三氧化二砷誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266自噬及凋亡作用研究

謝佳 張曉波 溫靜 王浩 任婧婧 李光 張韻潔 宋艷萍

多發(fā)性骨髓瘤是以惡性漿細(xì)胞克隆性增殖為特點的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，盡管新一代蛋白酶體抑制劑和免疫調(diào)節(jié)衍生物的出現(xiàn)使得多發(fā)性骨髓瘤治療取得一定發(fā)展，但由于其克隆異質(zhì)性及其周圍骨髓微環(huán)境的相互作用，治療后出現(xiàn)耐藥的幾率仍然較高[1,2]。此外。藥物毒性作用所致的相關(guān)的疾病如感染和神經(jīng)病變，也降低了患者生活質(zhì)量。故而，探討高效、低毒的抗骨髓瘤藥物在臨床上具有重要的臨床意義。三氧化二砷(As2O3)作為藥物用于治療疾病已具有上千年歷史，也逐漸開始應(yīng)用于腫瘤治療。20世紀(jì)90年代研究發(fā)現(xiàn)As2O3砷沒有嚴(yán)重的骨髓抑制毒性并對急性早幼粒細(xì)胞白血病有極好的療效[3]。最新的研究也發(fā)現(xiàn)As2O3具有一定的抗多發(fā)性骨髓瘤的作用，具有用于復(fù)發(fā)難治患者的治療潛力但具體的相關(guān)機制尚不明晰[4,5]。故而，本研究探討了As2O3誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266自噬及凋亡的作用，旨在為臨床As2O3治療多發(fā)現(xiàn)骨髓瘤提供數(shù)據(jù)參考，報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 選取多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞，購自上海賽默爾飛生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞株復(fù)蘇，胎牛血清(15%)的培養(yǎng)液中重懸，5%CO2、37℃的飽和濕度培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法:每孔2×105/m密度接種于96孔板，每孔培養(yǎng)液200 μl過夜后分別加入三氧化二砷，調(diào)整濃度為0.3 μg/ml、0.6 μg/ml、1.2 μg/ml As2O3，對照組加入0.9%氯化鈉溶液，分別于0、24、48級72 h加入20 μl/孔的MTT，離心后棄上清液，加入150 μl/孔的二甲亞砜，酶聯(lián)免疫法讀取酶標(biāo)儀490 nm處吸光度，每組設(shè)4個相同條件的平行孔，3次重復(fù)試驗。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測:取0.5 ml對數(shù)生長期U266細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106/ml并接種于24孔板。實驗分為對照組和0.3 μg/ml、0.6 μg/ml、1.2 μg/ml As2O3，共計4組，每組3個平行復(fù)孔。常規(guī)24 h培養(yǎng)后離心細(xì)胞并洗滌，加入Annexin V-FITC和PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，每組3次重復(fù)實驗。

1.2.4 透射電鏡觀察:收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心后棄上清，多聚甲醛(4%)冰箱(4℃)2 h固定，次砷酸鹽洗去多聚甲醛，餓酸室(1%)室溫1 h固定；乙醇梯度脫水后標(biāo)本樹脂包埋，常規(guī)切片，酸鈾酰/檸檬酸鉛染色后透射電鏡觀察細(xì)胞自噬情況。

1.2.5 Western blot檢測:取2 ml對數(shù)生長期U266細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106/ml并接種于6孔板，分為對照組和0.3 μg/ml、0.6 μg/ml、1.2 μg/ml As2O3共4組，24 h作用后提取細(xì)胞蛋白；50 g蛋白上樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜后，GAPDH抗體及LC3B抗體4℃孵育過夜；二抗加入后顯色劑顯色。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 隨As2O3濃度增加，U266細(xì)胞增殖抑制情況越嚴(yán)重，1.2 μg/ml組培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時OD值明顯低于0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組和對照組(P<0.05)。見表1，圖1。

組別0h24h48h72h對照組 0.278±0.0820.562±0.1000.781±0.1121.133±0.1210.3μg/ml組0.279±0.0810.483±0.102?0.688±0.104?0.811±0.143?0.6μg/ml組0.275±0.0900.432±0.092?#0.612±0.107?#0.732±0.130?#1.2μg/ml組0.276±0.0930.382±0.097?#△0.534±0.111?#△0.604±0.121?#△F值2.0118.92110.03213.201P值0.4330.0000.0000.000

注：與對照組比較,*P<0.05；與0.3 μg/ml組比較,#P<0.05；與0.6 μg/ml組比較,△P<0.05

圖1 4組細(xì)胞不同培養(yǎng)時間OD值趨勢圖

2.2 4組細(xì)胞凋亡率比較 0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組、1.2 μg/ml組細(xì)胞凋亡率高于對照組(P<0.05)，其中1.2 μg/ml組細(xì)胞凋亡率明顯高于0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組(P<0.05)。見表2。

2.3 4組細(xì)胞自噬情況 對照組細(xì)胞內(nèi)自噬體無或很少，其中0.6 μg/ml組、1.2 μg/ml組有較強的自噬反應(yīng)，可見包漿具有雙層或多層膜的泡狀結(jié)構(gòu)，有大量細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，即特征性的自噬小體，其中1.2 μg/ml組最多。見圖2、3。

組別細(xì)胞凋亡率F值P值對照組 3.02±0.9265.5950.0000.3μg/ml組9.10±1.03?0.6μg/ml組16.50±2.82?#1.2μg/ml組25.43±3.88?#△

注：與對照組比較,*P<0.05；與0.3 μg/ml組比較,#P<0.05；與0.6 μg/ml組比較,△P<0.05

2.4 4組細(xì)胞蛋白表達(dá)比較 0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組、1.2 μg/ml組Beclin-1相對表達(dá)量高于對照組(P<0.05)，而Caspase-3、Bcl-2相對表達(dá)量低于對照組(P<0.05)，其中1.2 μg/ml組Beclin-1相對表達(dá)量高于0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組(P<0.05)，而Caspase-3、Bcl-2相對表達(dá)量低于0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組(P<0.05)。見表3,圖4。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測;A 對照組；B 0.3 μg/ml組；C 0.6 μg/ml組；D 1.2 μg/ml組)

圖3 透射電鏡圖(×25,000);A 對照組；B 0.3 μg/ml組；C 0.6 μg/ml組；D 1.2 μg/ml組

組別Beclin-1相對表達(dá)量Caspase-3相對表達(dá)量Bcl-2相對表達(dá)量對照組 0.201±0.0900.921±0.1040.602±0.1050.3μg/ml組0.411±0.100?0.833±0.112?0.442±0.101?0.6μg/ml組0.520±0.108?#0.334±0.092?#0.402±0.105?#1.2μg/ml組0.592±0.098?#△0.200±0.093?#△0.232±0.108?#△F值8.20110.20112.201P值0.0000.0000.000

注：與對照組比較,*P<0.05；與0.3 μg/ml組比較,#P<0.05；與0.6 μg/ml組比較,△P<0.05

圖4 Western blot檢測圖;1：對照組；2：0.3 μg/ml組；3：0.6 μg/ml組；4：1.2 μg/ml組

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤屬來源于終末分化的 B 淋巴細(xì)胞惡性腫瘤，是漿細(xì)胞克隆性增殖性疾病，流行病學(xué)研究提示多發(fā)性骨髓瘤，發(fā)生率已超過急性白血病，在血液系統(tǒng)腫瘤中占15%左右，僅次于非霍奇金淋巴瘤[6,7]。多發(fā)性骨髓瘤現(xiàn)臨床的治療手段主要包括蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、糖皮質(zhì)激素聯(lián)合或不聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物及自體造血干細(xì)胞移植治療。但多發(fā)性骨髓瘤尚無法治愈并具有較高復(fù)發(fā)率，屬于威脅中老年患者生命安全的重要疾病[8-10]。故而，探索 多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制并探尋新的治療方法具有較高的臨床意義。

As2O3是傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，目前已成功地應(yīng)用于臨床，在急性早幼粒細(xì)胞性白血病的治療上顯示出廣闊的應(yīng)用前景并隨著研究的不斷深入，許多學(xué)者證明As2O3具有良好的抗腫瘤作用,已被廣泛應(yīng)用于白血病、骨髓瘤、乳腺癌、等腫瘤的治療，但As2O3治療MM 的具體機制尚未完全闡明[11-14]。

本研究結(jié)果顯示隨As2O3濃度增加，U266細(xì)胞增殖抑制情況越嚴(yán)重，1.2 μg/ml組培養(yǎng)24 h、48 h和72 h 時OD值明顯低于0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組和對照組；0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組、1.2 μg/ml組細(xì)胞凋亡率高于對照組；其中1.2 μg/ml組細(xì)胞凋亡率明顯高于0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組。上述結(jié)果提示As2O3具有較強的細(xì)胞增殖抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用并對濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制及促細(xì)胞凋亡作用越強。文獻(xiàn)提示白介素-6是調(diào)節(jié)多發(fā)現(xiàn)骨髓瘤的關(guān)鍵因子，可抑制地塞米松誘導(dǎo)的凋亡并刺激細(xì)胞增殖，而As2O3不僅能夠抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的黏附作用而抑制IL-6的生成，As2O3還可通過介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶刺激因子等而抑制多發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡；此外，As2O3可以抑制端粒酶活性而端粒酶具有抗凋亡作用，抑制其活性可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，但具體機制還有待進(jìn)一步研究證實[15-17]。

自噬與凋亡共同參與了細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的維持和疾病發(fā)生過程，相關(guān)作用機制之間也存在較多重疊的部分。本研究結(jié)果顯示對照組細(xì)胞內(nèi)自噬體無或很少，其中0.6 μg/ml組、1.2 μg/ml組有較強的自噬反應(yīng)，可見包漿具有雙層或多層膜的泡狀結(jié)構(gòu)，有大量細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，即特征性的自噬小體，其中1.2 μg/ml組最多。該結(jié)果提示As2O3可能在誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266自噬的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。As2O3的刺激下,可以開放線粒體滲透性轉(zhuǎn)運通道，減低內(nèi)外膜電位，細(xì)胞啟動自噬清除受損的線粒體,，進(jìn)而提高正常細(xì)胞對低氧的耐受力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[18]。

相關(guān)蛋白研究結(jié)果顯示0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組、1.2 μg/ml組Beclin-1相對表達(dá)量高于對照組，而Caspase-3、Bcl-2相對表達(dá)量低于對照組，其中1.2 μg/ml組Beclin-1相對表達(dá)量高于0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組，而Caspase-3、Bcl-2相對表達(dá)量低于0.3 μg/ml組、0.6 μg/ml組。上述結(jié)果提示As2O3可能是通過Beclin-1、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)而介導(dǎo)發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266自噬及凋亡。文獻(xiàn)提示提示As2O3抗腫瘤作用較為復(fù)雜，其可激活caspase家族并通過破壞線粒體跨膜電位，觸發(fā)線粒體途徑，導(dǎo)致caspase-3活化，促使細(xì)胞凋亡；bcl-2的下調(diào)會導(dǎo)致凋亡的發(fā)生，而As2O3可通過下調(diào)bcl-xl，bcl-2的表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[19,20]。此外，As2O3能夠活化Beclin-1并又可通過與線粒體巰基形成復(fù)合物而降低GSH的活性等途徑使ROS清除減少，最終誘導(dǎo)腫瘤凋亡。

本研究通過觀察不同濃度As2O3作用不同時間對骨髓瘤細(xì)胞U266 生長的影響并對其誘導(dǎo)的自噬和凋亡的關(guān)系進(jìn)行初步探討，可以為As2O3的臨床治療提供一定指導(dǎo)。綜上所述，As2O3誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266自噬及凋亡，存在劑量依賴關(guān)系，可能與調(diào)控Beclin-1、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。