miR-410在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義

嚴(yán)宏 嚴(yán)華

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)是常見婦科惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率不斷上升，且呈年輕化趨勢[1]。EC晚期患者生存率較低，預(yù)后較差，由于發(fā)病機制尚不清楚，因此其早期診斷及預(yù)后的分子生物標(biāo)記具有十分重要的意義。miRNA廣泛存在于生物體內(nèi)，與細(xì)胞增殖、分化及凋亡有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與乳腺癌[2]、EC[3]等惡性腫瘤中異常表達(dá)，可能發(fā)揮促癌或抑癌基因作用。吳松麗等[4,5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a、miR-205在EC腫瘤組織中異常表達(dá)，可能與EC發(fā)生發(fā)展有關(guān)。miR-410作為miRNA家族重要成員，可能與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、細(xì)胞侵襲等功能有關(guān)，已有研究顯示，其在胃癌[6]、乳腺癌[7]腫瘤組織中低表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但目前關(guān)于miR-410在EC中的相關(guān)研究較少，本研究旨在通過檢測miR-410在EC腫瘤組織中表達(dá)水平，研究其臨床意義，為EC患者預(yù)后判斷尋找分子生物標(biāo)記。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年6月至2013年6月我院確診并進(jìn)行手術(shù)的EC患者62例為研究對象，年齡31～72歲，平均年齡(52.18±12.46)歲；病理分期：Ⅰ期40例，Ⅱ期12例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例；病理分類：Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌51例，Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌11例。選取同期因子宮內(nèi)膜增生行手術(shù)的患者60例為對照組，年齡32～70歲，平均年齡(51.43±11.28)歲。2組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)病理診斷為EC患者，符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②患者臨床資料完整；③患者配合治療及術(shù)后隨訪工作；④患者及家屬知情且簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝、腎及其他臟器疾病患者；②近期進(jìn)行放、化療等抗癌治療患者；③嚴(yán)重全身免疫性疾病患者；④合并其他腫瘤患者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集:所有患者均于術(shù)中采取組織樣本，立即放入液氮中保存，后轉(zhuǎn)入-80℃長期保存，待所有樣本采集完畢后統(tǒng)一檢測。

1.3.2 子宮內(nèi)膜組織中miR-410表達(dá)水平檢測:從-80℃中取出待檢組織，利用TRIZOL法提取總RNA，檢測合格后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。后利用實時定量PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)檢測試劑盒檢測子宮內(nèi)膜組織中miR-410表達(dá)水平，內(nèi)參基因為U6基因，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，檢測試劑盒均購自Applied Biosystens公司。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μl：正向引物1 μl，反向引物1 μl，cDNA 1 μl，SYBR Advantage Premix(2×)10 μl，ddH2O 7 μl。反應(yīng)條件：95℃ 15 min，94℃變性15 s，55℃延伸30 s，70℃退火30 s，共40個循環(huán)。相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCT法計算。引物交由上海生工生物工程公司合成。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)-16及其組織抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-2蛋白表達(dá)情況:研磨子宮內(nèi)膜組織樣本，加入蛋白裂解液，提取所有研究樣本中總蛋白，采用Western blot法，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，檢測組織中MMP-16和TIMP-2蛋白水平。

1.4 隨訪 以手術(shù)日期為起點，隨訪終點：患者死亡或2018年6月30日，術(shù)后1年內(nèi)每3個月進(jìn)行1次隨訪，術(shù)后2～3年內(nèi)每6個月隨訪1次，3年以后，每年隨訪1次。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜組織中miR-410表達(dá)情況 EC患者腫瘤組織中miR-410較對照組織顯著低表達(dá)(P<0.05)。見表2。

2.2 MMP16和TIMP2蛋白表達(dá)情況 與對照組織比較，EC患者腫瘤組織中MMP16蛋白表達(dá)明顯升高，TIMP2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖1，表3。

組別miR-410對照組織(n=60)0.62±0.12EC組織(n=62) 0.29±0.08t值17.926P值0.000

圖1 組織中MMP-16和TIMP-2蛋白表達(dá)情況

表3 組織中MMP-16和TIMP-2蛋白表達(dá)情況

2.3 EC腫瘤組織miR-410表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)miR-410在EC患者腫瘤組織中平均表達(dá)水平為界，將患者分為miR-410高表達(dá)組30例，低表達(dá)組32例，分析miR-410表達(dá)水平與EC臨床病理特征的關(guān)系。腫瘤組織中miR-410表達(dá)水平與EC患者年齡無關(guān)(P>0.05)，與病理分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤程度有關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 腫瘤組織LncRNA AFAP1-AS1表達(dá)水平與EC患者臨床特征的關(guān)系 例

2.4 腫瘤組織miR-410表達(dá)情況與EC患者預(yù)后的關(guān)系 術(shù)后5年，共有50名患者幸存，其余12名患者死亡，總生存率為80.65%。Kaplan-Meier生存分析表明，miR-410高表達(dá)患者5年總生存率為93.33%，顯著高于miR-410低表達(dá)者68.75%(=6.202，P<0.05)。見圖2。

圖2 腫瘤組織miR-410表達(dá)情況與EC患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 影響EC患者不良預(yù)后的危險因素分析結(jié)果 多因素分析表明，高手術(shù)分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高肌層浸潤程度、miR-410低表達(dá)是影響患者不良預(yù)后的獨立危險因素(HR=2.816，95%CI為1.392～5.695；HR=1.785，95%CI為1.380～2.308；HR=2.941，95%CI為1.163～7.435；HR=2.119，95%CI為1.457～3.083；P均<0.05)。見表5。

表5 影響EC患者不良預(yù)后的危險因素分析

3 討論

在近年來研究中，miRNA被視為潛在檢測和預(yù)后的生物標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于臨床研究中。miRNA通過與靶基因的3’非編碼區(qū)的互補堿基結(jié)合，通過抑制基因翻譯或降解mRNA，負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)。miRNA已逐漸成為多種癌癥的診斷和預(yù)后生物標(biāo)記分子，其異常表達(dá)參與人類多種惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展，與肺癌[9]、前列腺癌[10]、結(jié)直腸癌[11]等多種疾病關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在EC腫瘤組織中異常表達(dá)，可能與EC腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]。miR-410參與多種細(xì)胞的生理過程，與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有關(guān)，可能作為腫瘤啟動子或抑制子參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。miR-410在前列腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，且其低表達(dá)可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[12]。另有研究表明，miR-410高表達(dá)可能提高晚期漿液性卵巢癌患者的生存率，與患者預(yù)后關(guān)系密切[13]。本研究結(jié)果顯示，EC腫瘤組織中miR-410表達(dá)水平較正常子宮內(nèi)膜組織顯著降低，可能與EC發(fā)生有關(guān)。MMP及TIMP之間的平衡可調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)成分合成、降解。張艷慧等[14]研究顯示，MMP在正常組織中無表達(dá)或低表達(dá)，惡性腫瘤組織中高表達(dá)。Gershtein等[15]報道，MMP-7在EC腫瘤組織中高表達(dá)，且隨病理分級增加而升高，提示其可能與EC發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究表明，miR-410可靶向調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌中MMP-16和TIMP-2基因表達(dá)，進(jìn)而影響疾病發(fā)生發(fā)展[16]。本研究結(jié)果表明，與對照組織比較，EC患者腫瘤組織中MMP-16蛋白高表達(dá)，TIMP-2蛋白低表達(dá)，提示miR-410可能通過調(diào)節(jié)MMP-16、TIMP-2蛋白參與EC疾病發(fā)生發(fā)展。

進(jìn)一步研究結(jié)果表明，EC患者腫瘤組織中miR-410表達(dá)水平與患者年齡無關(guān)，與病理分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤程度有關(guān)，提示miR-410可能在EC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Kaplan-Meier生存分析表明，miR-410高表達(dá)患者5年總生存率顯著高于miR-410低表達(dá)者，提示miR-410低表達(dá)可能與EC患者不良預(yù)后有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，高手術(shù)分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高肌層浸潤程度、miR-410低表達(dá)是影響患者不良預(yù)后的獨立危險因素，提示應(yīng)對具備該類特征的患者加強監(jiān)測，調(diào)整治療方案，提高患者生存率。

已有研究檢測結(jié)果顯示，miRNA可作用于多種信號通路，參與腫瘤的發(fā)生及化療耐藥的發(fā)生發(fā)展，提示其可能在腫瘤中發(fā)揮重要作用[17]。miR-410在不同腫瘤中發(fā)揮的作用可能不同。劉行仁等[18]研究結(jié)果顯示，miR-410可通過靶向調(diào)節(jié)Snail基因抑制乳腺癌、胃癌等疾病進(jìn)展。Snail可降低細(xì)胞間粘附力，誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移，而浸潤和轉(zhuǎn)移往往是腫瘤發(fā)生的首發(fā)步驟。Zhang等[6]研究顯示，miR-410可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用。目前關(guān)于miR-410在EC中的具體作用機制尚不完全清楚，應(yīng)在后續(xù)實驗中進(jìn)一步探索。

綜上所述，乳腺癌腫瘤組織中miR-410低表達(dá)，其表達(dá)水平與EC患者病理分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤程度有關(guān)，是影響患者不良預(yù)后的獨立危險因素之一，可能用于評估EC患者預(yù)后情況。本研究不足之處，本案研究只在臨床水平對EC組織中miR-410表達(dá)情況進(jìn)行分析，其與EC發(fā)病有關(guān)的具體機制尚不清楚，將在后續(xù)研究中從細(xì)胞水平進(jìn)一步分析miR-410在EC疾病中的作用機制。