超聲波輔助浸取法提取牡丹籽油的工藝優(yōu)化研究

林湘湘，易雪平，倪 穗

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)系芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)植物，素來因花色艷麗，形態(tài)華麗而常被用于觀賞，并輔以鮮花入食和根皮入藥的用途。丹皮酚是牡丹根皮中發(fā)揮藥理作用的成分，對于丹皮酚的研究已較為深入。例如，研究表明丹皮酚具有抑制HMGB1-NF-κB P65信號通路傳遞的作用，可應(yīng)用于急性肺損傷的治療[1]。在另一則研究中發(fā)現(xiàn)，牡丹的根芽提取物可以通過降低細(xì)菌的細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量從而降低胞膜流動性，進(jìn)而達(dá)到殺死細(xì)菌的目的[2]。雖然在觀賞和藥用還有食用花瓣等方面，牡丹已有較大程度的開發(fā)利用，但牡丹整體植株的利用率并不高。近年來的研究表明，牡丹籽的油脂含量豐富，其中不飽和脂肪酸高達(dá)90%以上，包括油酸、亞油酸、α-亞麻酸等。α-亞麻酸進(jìn)入人體之后可轉(zhuǎn)換為有益人體的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)，具有促進(jìn)大腦發(fā)育、調(diào)節(jié)血脂的作用[3]。牡丹是木本植物，具有耐旱耐鹽的特點(diǎn)，適合在山地生長，若對牡丹籽油進(jìn)行開發(fā)利用，可不必考慮與草本植物油爭搶田地的問題，牡丹籽油和草本植物油的生產(chǎn)可齊頭并進(jìn)，共同供給居民的食用油需求，且牡丹在山東、菏澤等地已有廣泛的培育基礎(chǔ)。因此牡丹籽油可作為木本植物油中具有較高營養(yǎng)價值的品種，開發(fā)為保健食用油，投入市場，推廣食用。在2011年衛(wèi)生部發(fā)布的第九號文件中已將‘紫斑牡丹’和‘鳳丹’兩個品種的牡丹列為新食品資源，預(yù)計(jì)在未來牡丹籽油將會成為一個蓬勃發(fā)展的新的食用油產(chǎn)業(yè)。

近年來，我國用油需求量快速增加[4]，即使國內(nèi)菜籽與大豆產(chǎn)量不斷增加，但單薄的供油量仍不滿足居民需求，進(jìn)口大豆油仍占到糧油消費(fèi)總量的70%以上[5]，大量進(jìn)口大豆不利于我國糧油戰(zhàn)略性安全，開發(fā)新木本食用油品種是當(dāng)務(wù)之急。大力發(fā)展木本油有利于減輕用油壓力，開發(fā)具有較高營養(yǎng)價值的牡丹籽油有利于改善人民膳食結(jié)構(gòu)，提高不飽和脂肪酸的攝入。

目前油脂的提取方法主要包括微波輔助浸取法[6]，超聲波輔助浸取法[7]，超臨界二氧化碳提取法以及索式抽提法等。綜合比較上述幾種方法的操作便捷性、試驗(yàn)時間長短、試驗(yàn)結(jié)果的優(yōu)越性之后，本研究將采用超聲波輔助浸取法[8]，以油用牡丹品種‘鳳丹’的種籽[9]為原料、石油醚為提取劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用響應(yīng)面分析法[10]，采用多元二次回歸方程來擬合響應(yīng)值和因素之間的關(guān)系，利用多元二次方程模型確定關(guān)于時間、溫度、功率、液料比四個因素的最佳的提取工藝；最后采用GC-MS分析毛油中不飽和脂肪酸組成，以期為牡丹籽油的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

飽滿無發(fā)霉的新鮮‘鳳丹’(安徽亳州)在60℃下烘干后，手工剝殼得種仁，再次烘干至恒重，粉碎后過60目篩，室溫25℃密封備用。

1.1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)室自制純水、石油醚、硫酸、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉(以上試劑均為分析純)。

1.2 試驗(yàn)儀器

超聲波清洗儀(SB-5200DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司)、真空泵(ZK-26/100，杭州米歐儀器有限公司)、恒溫水浴鍋(HH-4，常州申光儀器有限公司)、分析天平(FA2004，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、多功能粉碎機(jī)、氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890B-7000C型，安捷倫科技有限公司)、色譜柱信息：脂肪酸(液體進(jìn)樣)：CD-2560(100 m ×250 μm×0.2 μm)、頂空固相微萃取測揮發(fā)性物質(zhì)：Vocal(60 m×0.32 mm×1.8 μm)、其他色譜柱：DB-35、DB-5。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取方法

1.3.1.1 超聲波輔助浸取法

在試驗(yàn)過程中，按照單因素實(shí)驗(yàn)或者響應(yīng)面設(shè)計(jì)表，以一定比例的液料比混合備好的牡丹籽粉末和石油醚，控制超聲清洗儀在設(shè)定的溫度、功率，用保鮮膜封口后，在超聲波清洗機(jī)中超聲浸取一定時間。浸取完成后，抽濾后利用石油醚的沸點(diǎn)低于油脂的特點(diǎn)進(jìn)行蒸餾去除浸取劑，將剩余物轉(zhuǎn)移入烘箱烘至恒重，以確保將牡丹籽油中的浸提劑盡可能去除完全，再稱取準(zhǔn)確重量，利用公式(1)，計(jì)算得油率。

(1)

式中：m1為牡丹籽油質(zhì)量 (g)；m2為牡丹籽仁粉末質(zhì)量 (g)。

1.3.1.2 提取工藝優(yōu)化

選超聲溫度、超聲功率、液料比、超聲時間作為影響因素，以牡丹籽油提取率為評價指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取適當(dāng)?shù)囊蛩厮?，?1、0、1表示；溫度、功率、液料比、時間用A、B、C、D表示。利用Design Expert軟件，采用中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)方法進(jìn)行四因素三水平設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行高效的試驗(yàn)進(jìn)程得到有代表意義的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。以超聲溫度(A)、超聲功率(B)、液料比(C)、超聲時間(D)為考察變量，選擇因素水平如表1所示，以牡丹籽油得率(%)為指標(biāo)，對牡丹籽油提油率提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表1 超聲波試驗(yàn)因素水平表

1.2.1.3 甲酯化處理

脂肪酸及油脂的沸點(diǎn)高，高溫下不穩(wěn)定，易裂解，分析中易造成損失。因此，對脂肪酸及油脂的脂肪酸組分分析前，先將脂肪酸或油脂與甲醇反應(yīng)，制備脂肪酸甲酯，降低沸點(diǎn)，提高穩(wěn)定性。參考寇秀穎的研究[11]，采用“硫酸—甲醇酯化法”對提取的牡丹籽油進(jìn)行預(yù)處理。稱取1.00 g牡丹籽油于具塞錐形瓶中，加入10 mL硫酸-甲醇(體積比1:10)，于70℃超聲1 h，用等體積正己烷萃取，萃余物用等體積正己烷復(fù)萃，合并兩次萃取物，用蒸餾水洗滌多次至分層良好。用無水硫酸鈉干燥萃取物，過濾，離心沉降濾液(5000 r/min，10 min)，取上清液用作GC-MS分析樣品。

1.2.1.4 GC-MS方法

(1)色譜條件：HP-5毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm，0.33 μm)；初始溫度140℃，保持5 min，升溫速率4℃/min，終止溫度240℃，保持25 min；載氣為高純He，流速2.25 mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比50∶1。

(2)質(zhì)譜條件：離子源為EI源，離子源溫度230℃，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍40～450 m/z。

(3)定量分析：參考NIST98 譜圖庫并且查閱相關(guān)文獻(xiàn)分析GC-MS提取得到的牡丹籽油不飽和脂肪酸成分，確定牡丹籽油各組分及相對百分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對得油率的影響

在液料比為1∶5，提取時間為50 min，功率為80W時，設(shè)置變量溫度為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，實(shí)驗(yàn)得到對應(yīng)得油率。如圖1(A)所示，在45℃時得到最大得油率33.05%。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在液料比為5∶1、提取時間為50 min、功率為80 W條件下，溫度為45℃時得油率最大。由圖1(A)可知，牡丹籽得油率隨著溫度的升高先上升后降低。在30～45℃時，分子的熱運(yùn)動隨溫度升高而加劇，油脂分子與溶劑之間作用加強(qiáng)，使得油率升高；繼續(xù)升高溫度，高溫易使油脂和油料中的組分發(fā)生分解，最終致使得油率下降。

2.1.2 提取功率對得油率的影響

在設(shè)置液料比為5∶1，提取時間為50 min，提取溫度為45℃時，設(shè)置變量功率為60、80、100、120、140、160 W，得到對應(yīng)得油率，如圖1(B)所示在功率為80 W時得到最大得油率33.39%。

在液料比為5∶1、提取時間為50 min、提取溫度為45℃的條件下，牡丹籽油得油率隨功率的升高先上升后下降。在功率為60～80 W時，功率升高，油料的空化作用與機(jī)械作用更加強(qiáng)烈，使得油率增加；而功率在160 W之后，功率過高可能會導(dǎo)致熱效應(yīng)從而引起脂肪酸分解變性，因此降低得油率[12]。

圖1 各單因素對得油率的影響Fig.1 Each factor effect on the oil yield注： (A)溫度對得油率的影響；(B)功率對得油率的影響；(C)液料比對得油率的影響；(D)時間對得油率的影響

2.1.3 液料比對得油率的影響

在提取時間為50 min；溫度為45℃；提取功率為100 W，改變變量液料比為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1，試驗(yàn)得到對應(yīng)的得油率。如圖1(C)所示，在液料比為7:1時，得到最大得油率31.09%。

在提取時間為50 min、溫度為45℃、提取功率為100 W的條件下，牡丹籽得油率隨著液料比的增加先增加后減少。在液料比為3∶1～7∶1內(nèi)，得油率穩(wěn)定上升，這是由于相對一定量的油料，提取劑的增加有利于增加溶劑與油料之間的接觸面積，有利于增加脂肪酸的釋放幾率。繼續(xù)增加溶劑用量，溶液中油脂的濃度下降，造成萃取劑過剩，且由于浸取劑量大需要分多次抽濾蒸餾，在操作過程中容易造成油脂損失，導(dǎo)致得油率的下降。

2.1.4 提取時間對得油率的影響

在液料比為5∶1；提取溫度為45℃；提取功率為100 W，設(shè)置變量時間為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，試驗(yàn)結(jié)果表明，在提取時間為40 min時，得到最大得油率30.62%。

在液料比為5∶1、提取溫度為45℃、提取功率為100 W的情況下，時間對牡丹籽油得油率的影響如圖1(D)。在提取時間為20～40 min時，得油率隨著時間增長而逐漸增大，浸提出的油脂由于超聲波的空化作用，理化性質(zhì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致油脂含量降低?？梢?，適當(dāng)延長固液接觸時間[13]有利于油脂和溶劑充分作用從而提高得油率，但為避免油脂組分發(fā)生改變，需要控制作用時間。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

由單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇四因素三水平設(shè)計(jì)結(jié)果見表1，用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，按照設(shè)計(jì)表展開試驗(yàn)得到相應(yīng)結(jié)果，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到修正系數(shù)Radj2為0.9241，說明建立的線性模型擬合度較好，并且得到牡丹籽得油率與超聲波處理各因素的二次方程模型：

Y = 33.21 + 0.66 × A + 0.63 × B + 0.71 × C + 1.89 × D + 0.52 × A × B + 0.71 × A × C + 0.88 × A × D + 0.94 × B × C + 0.86 × B × D + 0.91 × C × D - 2.05 × A2- 1.90 × B2- 2.65 × C2- 2.60 × D2

由表3可得，P<0.0001說明該模型極具有顯著性，且四個因素一次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，說明四個因素對于得油率結(jié)果有極顯著的影響。由F值可知，各因素對牡丹籽出油率的影響次序?yàn)椋禾崛r間>液料比>溫度>功率。觀察表格得四個因素間兩兩交互組合對于得油率的影響結(jié)果不一，除溫度與功率組合以及溫度與料液比組合對結(jié)果影響不顯著外，其他組合對得油率結(jié)果有顯著影響。回歸方差分析表中模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明該模型回歸極顯著，并且失擬項(xiàng)不顯著，說明該方程對試驗(yàn)擬合較好。

表2 超聲波響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 超聲波響應(yīng)面方差分析結(jié)果

根據(jù)二次回歸方程，做出該模型的等高線和3D響應(yīng)面，分析提取時間、液料比、功率和溫度對牡丹籽油得油率的影響，見圖2。響應(yīng)面的等高線圖可以直觀地反映出各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。等高線越接近橢圓形則表示兩因素交互作用越顯著，而接近圓形則與之相反。由圖2可知功率和時間與功率和液料比這兩對因素交互性顯著，而其他因素間交互性較弱[14]。

2.3 最佳工藝確定

為進(jìn)一步確定工藝最佳點(diǎn)，在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn)，按照模型使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步分析確定最優(yōu)工藝為：溫度45.51℃、功率44.38%(總功率200 W)、液料比7.36∶1、時間45.66 min，預(yù)測的得油率為34.14%。

由于實(shí)際條件的可操作性，現(xiàn)將工藝確定為溫度為45℃、功率為90 W、液料比為7∶1、時間為45 min，對該工藝進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證得到實(shí)際得油率為33.90%，與預(yù)測得油率相近，故該方法可行。

2.4 GC-MS分析

提取的牡丹籽油經(jīng)過甲酯化處理之后，利用GC-MS檢測了其中的脂肪酸組成，通過檢索標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，并參閱有關(guān)文獻(xiàn)，鑒定了‘鳳丹’牡丹籽油主要脂肪酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用峰面積歸一化法確定了各主要脂肪酸的相對含量，結(jié)果見表4。利用超聲波輔助浸取法提取的毛油中亞麻酸為39.75%、亞油酸為26.32%、油酸含量為23.66%，棕櫚酸和硬脂酸含量較少，棕櫚酸含量在7.73%、硬脂酸為2.54%。該結(jié)果符合2014年發(fā)布的牡丹籽油中α-亞麻酸的含量不低于38%行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

表4 超聲波輔助浸取法毛油不飽和脂肪酸成分

3 結(jié)論與討論

對超聲波輔助浸取法提取牡丹籽油進(jìn)行單因素試驗(yàn)之后，在單因素試驗(yàn)最佳的范圍內(nèi)，選取四個因素(溫度、時間、功率、液料比)的三個水平，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過回歸方程擬合分析得出牡丹籽油索氏提取法的最佳工藝條件為：以石油醚為提取劑，溫度為45℃、功率為90 W、液料比為7∶1、時間為45 min，對該方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到實(shí)際得油率為33.90%，接近二次方程模型預(yù)測的最大得油率，故認(rèn)為上述方法為最優(yōu)工藝。該結(jié)果高于易軍鵬[7]用超聲波輔助浸取法萃取牡丹籽油的最大得油率(24.21%)，分析可能是由于使用儀器、原料產(chǎn)地均不相同。綜合考慮各個因素的影響，認(rèn)為本工藝更有效且更具優(yōu)異性。陳程等[15]研究表明，牡丹籽餅中油脂的最佳提取工藝條件為粒度80目、液料比27∶1、浸提溫度45℃、浸提時間4 h、超聲溫度42℃、超聲功率320 W、超聲時間35 min，在此條件下，牡丹籽油得率為11.15%。由于其試驗(yàn)時牡丹籽并未做脫殼處理，所以不認(rèn)為具有比較意義，只在試驗(yàn)方法上具有參考價值。

對牡丹籽毛油及原油的GC-MS分析結(jié)果表明，牡丹籽油中不飽和脂肪酸含量豐富。其中油酸、亞麻酸、亞油酸占比達(dá)89.73%。研究表明[16]，亞麻酸進(jìn)入人體后可以轉(zhuǎn)化為EPA和DHA，具有促進(jìn)大腦發(fā)育、預(yù)防心血管疾病的作用；亞油酸可以防癌抗癌；油酸可以預(yù)防膽固醇在血管中沉積。由此可見，牡丹籽油的保健功效也十分突出，更進(jìn)一步說明牡丹籽油的潛在價值和發(fā)展?jié)摿Α１狙芯恳庠跒閮?yōu)化牡丹籽油提取工藝以及開發(fā)提供強(qiáng)有力的理論支持。