豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白特異性納米抗體的原核表達研究

王長江，曲光剛, *，武曰星，趙中偉，郭廣君，全洪坤，韓 強，沈志強, *

>(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；3.中國農(nóng)業(yè)大學，北京 100000)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，病毒粒子呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒有PCV1、PCV2和PCV3三種基因型，以PCV2對養(yǎng)豬業(yè)造成的危害最為嚴重，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎和腎病綜合征等疾病的主要病原[2-3]。PCV2基因組全長約1.76 kb，包括11個開放性閱讀框[4](Open Reading Framework，ORF)，其中ORF2編碼的Cap蛋白是PCV2主要的結(jié)構(gòu)蛋白和免疫相關(guān)蛋白[5]。Cap蛋白相對分子質(zhì)量約27.8 ku，具有很好的免疫原性[6-7]，在PCV2的感染和機體免疫過程中起重要作用，因此Cap蛋白是研制亞單位疫苗或使用免疫學方法檢測PCV2的首選靶抗原。

目前已經(jīng)報道的可供Cap蛋白抗原表位分析、PCV2鑒別診斷的特異性抗體均為傳統(tǒng)的全分子抗體[8-11]，這類抗體蛋白相對分子質(zhì)量大且熱穩(wěn)定性較差，通過哺乳動物細胞制備導致生產(chǎn)成本較高。1993年比利時科學家Hamers報道在駱駝體內(nèi)存在一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體[12]，克隆其可變區(qū)可得到只有重鏈可變區(qū)的單域抗體(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，VHH)，相對分子質(zhì)量約15 ku，僅為傳統(tǒng)全分子抗體相對分子質(zhì)量的1/10，也被稱為納米抗體。與傳統(tǒng)全分子抗體相比，納米抗體具有相對分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡單、熱穩(wěn)定性好、能在大腸桿菌和酵母細胞中快速大量表達的優(yōu)點[13]，因此受到越來越多的關(guān)注。納米抗體的這些特點使其成為PCV2抗原檢測或治療性抗體藥物的理想選擇。本研究利用大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)對淘洗獲得的PCV2 Cap蛋白特異性納米抗體序列(vhhcap)進行了克隆表達，以期為PCV2檢測、治療用新型納米抗體工具開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體E.coliDH5α感受態(tài)細胞、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞、原核表達載體pCold-SUMO、pET32a(+)均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存。

1.2 主要試劑 2×Taq PCR MasterMix 購自天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶、BamH I限制性內(nèi)切酶、Hind III限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；DL 2000 Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和膠回收試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司；Unstained Protein MW Marker購自賽默飛世爾公司；氨芐青霉素(Ampicillin)為SIGMA公司產(chǎn)品；Ni2+-NTA親和層析柱為常州天地人和生物科技有限公司產(chǎn)品；Anti His-tag (HRP)鼠源單抗購自康為世紀生物科技有限公司；豬圓環(huán)病毒Cap蛋白由山東綠都生物科技有限公司制備；ECL發(fā)光試劑為北京賽智產(chǎn)品；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1vhhcap基因片段擴增 根據(jù)前期淘洗篩選獲得的60株P(guān)CV2 Cap蛋白納米抗體基因(vhhcap)序列，使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計一對通用vhhcap特異性擴增引物，引物上、下游5’端分別加入BamH I和Hind III限制性內(nèi)切酶酶切位點，用于擴增克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)載體上的vhh片段。引物送上海捷瑞生物工程有限公司進行合成。

以其中1株vhhcap為模板，利用上述引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：vhhcap模板1 μL、上下游引物各1 μL、2×Taq PCR MasterMix 25 μL、ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，30 cycles，72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后將 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定片段大小；將鑒定正確的PCR產(chǎn)物割膠回收。

1.3.2vhhcap-pCold-SUMO和vhhcap-pET32a(+)重組表達載體構(gòu)建 將vhhcap目的基因和pCold-SUMO質(zhì)粒分別用BamH I和Hind III雙酶切，純化后使用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建vhhcap-pCold-SUMO重組質(zhì)粒；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，涂布Amp抗性平板，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，進行菌液PCR鑒定。從菌液PCR鑒定為陽性的重組菌中提取質(zhì)粒，即為構(gòu)建成功的vhhcap-pCold-SUMO重組質(zhì)粒。

vhhcap-pET32a(+)重組表達載體的構(gòu)建方法同上。

1.3.3 VHHcap重組蛋白誘導表達 將vhhcap-pCold-SUMO和vhhcap-pET32a(+)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)，按1%比例將過夜培養(yǎng)的重組菌轉(zhuǎn)接到5 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6時進行誘導表達，以不加誘導劑的菌液作為陰性表達對照。vhhcap-pCold-SUMO/BL21誘導條件為：IPTG終濃度1 mmol/L，16 ℃ 160 r/min誘導表達5 h；vhhcap-pET32a(+)/BL21誘導條件為：IPTG終濃度1 mmol/L，30 ℃ 160 r/min誘導表達5 h。誘導表達完成后收集菌體沉淀并超聲破碎，將超聲破碎后的樣品離心，分離上清和沉淀，分別變性處理后進行SDS-PAGE分析。

1.3.4 VHHcap重組蛋白純化vhhcap-pCold-SUMO/BL21和vhhcap-pET32a(+)/BL21重組菌同時進行誘導表達，按1%比例分別將過夜培養(yǎng)的重組菌接種到500 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，誘導表達條件同1.3.3。表達完成后將菌體超聲破碎，離心分別收集上清和沉淀；超聲上清采用Ni2+-NTA親和層析柱進行純化，操作方法參考產(chǎn)品說明書進行。對純化后重組蛋白進行SDS-PAGE分析并用BCA試劑盒測定濃度。

1.3.5 Western blotting分析 采用Western blotting對表達的納米抗體重組蛋白鑒定。將純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后洗滌5次，加入1∶2000稀釋的Anti His-tag (HRP)鼠源單抗，室溫孵育1 h，0.05% PBST洗滌5次后使用ECL化學發(fā)光顯色液顯色1 min并拍照觀察。

1.3.6 VHHcap納米抗體ELISA效價分析 兩種載體表達的VHHcap重組蛋白純化后使用BCA試劑盒測定濃度，通過間接ELISA法對兩種VHHcap重組蛋白進行效價分析，并做對比分析。以PCV2 Cap蛋白作為抗原包被96孔酶標板，包被濃度為10 μg/mL，每孔加入200 μL 3% MPBS進行封閉，兩種VHHcap重組蛋白分別調(diào)整至相同濃度水平后進行梯度稀釋，分別以梯度稀釋的兩種VHHcap重組蛋白作為一抗，分別以未誘導的vhhcap-pCold-SUMO/BL21和vhhcap-pET32a(+)/BL21超聲上清稀釋50倍作為陰性對照，37 ℃孵育1 h；洗滌后使用1∶2000稀釋的Anti His-tag(HRP)鼠源單抗37 ℃孵育1 h；洗滌后加入TMB底物顯色液室溫顯色15 min，顯色完成后加入終止液，酶標儀讀取450 nm波長處吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1vhhcap目的基因擴增 測序結(jié)果表明，淘洗獲得的該株vhhcap序列長度為408 bp，編碼136個氨基酸，CDR3區(qū)域包含19個氨基酸殘基，與NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對結(jié)果顯示匹配序列均為羊駝或駱駝重鏈抗體可變區(qū)序列。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，擴增條帶大小約400 bp，與預期條帶大小一致(圖1)。

M：DL 2000 DNA Marker；Nc：PCR 陰性對照；1-6：vhhcap PCR擴增產(chǎn)物M: DL 2000 DNA Marker; Nc: negative control;1-6: PCR products of vhhcap segment圖1 vhhcap基因片段PCR擴增結(jié)果Fig 1 Agarose gel electrophoresis results of PCR products

2.2 重組表達載體構(gòu)建vhhcap目的片段分別與pCold-SUMO和pET32a(+)載體連接，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，從過夜培養(yǎng)后的平板上隨機挑取單菌落進行PCR鑒定，陽性重組菌PCR產(chǎn)物出現(xiàn)約400 bp的特異性擴增條帶(圖2)。

M：DL 2000 DNA Marker；Nc：PCR陰性對照；1-5：vhhcap-pCold-SUMO/DH5α重組菌PCR鑒定產(chǎn)物；6-10：vhhcap-pET32a(+)/DH5α重組菌PCR鑒定產(chǎn)物M: DL 2000 DNA Marker; Nc: PCR negative control;1-5: PCR products of vhhcap-pCold-SUMO/DH5αrecombinant bacteria;6-10: PCR products of vhhcap-pET32a(+)/DH5α recombinant bacteria;圖2 重組菌菌液PCR鑒定結(jié)果Fig 2 Identification of recombinant bacteria by PCR method

2.3 VHHcap納米抗體蛋白表達、純化 經(jīng)鑒定正確的vhhcap-pCold-SUMO和vhhcap-pET32a(+)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)進行誘導表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示，VHHcap-pCold-SUMO重組蛋白為可溶性表達，在聚丙烯酰胺凝膠上呈現(xiàn)為約30 ku的蛋白條帶(圖3，泳道3)，與預期目的蛋白大小相符；而未誘導菌在該位置無蛋白條帶(圖3，泳道1和2)；VHHcap-pET32a(+)重組蛋白同樣為可溶性表達，表達產(chǎn)物相對分子質(zhì)量大于VHHcap-pCold-SUMO重組蛋白，蛋白條帶位置略低于35 ku(圖3，泳道6)。

按優(yōu)化后的最佳表達條件分別利用pCold-SUMO和pET32a(+)載體對VHHcap納米抗體重組蛋白進行大量表達，并使用Ni2+親和層析柱進行純化。取純化前樣品、流穿液以及純化后的蛋白樣品進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，經(jīng)親和層析純化后蛋白條帶與未純化的納米抗體重組蛋白大小一致(圖4-圖5)，流穿液中雖有少量目的蛋白存在，但大量VHHcap納米抗體重組蛋白存在于洗脫液中，表明VHHcap-pCold-SUMO和VHHcap-pET32a(+)重組蛋白均純化成功。

M：蛋白Marker；1：未誘導vhhcap-pCold-SUMO/BL21超聲上清；2：未誘導vhhcap-pCold-SUMO /BL21超聲沉淀；3：誘導vhhcap-pCold-SUMO /BL21超聲上清；4：誘導vhhcap-pCold-SUMO超聲沉淀；5：未誘導vhhcap-pET32a(+)/BL21；6：誘導vhhcap-pET32a(+)/BL21超聲上清；7：誘導vhhcap-pET32a(+)/BL21超聲沉淀M: Protein Marker; 1: supernatant after ultrasonication of non-induced vhhcap-pCold-SUMO/BL21;2: precipitation after ultrasonication of non-induced vhhcap-pCold-SUMO/BL21;3: supernatant after ultrasonication of induced vhhcap-pCold-SUMO/BL21;4:precipitation after ultrasonication of induced vhhcap-pCold-SUMO/BL21;5: non-induced vhhcap-pET32a(+)/BL21;6: supernatant after ultrasonication of induced vhhcap-pET32a(+)/BL21;7: precipitation after ultrasonication of induced vhhcap-pET32a(+)/BL21圖3 兩種表達載體對VHHcap重組蛋白表達結(jié)果SDS-PAGE分析Fig 3 SDS-PAGE analysis of VHHcap protein expressed by different vector

M：蛋白Marker；1：菌體超聲破碎后離心沉淀；2：菌體超聲破碎后離心上清；3：蛋白過柱流穿液；4-8：親和層析純化后的VHHcap蛋白M: Protein Marker; 1: precipitation after ultrasonication of induced vhhcap-pCold-SUMO/BL21;2: supernatant after ultrasonication of induced vhhcap-pCold-SUMO/BL21;3: flow-through of supernatant of cell lysate during loading;4-8: VHHcap recombinant protein after affinity purification圖4 VHHcap-pCold-SUMO重組蛋白純化結(jié)果SDS-PAGE分析Fig 4 SDS-PAGE analysis of VHHcap-pCold-SUMO recombinant protein after purification

M：蛋白Marker；1：菌體超聲破碎后離心沉淀；2：菌體超聲破碎后離心上清；3：蛋白過柱流穿液；4-11：親和層析純化后的VHHcap蛋白M: Protein Marker; 1: precipitation after ultrasonication of induced vhhcap-pET32a(+)/BL21;2: supernatant after ultrasonication of induced vhhcap-pET32a(+)/BL21；3: flow-through of supernatant of cell lysate during loading;4-11: VHHcap recombinant protein after affinity purification圖5 VHHcap-pET32a(+)重組蛋白純化結(jié)果SDS-PAGE分析Fig 5 SDS-PAGE analysis of VHHcap-pET32a(+) recombinant protein after purification

圖7 不同載體表達的VHHcap ELISA反應(yīng)效價鑒定Fig 7 ELISA titer identification of VHHcap expressed by different vector

2.4 Western blotting分析 將純化后的VHHcap-pCold-SUMO和VHHcap-pET32a(+)納米抗體重組蛋白分別進行Western blotting分析，結(jié)果顯示，兩種原核表達載體表達的VHHcap納米抗體重組蛋白與抗His單克隆抗體反應(yīng)活性良好，VHHcap-pCold-SUMO在約30 ku處可見一條明顯的條帶(圖6，泳道2)，VHHcap-pET32a(+)重組蛋白條帶大小約35 ku(圖6，泳道1、3和4)，蛋白條帶位置與SDS-PAGE結(jié)果一致，進一步確認純化后的蛋白為含His-Tag的VHHcap納米抗體重組蛋白，同時也表明可以利用His-Tag通過間接ELISA方法測定重組納米抗體的反應(yīng)活性。

M：預染蛋白Marker；1：VHHcap-pET32a(+)重組蛋白；2：VHHcap-pCold-SUMO重組蛋白；3-4：VHHcap-pET32a(+)重組蛋白；5：陰性對照M:prestained Marker;1:VHHcap-pET32a(+)recombinant nanobody;2: VHHcap-pCold-SUMO recombinant nanobody;3-4: VHHcap-pET32a(+) recombinant nanobody;5: Negtive control圖6 VHHcap納米抗體重組蛋白Western blotting分析Fig 6 Western blotting analysis of VHHcap recombinant protein

2.5 不同表達載體對VHHcap納米抗體活性的影響純化后的VHHcap-pCold-SUMO和VHHcap-pET32a(+)重組蛋白分別經(jīng)BCA方法測定濃度，并將兩種重組蛋白調(diào)整至相同初始濃度水平后再進行梯度稀釋，然后與固相包被的Cap蛋白進行抗體—抗原反應(yīng)。以O(shè)D450大于陰性對照吸光值3倍以上作為陽性判定標準，間接ELISA試驗結(jié)果顯示，VHHcap-pCold-SUMO納米抗體重組蛋白ELISA效價為1∶500，而VHHcap-pET32a(+)納米抗體重組蛋白效價為1∶250(圖7)。相同濃度水平下VHHcap-pCold-SUMO重組蛋白的效價水平均高于VHHcap-pET32a(+)重組蛋白，推測不同原核表達載體可能對納米抗體重組蛋白與抗原的結(jié)合活性產(chǎn)生影響。

3 討論與結(jié)論

PCV2導致的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1, 14]，因此建立高效的PCV2診斷和治療方法對該病毒的綜合防控具有重要意義。納米抗體技術(shù)的發(fā)展為PCV2的檢測與治療提供了有力工具。納米抗體相對分子質(zhì)量更小[15]的特點使其能夠識別傳統(tǒng)全分子抗體無法識別的隱蔽表位或小表位；同時，納米抗體對熱和酸堿有更強的抵抗力，穩(wěn)定性更強[16]，克服了傳統(tǒng)抗體在使用過程中必須低溫存儲的劣勢。將高密度納米抗體固定于固相載體，良好的特異性使其具有避開復雜樣本中的干擾因素結(jié)合更多配體的能力[17]，能夠捕捉微量抗原，可以極大提高檢測的靈敏度。

本研究利用原核表達系統(tǒng)對PCV2 Cap特異性納米抗體進行了表達制備，并比較了兩種不同原核表達載體對納米抗體ELISA效價的影響。結(jié)果顯示，該納米抗體片段在pCold-SUMO和pET32a(+)載體中均為可溶性表達，但兩種不同載體表達的納米抗體重組蛋白的ELISA效價存在差異：相同濃度條件下，VHHcap-pCold-SUMO重組蛋白的ELISA效價大于VHHcap-pET32a(+)重組蛋白。本研究中兩種載體表達的納米抗體重組蛋白均通過His標簽進行純化，SUMO蛋白作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，能夠促進靶蛋白的正確折疊、提高重組蛋白的可溶性。有研究表明SUMO標簽與MBP和His標簽相比更適合作為納米抗體原核表達的標簽[18]，本研究得到的結(jié)果與之相符。

由于納米抗體基因為真核序列，利用大腸埃希菌表達納米抗體基因過程中，大腸埃希菌與真核生物在密碼子偏好性方面的差異可能導致納米抗體重組蛋白不能正常表達。例如李玲霞等[19]利用大腸埃希菌表達抗CD133納米抗體過程中多個納米抗體序列未能表達，而馮凡等[20]利用大腸埃希菌表達了抗黃曲霉素B1獨特型納米抗體，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。本研究過程中也出現(xiàn)Cap蛋白特異性納米抗體序列未能表達的現(xiàn)象，對于這部分納米抗體序列，可以嘗試通過密碼子優(yōu)化的方法使其正確表達。另外，從Cap特異性納米抗體的ELISA反應(yīng)效價來看，本研究制備的納米抗體效價最高僅能到1∶500，后續(xù)研究需要進一步對淘洗出的納米抗體序列進行表達與活性篩選，并將其制備成雙價或多價納米抗體，以進一步提高其親和活性。

總之，納米抗體由于其分子量小、特異性強、穩(wěn)定性好、免疫原性低等獨特優(yōu)勢，在疾病檢測和治療等方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[21]，而在畜牧獸醫(yī)及食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用則剛處于起步階段。本研究通過大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)實現(xiàn)了PCV2 Cap蛋白特異性納米抗體的高效可溶性表達，為PCV2的檢測及治療提供了新型抗體工具。