赤霉素處理顯著抑制粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā) （p＜0.05），且隨著赤霉素濃度的增加，對粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)的抑制程度越強。較低濃度赤霉素處理（100mg·L-1）在5d和7d時顯著抑制粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)（67.07%～68.76%），而在10d和15d時，對粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)率的影響依然低于對照（p＞0.05）；中等濃度赤霉素處理（300mg·L-1）顯著降低粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)率（p＜0.05），其萌發(fā)率僅為10.99%～22.96%；而較高濃度赤霉素處理（500mg·L-1）則完全抑制粗莖鱗毛蕨孢子的萌發(fā)，導(dǎo)致其萌發(fā)率為零（圖2）。

2.1.3 赤霉素處理對溪洞碗蕨孢子萌發(fā)的影響 由圖3可知，溪洞碗蕨孢子在5d開始萌發(fā)，此后，隨時間增加，溪洞碗蕨孢子的萌發(fā)率逐漸增加。隨著赤霉素濃度的增加，溪洞碗蕨孢子萌發(fā)率顯著下降（p＜0.05），其中，較低濃度赤霉素處理（100mg·L-1）顯著提高5d和7d時溪洞碗蕨孢子萌發(fā)率（p＜0.05），但10d和15d時提高不顯著（p＞0.05）；中等濃度赤霉素處理（300mg·L-1）對溪洞碗蕨孢子萌發(fā)率影響不顯著（p＞0.05）；而較高濃度赤霉素處理（500mg·L-1）則顯著降低了溪洞碗蕨孢子萌發(fā)率（p＜0.05）。

圖1 不同濃度赤霉素處理下掌葉鐵線蕨孢子萌發(fā)情況Figure 1 Spore germination of A.pedatum under different concentrations of gibberellin

圖2 不同濃度赤霉素處理下粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)情況Figure 2 Spore germination of D.crassirhizoma under different concentrations of gibberellin

圖3 不同濃度赤霉素處理下溪洞碗蕨孢子萌發(fā)情況Figure 3 Spore germination of D.wilfordii under different concentrations of gibberellin

2.2 無機(jī)鹽、生長素、細(xì)胞分裂素濃度對蕨類孢子萌發(fā)率的影響

2.2.1 無機(jī)鹽、生長素、細(xì)胞分裂素濃度對掌葉鐵線蕨孢子萌發(fā)的影響 由表1可知，掌葉鐵線蕨孢子在MS+0.1mg·L-1NAA+0.1mg·L-16-BA（A1）培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，達(dá)到 57%。 在 1/2MS+0.5mg·L-1NAA+0.1mg·L-16-BA（B2）培養(yǎng)基中萌發(fā)率次之，達(dá)到39%。而在以1/4MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的4組處理中，最高萌發(fā)率僅為29.01%，顯著低于MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基（p＜0.05），表明隨著無機(jī)鹽含量的降低，掌葉鐵線蕨孢子的萌發(fā)率也呈現(xiàn)降低的趨勢，1/4MS培養(yǎng)基不利于掌葉鐵線蕨孢子萌發(fā)培養(yǎng)。掌葉鐵線蕨孢子最低萌發(fā)率出現(xiàn)在A2和B3組中，僅為9.25%和7.89%，這兩組中都含有1mg·L-16-BA。表明高濃度的6-BA對掌葉鐵線蕨孢子萌發(fā)起到抑制作用，不利于孢子萌發(fā)。試驗表明，在采用MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加較低濃度的NAA和6-BA溶液，最有利于掌葉鐵線蕨孢子的萌發(fā)。

2.2.2 無機(jī)鹽、生長素、細(xì)胞分裂素濃度對粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)的影響 由表1可知，粗莖鱗毛蕨孢子在MS+0.1mg·L-1NAA+0.1mg·L-16-BA（A1）培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，達(dá)到69.58%，在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基（A0）中次之，萌發(fā)率達(dá)69.16%，沒有顯著差異（p＞0.05）。在MS，1/2MS，1/4MS 3種無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基中，最高萌發(fā)率分別達(dá)到69.16%，59.09%，55.16%，萌發(fā)率均較高，表明培養(yǎng)基無機(jī)鹽含量對粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)率無顯著影響。試驗中最低萌發(fā)率出現(xiàn)在B3和C1組中，僅為15.78%和15.68%，這兩組同樣含有高濃度的6-BA，表明高濃度的6-BA對粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)起到抑制作用，與掌葉鐵線蕨萌發(fā)試驗結(jié)果相吻合。由于不添加任何激素的A0組與萌發(fā)率最高的A1組萌發(fā)率極其接近，因此，不添加任何激素的MS培養(yǎng)基即為粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。

2.2.3 無機(jī)鹽、生長素、細(xì)胞分裂素濃度對溪洞碗蕨孢子萌發(fā)的影響 由表1可知，溪洞碗蕨孢子在1/2MS+0.5mg·L-1NAA+0.1mg·L-16-BA（B2）培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，達(dá)到35.38%。其次是不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基（B0）中，萌發(fā)率達(dá)到 34.35%，兩組間沒有顯著差異（p＞0.05）。 在 1/4MS+0.1mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA（C1）培養(yǎng)基中萌發(fā)率最低，僅為9.89%。其余各組中，含有較高濃度的NAA以及6-BA的組合萌發(fā)情況大多不佳，溪洞碗蕨孢子萌發(fā)率介于12.39%～19.52%之間，表明較高濃度的生長素及細(xì)胞分裂素的使用不利于溪洞碗蕨孢子的萌發(fā)。由于不添加任何激素的B0組與萌發(fā)率最高的B2組萌發(fā)率極其接近，因此，不添加任何激素的1/2 MS培養(yǎng)基即為溪洞碗蕨孢子萌發(fā)培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。

表1 不同濃度無機(jī)鹽、生長素、細(xì)胞分裂素處理下3種蕨類孢子萌發(fā)率Table 1 Different concentrations of inorganic salt,auxin,and cytokinin treatment Germination rate of three fern spores

2.3 光照對蕨類孢子萌發(fā)的影響

將3種蕨類孢子分別放在培養(yǎng)室常規(guī)光照以及封閉紙箱暗培養(yǎng)20d后，在顯微鏡下觀察萌發(fā)情況。由圖4可知，常規(guī)光照培養(yǎng)的3種蕨類孢子均能正常萌發(fā)，而暗培養(yǎng)條件下的孢子只吸脹，萌發(fā)率均為零。說明光照是掌葉鐵線蕨、粗莖鱗毛蕨、溪洞碗蕨孢子萌發(fā)的必要條件。

3 討論與結(jié)論

圖4 3種蕨類植物孢子萌發(fā)Figure 4 Spore germination of three ferns

赤霉素可加速細(xì)胞的伸長，對細(xì)胞分裂也有促進(jìn)作用[12]。在組培時加入赤霉素，有助于促進(jìn)已分化的芽伸長生長。在對蕨類植物孢子組培試驗中，赤霉素對孢子萌發(fā)的影響因種類不同，而有所差異。研究發(fā)現(xiàn)赤霉素對烏蕨（Odontosoria chinensis）孢子萌發(fā)無顯著影響[13]，提高當(dāng)年采收的東北蕨菜（Pteridium aquilinum）孢子萌發(fā)的作用也不顯著，這與本研究的結(jié)果接近。但對于蕨菜孢子，赤霉素可以促進(jìn)上1年采集孢子萌發(fā)，并提高孢子萌發(fā)率[14]。赤霉素可顯著促進(jìn)華南毛蕨（Cyclosorus parasiticus）、烏毛蕨（Blechnum orientale）和蜈蚣蕨（Pteris vittata）的孢子萌發(fā)，而對線羽鳳尾蕨（P.arisanensis）影響不顯著，其原因可能是線羽鳳尾蕨孢子不具休眠特性[15]。由此推測，赤霉素可以促進(jìn)保存時間較長的孢子以及具有休眠特性的孢子萌發(fā)，但當(dāng)年采收的未休眠孢子由于其自身活性較強，赤霉素對提高孢子萌發(fā)率的影響較小。本試驗中，較低濃度赤霉素對當(dāng)年采收的掌葉鐵線蕨、粗莖鱗毛蕨、溪洞碗蕨孢子萌發(fā)率無顯著的提高。相反，較高濃度赤霉素處理對孢子萌發(fā)產(chǎn)生一定的抑制作用。在植物的離體培養(yǎng)過程中，適宜的無機(jī)鹽濃度是培養(yǎng)中的細(xì)胞所必需的[16]。不同蕨類植物的最適基本培養(yǎng)基有所不同[17]。在蕨菜孢子的萌發(fā)研究中，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基是蕨菜孢子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基[18]；在光葉蕨（C.chinensis）孢子萌發(fā)研究中，發(fā)現(xiàn)光葉蕨孢子在1/2MS培養(yǎng)基中的萌發(fā)率顯著高于MS和1/4MS培養(yǎng)基[19]。此外，一些蕨類在低濃度的無機(jī)鹽中萌發(fā)情況較好，有研究表明，高鹽濃度的培養(yǎng)基會抑制一些蕨類孢子萌發(fā)[30]。在對金毛狗脊（Cibotium barometz）的萌發(fā)試驗中，發(fā)現(xiàn)1/8MS為最佳萌發(fā)培養(yǎng)基[20]；桫欏（Alsophila spinulosa）的孢子在1/5MS培養(yǎng)基和1/8MS培養(yǎng)基中萌發(fā)效果較好[21]。也有研究表明，營養(yǎng)液成分通常只影響配子體的發(fā)育，而對孢子萌發(fā)的影響不大[31]，與本試驗結(jié)果大致相符。出現(xiàn)以上差異的原因，可能與不同品種的植物適應(yīng)生境不同有關(guān)。

本試驗中掌葉鐵線蕨在MS基本培養(yǎng)基中萌發(fā)情況最好，粗莖鱗毛蕨、溪洞碗蕨則對無機(jī)鹽濃度的變化并不敏感。然而，隨培養(yǎng)時間的延長，以1/4MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各處理原葉體均長勢不良、個體較小、顏色呈黃綠色；以MS和1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各處理原葉體長勢旺盛、顏色翠綠。這與對闊鱗鱗毛蕨（D.championii）孢子無菌培養(yǎng)試驗結(jié)果相吻合[22]。表明鹽含量過低的培養(yǎng)基雖不會影響某些種類蕨類孢子的萌發(fā)，但在培養(yǎng)后期營養(yǎng)供應(yīng)不足，不利于孢子萌發(fā)后的生長發(fā)育。

相關(guān)研究表明，組織培養(yǎng)時不同種類的蕨類植物孢子萌發(fā)適合的激素種類及濃度各不相同。用不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)假鞭葉鐵線蕨（Adiantum malesianum），孢子萌發(fā)生長良好[23]。在扇葉鐵線蕨（A.flabellulatum）孢子萌發(fā)試驗中，使用不添加任何激素的1/4MS培養(yǎng)基即可取得良好的萌發(fā)結(jié)果[24]，這與粗莖鱗毛蕨、溪洞碗蕨萌發(fā)試驗結(jié)果相符。同時，也有相關(guān)報道證明，采用適當(dāng)?shù)募に亟M合可以提高一些品種蕨類孢子的萌發(fā)率。袁藝等[25]研究了影響紫萁孢子萌發(fā)的因素，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加1mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA最有利于孢子萌發(fā)。郭慶勛等[26]探究了4種激素對猴腿蹄蓋蕨（Athyrium multidentatum）孢子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)NAA、2，4-D、BA、KT 4種激素中KT促進(jìn)孢子萌發(fā)效果最好，BA和NAA次之。本試驗中，掌葉鐵線蕨在低濃度NAA和6-BA激素作用下同樣獲得更好的萌發(fā)效果。出現(xiàn)以上差異的原因，可能是由于不同孢子休眠特性和自身含有內(nèi)源激素共同作用進(jìn)而導(dǎo)致對外界激素生理反應(yīng)的結(jié)果不同。研究表明，蕨類植物孢子需要通過光照打破休眠[27]。高大腎蕨（Nephrolepis exaltata）、粗脈蕨（Phlebodium aureum）及夏威夷樹蕨（Cibotium glaucum）在有光條件下，孢子均可正常萌發(fā)，而在無光或黑暗環(huán)境中則幾乎沒有孢子的萌發(fā)[32]。張光飛等[28]認(rèn)為光照是扇蕨（Neocheiropteris palmatopedata）孢子萌發(fā)的主要影響因子，光照條件下孢子萌發(fā)率達(dá)85%，黑暗中培養(yǎng)50d也不能萌發(fā)。均與本試驗結(jié)果相符，表明光照是大部分蕨類植物孢子萌發(fā)的必要條件。

綜上所述，在對當(dāng)年采收掌葉鐵線蕨、粗莖鱗毛蕨、溪洞碗蕨孢子萌發(fā)試驗中，低濃度赤霉素處理、無機(jī)鹽濃度的變化對于提高萌發(fā)率沒有顯著影響，較高濃度赤霉素處理顯著降低孢子萌發(fā)率。在低濃度NAA和6-BA激素作用下，掌葉鐵線蕨萌發(fā)率最高；粗莖鱗毛蕨、溪洞碗蕨則對低濃度的外源激素不敏感，高濃度外源激素會抑制3種蕨類植物孢子萌發(fā)。本試驗初步探究了以上3種蕨類植物孢子的萌發(fā)特性，為實現(xiàn)其快速高效的人工繁殖奠定了基礎(chǔ)。蕨類孢子萌發(fā)受到一系列外界條件的影響，不同種類所適應(yīng)的生長環(huán)境也各不相同，目前的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。如何根據(jù)特定蕨類探究其最適生境，建立完善的快速繁殖體系，實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)以至推廣應(yīng)用，還有待進(jìn)一步研究。