IL-27在重癥肌無力患者血清中的表達及與AChR抗體的相關(guān)性分析

馮蘇 潘婧 梁翠娟 趙東蘭

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2015年1月至2016年12月收治的109例MG患者(MG組)，其中男53例，女56例；平均年齡(48.46±6.32)歲。MG患者按照疾病類型按照以下幾種分組方法：分為眼肌型和全身型；根據(jù)CT結(jié)果或病理表現(xiàn)分為無胸腺異常、胸腺瘤和胸腺增生；胸腺異常的AChR抗體陽性與陰性組MG患者；發(fā)病年齡≤50歲為早發(fā)病期的Mg患者和患者發(fā)病年齡>50歲為晚發(fā)病期的Mg患者[11]。選取115例同期在本院進行健康體檢的表觀健康者作為健康對照組，排除自身免疫性疾病、癌癥和感染性疾病的歷史，其中男54例，女61例；年齡25～50歲，平均年齡(46.20±4.36)歲。2組患者年齡、性別比及病情等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入組與排除標(biāo)準(zhǔn) 入組標(biāo)準(zhǔn)(4個標(biāo)準(zhǔn)中的任何2項，但必須包括標(biāo)準(zhǔn)1)：(1)波動性疲乏和疲勞；(2)重復(fù)神經(jīng)刺激試驗；(3)抗膽堿酯酶藥物敏感；(4)抗乙酰膽堿受體結(jié)合或阻斷抗體。排除免疫抑制治療史的患者。

1.3 標(biāo)本采集 早晨空腹時無菌采集肘靜脈血5 ml，用肝素對靜脈血抗凝并搖勻，3 000 r/min低溫離心10 min，分離上層血清置于EP管中于-80℃冰箱中保存，并于測定時恢復(fù)室溫通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清IL-27濃度水平。

1.4 所用試劑及檢測方法 欣博盛 QuantiCyto ELISA試劑盒(試劑批號：H180608-014a)采用雙抗體夾心法：抗人IL-27單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的人IL-27會與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-27抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合；抗人IL-27抗體與結(jié)合在單抗上的人IL-27結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有人IL-27，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑呈現(xiàn)藍色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值，人IL-27濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中人血清IL-27的濃度。

1.5 治療方法 MG患者給予糖皮質(zhì)激素中等劑量沖擊并小劑量維持治療。開始時予醋酸潑尼松1 mg/kg,口服，1次/d。4～8周后待癥狀緩解后減量至原量的2/3，從每日頓服到隔日清晨頓服，后每2～4周減量 2.5～5.0 mg，直到減至能控制癥狀的最小有效劑量 5～15 mg/d維持，每日或隔日清晨頓服。療程為6個月。

2 結(jié)果

2.1 健康對照組和MG組血清中IL-27水平比較 MG組的血清IL-27水平為(282.02±81.03)pg/ml，顯著高于健康對照組(206.91±31.84)pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

組別IL-27健康對照組(n=115)206.91±31.84MG組(n=109) 282.02±81.03?

注：與健康對照組比較，*P<0.001

2.2 不同MG患者分組的血清IL-27水平比較 在36例眼肌型和73例全身型MG患者中，血清IL-27濃度水平分別為(228.33±56.26)pg/ml和(307.46±62.79)pg/ml。全身型MG患者的血清IL-27水平顯著高于對照組(P<0.05)。其中77%的MG患者血清中AChR抗體陽性(80/104，5例患者未進行抗體測試)，其血清IL-27濃度水平為(292.35±74.28)pg/ml，血清AChR抗體陰性患者血清IL-27濃度水平為(277.93±80.15)pg/ml，AChR抗體陽性的MG患者與健康對照組的IL-27濃度水平有差異(P<0.05)。當(dāng)MG患者按年齡分類時，72例早發(fā)病和37例晚發(fā)病MG患者的血清IL-27水平分別為(392.80±106.56)pg/ml和(217.45±43.84)pg/ml，早發(fā)病MG患者的血清IL-27水平顯著高于健康對照組(P<0.001)，而晚發(fā)病MG患者的水平與健康對照組無差異(P>0.05)。見表2。

2.3 不同胸腺狀態(tài)的MG患者血清IL-27水平 109例MG患者中有20例患有胸腺瘤，12例MG患者同時患有胸腺增生，2組MG患者血清IL-27濃度水平分別為(237.52±29.98)pg/ml和(951.57±237.04)pg/ml，而另外67名沒有胸部CT異常的患者血清IL-27水平為(301.58±53.86)pg/ml。因此，無胸腺異常和胸腺增生患者的IL-27濃度水平均明顯升高，且具有顯著性差異(P<0.001)，但胸腺增生的MG患者血清IL-27濃度水平尤其升高明顯。見表3。

MG患者分組血清IL-27水平眼肌型(n=36)228.33±56.26全身型(n=73)307.46±62.79?AChR抗體(-)(n=24)277.93±80.15AChR抗體(+)(n=80)292.35±74.28?早發(fā)病(n=72)392.80±106.56#晚發(fā)病(n=37)217.45±43.84

注：與眼肌型和AChR抗體(-)比較，*P<0.05；與晚發(fā)病比較，#P<0.01

胸腺狀態(tài)血清IL-27水平無胸腺異常(n=67)301.58±53.86?胸腺瘤(n=20)237.52±29.98胸腺增生(n=12)951.57±237.04?

注：與胸腺瘤比較，*P<0.001

2.4 AChR抗體陽性的MG患者AChR抗體水平與血清IL-27濃度的相關(guān)性分析 將80例AChR抗體陽性的MG患者血清AChR抗體水平和其血清IL-27濃度水平進行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AChR抗體陽性的MG患者血清IL-27水平與AChR抗體水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.792，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖1。

圖1 AChR抗體陽性的MG患者AChR抗體水平;與血清IL-27濃度的相關(guān)性分析(r=0.792，P<0.001)

2.5 AChR抗體陽性的MG患者激素治療后血清IL-27降低水平與AChR抗體降低水平相關(guān)性分析 將53例AChR抗體陽性的MG患者激素治療后血清AChR抗體降低水平和其血清IL-27濃度降低水平進行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清IL-27降低水平與AChR抗體降低水平呈現(xiàn)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.579，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

3 討論

圖2 激素治療后MG患者AChR抗體降低水平;與血清IL-27濃度降低水平的相關(guān)性分析(r=0.579，P<0.05)

此外，本研究亞組分析顯示，廣義MG患者和早發(fā)病MG患者的血清IL-27濃度水平也明顯高于對照組(P<0.05)；而晚發(fā)病MG患者血清IL-27水平雖較健康對照組稍高，但無統(tǒng)計學(xué)意義。以上研究結(jié)果可能與機體早期抵抗抗原攻擊時，IL-27高表達并通過胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信號通路促進干擾素λ1(interferon λ1，IFN-λ1)分泌，保護機體抗炎有關(guān)[14]。

MG患者中約有10%～15%的患者合并胸腺瘤，80%的患者同時伴有淋巴濾泡增生、胸腺肥大等[15]。調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)和免疫細胞的異常募集是負責(zé)維持MG患者胸腺中AChR抗體的炎癥和免疫應(yīng)答的可能機制[16]。胸腺異常的MG患者，源自APC的IL-27誘導(dǎo)T細胞中干擾素-γ(IFN-γ)的產(chǎn)生，IFN-γ反過來對APC發(fā)揮作用并上調(diào)IL-27表達，導(dǎo)致針對胸腺肌樣細胞的自身反應(yīng)性T細胞大量增生，誘發(fā)胸腺增生或胸腺瘤，該T細胞遷移至靶器官，最終導(dǎo)致MG的發(fā)病[17]。Berrih-Aknin等已證明胸腺B細胞在AChR抗體的產(chǎn)生中具有重要作用[18]，由此推斷IL-27可能與MG早發(fā)病機制中的胸腺濾泡增生和胸腔內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)。本研究中胸腺增生的MG患者血清IL-27濃度水平明顯高于無胸腺異常組和胸腺瘤組，表明IL-27/IFN-γ可能存在永久性的炎癥閉環(huán)，導(dǎo)致胸腺濾泡的不斷增生，從而在不同的病理表現(xiàn)階段發(fā)揮促炎抗炎和抗腫瘤等作用。

MG發(fā)病機制從臨床免疫學(xué)角度理解為某些致病因子破壞機體的免疫平衡狀態(tài)，重新激活抗原特異性的T細胞，從而輔助體內(nèi)B細胞執(zhí)行體液免疫，產(chǎn)生重癥肌無力特異性抗體AChR抗體[19]。諸多證據(jù)表明，患者體內(nèi)的AChR抗體濃度即便很低，AChR抗體陰性，臨床癥狀也可有明顯表現(xiàn)，因此細胞分泌的抗AChR抗體濃度與病情嚴(yán)重程度并無關(guān)系，而同一病人血漿中抗體水平的變化卻與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果80例AChR抗體陽性的MG患者體內(nèi)IL-27濃度水平高于AChR抗體陰性患者，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)，提示IL-27可能通過調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的體液免疫和誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生的AChR抗體在MG發(fā)病中發(fā)揮作用。同時本研究數(shù)據(jù)表明，AChR抗體陽性的MG患者體內(nèi)IL-27濃度水平與其特異性抗體AChR抗體呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性(P<0.001)，即隨患者體內(nèi)IL-27濃度水平增高AChR抗體也有增高趨勢，推斷在MGAChR抗體陽性的患者體內(nèi)IL-27對其特征性抗體AChR抗體發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。糖皮質(zhì)激素治療后患者體內(nèi)IL-27濃度水平顯著降低，且其降低水平亦和AChR抗體降低水平呈現(xiàn)明顯相關(guān)性(P<0.05)。激素治療有效的機制可能是由于糖皮質(zhì)激素抑制了APC表面的CD86和CD80等共刺激分子的表達以及CD83誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-12等細胞因子的釋放，因此可認(rèn)為糖皮質(zhì)激素強烈干擾了APC的分化和成熟，從而導(dǎo)致IL-27的低表達及AChR抗體相應(yīng)濃度水平的下降[17]。

綜上，研究結(jié)果表明IL-27可能在MG免疫調(diào)節(jié)及發(fā)病機制中起重要作用，尤其在具有胸腺增生的AChR抗體陽性早發(fā)型MG亞型中更有其重要意義。通過對不同臨床表型的MG患者血清IL-27濃度水平及其與MG特征性抗體AChR抗體的相關(guān)性分析，及早抑制IL-27在MG發(fā)病機制中的異常免疫反應(yīng)，從而為MG的臨床診斷和治療提供新的思路。