降壓物質(zhì)檢查試驗中家貓對組胺靈敏度分析

黃甘泉吳賢生王鳳姬姚嘉琪黃 銳梁冠澤嚴家榮鄺少松

(廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,佛山 528248)

貓在生理及醫(yī)藥學(xué)上的研究使用,最早可追溯到19世紀末[1]。貓的循環(huán)系統(tǒng)發(fā)達,血壓穩(wěn)定,對強心苷和組胺較敏感,并且可以迅速代謝組胺等生物,適用于藥物篩選與降壓物質(zhì)檢查試驗[2]。因此在中國藥典、歐洲藥典和英國藥典收錄的降壓物質(zhì)檢查法中,貓都是方法指定的實驗動物。受困于國內(nèi)貓的實驗動物化進展緩慢,我們很難通過市場購買途徑獲得具有實驗動物質(zhì)量合格證明的實驗貓。目前用于藥品檢測的實驗用貓仍以農(nóng)戶飼養(yǎng)家貓、寵物貓和流浪貓為主。這些貓遺傳背景、年齡、健康狀態(tài)、攜帶病原生物不明,體重差異較大,均可能影響到實驗結(jié)果的準確性。

劉明慧等[3]推測中國每年用于實驗的貓的數(shù)量達5000只,但其背景數(shù)據(jù)等少見報道。本研究中,本研究統(tǒng)計了近年來本單位用于降壓物質(zhì)檢查的404只實驗用貓的血壓值和其對組胺的靈敏度,為今后降壓物質(zhì)檢查試驗或其他以貓作為實驗系統(tǒng)的心血管方面試驗提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年雄性家貓404只,體重2.5～4.5 kg,均購于廣東省廣州市周邊農(nóng)村。動物實驗在廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SYXK(粵)2018-0002]開展。實驗動物倫理由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心倫理委員會審批,倫理審批號：A201501-3、A201601-18、A201701-17、A201801-24、A201901-13。 本實驗涉及的與動物實驗相關(guān)的內(nèi)容和程序遵從實驗動物使用和管理的相關(guān)法律法規(guī)及本機構(gòu)實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定,遵循動物使用的“3R”原則,給予動物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

BL-420S生物機能儀,成都泰盟科技有限公司;電子天平,上海蒲春計量儀器有限公司;磷酸組胺標準品,中國食品藥品檢定研究院;肝素鈉注射液,成都市海通藥業(yè)有限公司;鹽酸賽拉嗪注射液,吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司;戊巴比妥鈉,美國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物麻醉

通過肌肉注射鹽酸塞拉嗪注射液0.1 mL/kg和耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液10 mg/kg體重聯(lián)合麻醉[4],需要用于2批次及2批次以上樣品降壓物質(zhì)檢查的家貓,在完成第一輪降壓物質(zhì)檢查試驗后(約1 h),皮下注射戊巴比妥鈉進行補充麻醉,補充麻醉劑量為3 mg/kg體重。

1.3.2 血壓測量

家貓麻醉后分離一側(cè)頸動脈并連接生物機能儀進行血壓測定,分離一側(cè)股靜脈用于組胺對照品和樣品的注射。按照《中國藥典》降壓物質(zhì)檢查法的要求,每批次樣品檢查前按家貓體重每1 kg注射組胺0.05 μg、0.10 μg、0.15 μg,重復(fù) 2次,取 2次同劑量組胺引起的血壓反應(yīng)的均值作為該使用次數(shù)的反應(yīng)值。相鄰2次注射的間隔時間盡量保持一致,每2次靈敏度檢查的重復(fù)時間間隔為 50～55 min。

1.3.3 數(shù)據(jù)整理和分析

比較和分析家貓體重對基礎(chǔ)血壓值和首次使用組胺靈敏度的影響,基礎(chǔ)血壓值對組胺靈敏度的影響。比較不同使用次數(shù)家貓的血壓值和靈敏度,分析重復(fù)使用次數(shù)對家貓血壓值和組胺靈敏度的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,方差不齊時采用非參數(shù)檢驗進行分析,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 家貓體重與血壓基礎(chǔ)值

本研究共統(tǒng)計了404只雄性家貓麻醉狀態(tài)下的頸動脈基礎(chǔ)血壓值,這些家貓平均體重為3.41 kg,平均頸動脈收縮壓、舒張壓和平均壓分別為：(18.10±3.69)kPa、(13.32±2.88)kPa和(14.91±3.10)kPa。將家貓按照體重大小劃分,分別統(tǒng)計其體重和基礎(chǔ)血壓值的關(guān)系,其結(jié)果如表1所示,不同體重的家貓血壓均未見明顯差異(P＞ 0.05)。

2.2 家貓體重和對組胺的靈敏度

本研究所統(tǒng)計的404只家貓對0.05μg/kg、0.10μg/kg和0.15μg/kg組胺所致血壓反應(yīng)值分別為(3.25±1.11)kPa、(4.72±1.31)kPa和(5.38±1.45)kPa。如表2所示,不同體重的家貓對3個劑量的組胺靈敏度均未見明顯差異(P＞0.05)。

2.3 基礎(chǔ)血壓值對靈敏度和使用次數(shù)的影響

如圖1所示,0.05μg/kg、0.10μg/kg和 0.15 μg/kg劑量的組胺所致家貓血壓反應(yīng)值和家貓的基礎(chǔ)血壓值均成正相關(guān)(P＜0.05)。相同劑量的組胺,在基礎(chǔ)血壓值較高的家貓身上會引起更大的降壓作用,可認為基礎(chǔ)血壓值高的家貓對組胺引起的血壓降低作用更為敏感。

如表3所示,將家貓基礎(chǔ)血壓值按2 kPa幅度劃分區(qū)間,家貓對組胺所致的血壓反應(yīng)值隨基礎(chǔ)血壓升高而增大。家貓基礎(chǔ)血壓值低于12 kPa時,平均用于檢測藥品降壓物質(zhì)的次數(shù)為4.11次。14～16 kPa基礎(chǔ)血壓值范圍的家貓可重復(fù)使用次數(shù)最高,達到5.04次,顯著高于＜12 kPa范圍的家貓(P＜0.05)。基礎(chǔ)血壓值高于16 kPa后,家貓的可重復(fù)使用次數(shù)減少。

2.4 重復(fù)使用次數(shù)對家貓血壓值和靈敏度的影響

如表4所示,家貓重復(fù)用于降壓物質(zhì)檢查,前6次使用時的基礎(chǔ)血壓值未見明顯下降。與首次使用血壓基礎(chǔ)值比較,重復(fù)使用第7次和第8次時家貓血壓基礎(chǔ)值顯著下降(P＜0.05)。

前6次使用時,隨著使用次數(shù)增加,低劑量組胺引起家貓的血壓反應(yīng)值逐漸減小,中劑量所致反應(yīng)值未見明顯波動,高劑量所致反應(yīng)值升高。與初次使用比較,第4～6次低劑量組胺所致反應(yīng)值明顯降低(P＜0.05),第3次和第4次高劑量所致反應(yīng)值明顯升高(P＜0.05)。

表1 家貓體重對基礎(chǔ)血壓值的影響(♂)Table 1 Influence of body weight on blood pressure of domestic cats

表2 家貓體重對組胺靈敏度比較(♂)Table 2 Influence of body weight on sensitivity for histamine of domestic cats

圖1 家貓血壓值與不同劑量組胺靈敏度相關(guān)性分析Figure 1 Correlation analysis of sensitivities for different dosage of histamine and blood pressure of domestic cats

與首次使用比較,第7次重復(fù)使用時家貓基礎(chǔ)血壓值和低劑量組胺所致反應(yīng)值均顯著下降(P＜0.05),中劑量和高劑量所致反應(yīng)值小幅下降(P＞0.05)。第8次重復(fù)使用時,家貓基礎(chǔ)血壓值和低、中、高劑量組胺所致血壓反應(yīng)值均顯著下降(P＜0.05)。

3 討論

藥品在生產(chǎn)制造過程中,可能會混入使血管擴張而降低血壓的活性物質(zhì)(包括組胺、緩激肽等組胺類物質(zhì)),中藥中也含有大量降低血壓的未知和已知雜質(zhì)成分。靜脈注射該類藥品有急性降血壓作用,有可能誘發(fā)嚴重的心血管系統(tǒng)不良反應(yīng)[5]。目前《中國人民共和國藥典》2015年版收錄的檢測引起血壓下降物質(zhì)的方法主要降壓物質(zhì)檢查法和組胺類物質(zhì)檢查法,有研究報道,組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果不可直接外推至整體實驗[6-7]。因此降壓物質(zhì)檢查法仍是當前最主要的檢測藥物制劑降壓物質(zhì)的檢測方法。

根據(jù)《中國人民共和國藥典》2015年版規(guī)定,降壓物質(zhì)檢查使用家貓進行,雌雄均可,雌性動物應(yīng)無孕[8]。因無法購買到質(zhì)量可靠的標準化實驗貓,在開展降壓物質(zhì)檢查活動時我們僅能從廣州附近收購農(nóng)戶的家貓,并且僅能在麻醉后才能夠仔細檢查家貓是否無孕,出于動物倫理和保證實驗質(zhì)量的考慮,我們僅選擇使用雄性家貓進行實。

在進行麻醉時,鹽酸塞拉嗪作為肌松劑,主要作用是使家貓肌肉松弛,以便靜注戊巴比妥鈉,聯(lián)合麻醉可以降低戊巴比妥鈉的使用劑量,減少麻醉風(fēng)險,達到良好的麻醉效果[9]。聯(lián)合麻醉的維持時間約為2 h,同一只貓如需進行多批受試樣品的降壓物質(zhì)檢查,在完成第一批受試樣品降壓物質(zhì)檢查后皮下注射戊巴比妥鈉溶液補充麻醉[10]。與肌注或者靜注給藥方式補充麻醉相比,皮下注射補充麻醉的方式因吸收緩慢,可以避免快速補充麻醉劑而導(dǎo)致貓血壓的下降,從而減少補充麻醉對檢測結(jié)果的影響。同時應(yīng)密切關(guān)注貓的麻醉狀態(tài),不同的麻醉深度對血壓有影響,本研究中通過觀察麻醉家貓呼吸,黏膜顏色和基礎(chǔ)血壓值等適當補充麻醉,盡可能使得家貓?zhí)幱诼樽砣?外科麻醉期)以減少不同麻醉深度對血壓的影響。例如麻醉家貓出現(xiàn)呼吸不規(guī)則、基礎(chǔ)血壓升高、掙扎等癥狀,說明麻醉過淺,應(yīng)該補充麻醉;例如呼吸減慢,出現(xiàn)呼吸抑制或基礎(chǔ)血壓下降等癥狀,說明麻醉過深,應(yīng)注射麻醉解藥(腎上腺素)[11]。

表3 血壓對家貓組胺靈敏度和重復(fù)使用次數(shù)的影響(♂)Table 3 Influence of blood pressure on sensitivity for histamine and reuse capability of domestic cats

表4 重復(fù)使用次數(shù)對家貓靈敏度影響(♂)Table 4 Influence of reuse time on sensitivity for histamin of domestic cats

本研究中我們共統(tǒng)計了2015～2019年間我單位使用的貓家的血壓數(shù)據(jù),在尚無標準化實驗貓可供使用的情況下,這些數(shù)據(jù)應(yīng)有較大參考意義。通過比較不同體重范圍家貓的血壓基礎(chǔ)值和其對組胺的靈敏度,尋找適合實驗的家貓體重范圍。實驗結(jié)果表明,雖然家貓的體重差異較大,但基礎(chǔ)血壓值和對組胺的靈敏度均很穩(wěn)定,不受體重的影響。麻醉后的基礎(chǔ)血壓值對家貓的可重復(fù)使用次數(shù)較為相關(guān),基礎(chǔ)血壓值在16～18 kPa范圍的家貓可重復(fù)使用次數(shù)最多。影響家貓的基礎(chǔ)血壓值的因素包括遺傳背景、個體差異、健康狀態(tài)、麻醉劑選擇與麻醉深度等。在進行降壓物質(zhì)檢查試驗時,選擇健康狀態(tài)良好的實驗動物和適合的麻醉方法,可增加每只家貓用于樣品檢測的次數(shù),從而減少家貓的使用。

《中國藥典》對降壓物質(zhì)檢查中家貓對組胺靈敏度的要求是中劑量組胺(0.01μg/kg)所致反應(yīng)值不低于2.67 kPa,同時各劑量所致反應(yīng)值有差別。本次研究中,家貓每次重復(fù)使用間隔均為1 h左右,在前6次重復(fù)使用過程中,家貓的血壓值和對中劑量組胺的靈敏度均未見明顯變化,并且重復(fù)使用后家貓對不同劑量的組胺所致反應(yīng)值差別增大,其增大的原因仍未清楚。第7、8次重復(fù)使用時,血壓值出現(xiàn)較明顯降低,對組胺的靈敏度也逐漸減小,但仍滿足《中國藥典》對靈敏度的要求。因為實驗時間以及工作安排方面的原因,我們未進行更多重復(fù)使用次數(shù)的實驗。

目前國內(nèi)用于降壓物質(zhì)檢查的家貓多為非標準化實驗動物,其個體差異不可控制,健康狀況無法保證,同時因這些家貓常常攜帶寄生蟲和微生物,對實驗結(jié)果以及實驗人員的安全均產(chǎn)生威脅和影響[12-13]。雖偶有標準化實驗貓建立的文獻報道,卻未見推廣和銷售[3]。以此,建立實驗貓的繁殖、培育和檢驗相關(guān)標準以及標準化實驗動物仍需持續(xù)推進。