NaCl脅迫對(duì)馬鈴薯試管苗POD酶活性及同工酶的影響

裴懷弟 劉潤(rùn)萍 林玉紅 李淑潔 呂汰

摘要：選用4個(gè)馬鈴薯品種（系）的試管苗，在不同NaCl濃度的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化成苗，對(duì)其耐鹽性進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，隨著NaCl濃度的增加，大西洋、L03-1、L03-6的POD酶活性與無(wú)脅迫處理相比呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但L03-2與無(wú)脅迫處理相比POD酶活性呈增加趨勢(shì)。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)NaCl脅迫馬鈴薯試管苗POD同工酶監(jiān)測(cè)表明，馬鈴薯鹽誘導(dǎo)再生苗POD同工酶譜帶存在品種（系）間顯著差異，鹽脅迫已經(jīng)不能使POD同工酶譜帶保持完整，參試馬鈴薯品種（系）對(duì)鹽濃度敏感程度存在差異。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯試管苗;鹽脅迫;POD酶活性;同工酶

中圖分類(lèi)號(hào)：S513 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2020）06-0012-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.06.004

Effects of NaCl Stress on POD Enzyme Activity and Isozyme of Potato Tube Plantlets

PEI Huaidi 1， LIU Runping 2， LIN Yuhong 1， LI Shujie 1， L？譈 Tai 3

（1. Institute of Biotechnology， Gansu Academy of Agriculture Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;2. Institute of Agricultural Econamic and Information， Gansu Academy of Agriculture Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;3. Tianshui Institute of Agricultural sciences， Tianshui Gansu 741000， China）

Abstract：In this experiment， the tube plantlets of four potato cultivars（lines） were seleted， Directly induce to differentiate into seedlings on medium containing different NaCl concentrations， preliminary identification of its salt tolerance. The results showed that with the increase of NaCl concentration， the POD enzyme activity of Atlantic， L03-1 and L03-6 showed a decreasing trend compared with treatment without stress， but the POD enzyme activity of L03-2 showed an increasing trend compared with the treatment. Monitoring of POD isoenzymes in NaCl stress potato tube plantlets by polyacrylamide gel electrophoresis showed that the potato salt-induced seedling of POD isozyme bands existed significant differences， salt stress could not maintain the integrity of the POD isozymes. In this experiment four potato varieties on the salt sensitivity presenced difference.

Key words：Potato tube plantlets;Salt induction;POD enzyme activity;Isozyme

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界上廣為種植的糧菜兼用型作物，也是我國(guó)干旱和半干旱地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，屬鹽敏感 型[1 ]，鹽害不利于其生長(zhǎng)，且對(duì)產(chǎn)量影響極大，因此，培育符合不同育種目標(biāo)的耐鹽馬鈴薯新品種就顯得十分重要。大量的研究結(jié)果表明，馬鈴薯的抗鹽能力較弱[1 - 2 ]，0.2%的鹽逆境就可見(jiàn)脅迫效果，使馬鈴薯出苗遲緩、發(fā)芽勢(shì)降低、植株矮小甚至死亡，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。通過(guò)常規(guī)育種改良品種一直進(jìn)展緩慢，通過(guò)鹽脅迫誘導(dǎo)，進(jìn)行體細(xì)胞無(wú)性系變異篩選是進(jìn)行抗性品種選育的有效途徑之一[3 ]，在許多植物品種改良上已取得成功[4 - 5 ]。我們利用馬鈴薯試管苗再生誘導(dǎo)，對(duì)不同品種（系）馬鈴薯進(jìn)行耐鹽性研究，通過(guò)對(duì)馬鈴薯莖段外植體的直接鹽脅迫誘導(dǎo)，建立耐鹽愈傷組織變異系誘導(dǎo)和篩選技術(shù)，分析鹽脅迫條件下馬鈴薯試管苗POD酶活性變化，探討鹽脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生新的同工酶，以適應(yīng)鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)的特殊代謝反應(yīng)，為馬鈴薯耐鹽機(jī)理研究提供參考。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 供試材料

供試的馬鈴薯品種（系）為大西洋、L03-1、L03-2、L03-6，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2 ? 試驗(yàn)方法

根據(jù)已有的方法建立馬鈴薯品種（系）的試管苗擴(kuò)繁體系[6 - 7 ]。試管苗繁殖采用莖切段法，將試管苗剪成1 cm左右?guī)б秆康那o段，插入MS固體培養(yǎng)基（pH 5.8）中，每25 d繼代繁殖1次，在3 000 lx 連續(xù)光照、溫度（25±1）℃培養(yǎng)備用。將生長(zhǎng)25 d左右的試管苗剪成1 cm左右不帶腋芽的莖段，將莖段嵌入固體不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基A（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D）中，pH為5.8，在該培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl做鹽誘導(dǎo)處理，Na Cl濃度分別為0（CK）、1、2、3、4、5 g/kg。在A培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d左右后，將莖段轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基B（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）中，p H為5.8;同樣在該培養(yǎng)基中加入濃度分別為0（CK）、1、2、3、4、5 g/kg的NaCl，每隔7 d用B培養(yǎng)基繼代轉(zhuǎn)接1次，直到分化成苗。

大西洋、L03-1、L03-2分別在1、2 g/kg NaCl濃度下;L03-6分別在1、2、3 g/kg NaCl濃度下分別得到再生試管苗（預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)NaCl濃度大于2 g/kg時(shí)，大西洋、L03-1、L03-2愈傷組織褐化嚴(yán)重，當(dāng)NaCl濃度大于3 g/kg時(shí)，L03-6愈傷組織褐化嚴(yán)重，均沒(méi)有得到相應(yīng)的再生苗），將分化得到的試管苗接種到含相應(yīng)濃度的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、繁殖，試管苗生長(zhǎng)25 d時(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 ? 測(cè)定方法

1.3.1 ? ?過(guò)氧化物（POD）酶活性測(cè)定 ? ?采用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定POD酶活性，參照王韶唐的方法[8 ]。

1.3.2 ? ?POD同工酶酶液提取 ? ?取0.2 g葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入5 mL提取介質(zhì)[pH 5.9，0.05 mol/L磷酸緩沖液，內(nèi)含1% PVP（聚乙烯吡咯烷酮）]冰浴研磨成勻漿，于15 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液為酶提取液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 ? ?POD同工酶電泳分離和染色 ? ?采用聚丙烯酰胺濃度梯度凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行POD同工酶電泳分離。聚丙烯酰胺濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為7%，酶液上樣量為15 μL，4 ℃條件下，開(kāi)始穩(wěn)壓80 V電泳，0.5 h后加到160 V電泳，電泳時(shí)間為6 h。將電泳后的凝膠置于染色液（40 mL聯(lián)苯胺儲(chǔ)存液、4% NH4Cl、5% EDTA-Na2、0.3% H2O2、蒸餾水按體積比1∶1∶1∶1∶8配制）中室溫下顯色1～15 min，酶活性區(qū)逐漸出現(xiàn)藍(lán)色，顯色后漂洗凝膠，最后對(duì)凝膠進(jìn)行掃描。

1.4 ? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)通過(guò)Microsoft Excel和SPSS（13.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 ? 結(jié)果分析

2.1 ? NaCl脅迫對(duì)馬鈴薯試管苗POD酶活性的影響

從圖1可以看出，NaCl鹽脅迫條件下，除L03-6外馬鈴薯各品種（系）間POD酶活性差異不顯著。隨著NaCl脅迫濃度的增加，大西洋、L03-1的POD酶活性均較對(duì)照降低，但差異不顯著;L03-6較對(duì)照顯著降低。L03-2隨著NaCl脅迫濃度的增加，POD酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，與對(duì)照差異均不顯著。

2.2 ? NaCl鹽誘導(dǎo)對(duì)馬鈴薯試管苗POD同工酶的影響

POD是一種對(duì)環(huán)境條件十分敏感的氧化酶類(lèi)，其主要作用是清除氧代謝中產(chǎn)生的H2O2以及能對(duì)各種逆境脅迫作出應(yīng)答[9 - 10 ]。POD譜帶的變化在一定程度上能反映植物抗鹽性的強(qiáng)弱，而且植物受到鹽脅迫時(shí)植物組織中的蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化[11 ]。從圖2可以看出，馬鈴薯鹽誘導(dǎo)再生試管苗POD同工酶譜帶存在品種（系）間顯著差異。從圖2 a可以看出，鹽誘導(dǎo)已經(jīng)不能使POD同工酶譜帶保持完整，L03-1、L03-2在鹽誘導(dǎo)下主要是造成大分子量的缺失;小分子量在0.2%濃度下缺失，鹽濃度的增加使酶量的表達(dá)減弱。大西洋正好與L03-1、L03-2相反，與對(duì)照相比，鹽誘導(dǎo)大分子量酶蛋白第Ⅰ條帶酶量表達(dá)的同時(shí)，也使小分子量酶蛋白第Ⅲ條和第Ⅳ條帶酶量增加。從圖2 b可以看出，L03-6在大分子量表達(dá)上無(wú)明顯差異，但是在鹽濃度為3 g/kg時(shí)，鹽誘導(dǎo)加強(qiáng)了第Ⅲ條帶酶量的表達(dá)，表明酶蛋白合成可能與作物抗氧化酶的影響有關(guān)。

3 ? 小結(jié)與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬鈴薯4個(gè)品種（系）的POD酶活性隨著鹽濃度的增加，大西洋、L03-1、L03-6與無(wú)脅迫處理相比均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，其中大西洋、L03-1與無(wú)脅迫處理差異均不顯著，L03-6顯著降低;L03-2在1、2 g/kg時(shí)POD酶活性均比無(wú)脅迫處理增加，但差異不顯著。從實(shí)驗(yàn)中可以看出，馬鈴薯在遭受到鹽脅迫逆境條件后，具有一定的自我恢復(fù)能力，其抗氧化功能較強(qiáng)。鹽誘導(dǎo)馬鈴薯再生苗POD同工酶譜帶品種（系）間存在顯著差異。鹽誘導(dǎo)已經(jīng)不能使POD同工酶譜帶保持完整，馬鈴薯品系L03-1、L03-2在鹽誘導(dǎo)下主要是造成大分子量的缺失;小分子量在2 g/kg濃度下缺失，鹽濃度的增加使酶量的表達(dá)減弱。大西洋正好與L03-1、L03-2相反，與無(wú)脅迫處理相比，鹽誘導(dǎo)使大分子量酶蛋白表達(dá)的同時(shí)，也使小分子量酶蛋白的表達(dá)量增加。L03-6在大分子量表達(dá)上無(wú)明顯差異，但是在鹽濃度為3 g/kg時(shí)，鹽誘導(dǎo)加強(qiáng)了第Ⅲ條帶酶量的表達(dá)，表明酶蛋白合成可能與作物抗氧化酶的影響有關(guān)。

過(guò)氧化物酶（POD）屬于植物體內(nèi)的一類(lèi)保護(hù)酶，它對(duì)逆境的反應(yīng)非常敏感，可以清除過(guò)氧化物，在植物的抗性中起著重要的作用。基因決定酶，酶催化調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。細(xì)胞受到鹽脅迫會(huì)發(fā)生一系列特殊的代謝變化，甚至造成代謝紊亂。在遺傳上集中表現(xiàn)為基因表達(dá)的改變[12 - 13 ]。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)或阻遏作用以及信號(hào)傳導(dǎo)等機(jī)制調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，迅速提高或降低原有酶的活性，或誘導(dǎo)產(chǎn)生新的同工酶，以適應(yīng)鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)的特殊代謝反應(yīng)，使其得以生存。

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（本文責(zé)編：陳 ? ?偉）