椎間盤退變大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子1表達(dá)及髓核超微結(jié)構(gòu)的變化

張光志 孫衛(wèi)強(qiáng)

椎間盤退變變性的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其是幾種脊柱疾病的主要原因，對生活質(zhì)量有很大影響[1]。大部分老年人口受到不可逆轉(zhuǎn)的椎間盤退變變性的影響：大約40%<30歲的人和>90%≥55歲的人患有腰椎中度至重度的椎間盤退變變性，需要進(jìn)行基本治療[2]。治療主要局限于非甾體類抗炎藥和手術(shù)治療的癥狀緩解，因?yàn)橥嘶臋C(jī)制尚不完全清楚。加速研究和在椎間盤退變變性和下背部疼痛方面取得突破的可能步驟可能依賴于識別能力更準(zhǔn)確的動物模型[3]。在幾種動物模型中，小鼠椎間盤退變針穿刺模型已經(jīng)開發(fā)了近10種。MMP-9是屬于鋅依賴性金屬蛋白酶的酶家族的成員，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中起作用[4]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是IL-1β信號傳導(dǎo)的下游調(diào)節(jié)劑[5]。通過蛋白水解活化無活性酶原和通過金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)抑制活性形式的酶，MMP活性在基因轉(zhuǎn)錄水平上受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)[6]。TIMP是MMP的特異性抑制劑，其參與調(diào)節(jié)MMP的活性。本文研究椎間盤退變大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子1表達(dá)及髓核超微結(jié)構(gòu)的變化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 該研究中使用的動物是雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200～250 g(相當(dāng)于8～9周齡)，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 動物倫理學(xué)問題 所有實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)動物保護(hù)和使用委員會批準(zhǔn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)對象隨機(jī)被分成2組：對照組(為正常健康大鼠，做假手術(shù)處理n=10)；模型組(如前所述做椎間盤退變手術(shù)并做磁共振成像檢查n=10)；2組大鼠相同環(huán)境下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前12 h只對大鼠進(jìn)行清水飼養(yǎng)。

1.3.2 椎間盤退變大鼠模型構(gòu)建:將大鼠放置在俯臥位，并在背部進(jìn)行中線縱向切口。第四和第五腰椎之間的左小關(guān)節(jié)被移除?？梢暬疞4 DRG，L5神經(jīng)根和L4/5 IVD。將21號針頭平行插入端板，3.0 mm插入光盤，在那里保持30 s。夾子用作塞子以控制針的深度。用3-0絲線縫合肌肉，用4-0尼龍縫合線封閉皮膚邊緣。手術(shù)后1周，使用微量注射器(10 μl)通過前入路將8 μl(1.6 ng)TGF-β1注射到IVD中。手術(shù)后2周重復(fù)相同的程序。手術(shù)后0、2、4、6和8周進(jìn)行腰椎磁共振成像檢查。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附測定血清中TIMP-1和MMP-9:評估所有實(shí)驗(yàn)大鼠的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)，測量大鼠血清MMP-9水平以及TIMP-1。當(dāng)血清培養(yǎng)變?yōu)殛幮詴r，在開始抗生素治療后72 h獲得血清樣本。將樣品收集在無菌聚丙烯容器中。將等分試樣(1 ml)以4 000 g離心10 min，將上清液部分儲存在-80℃直至分析。根據(jù)制造商的說明，通過酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定血清中MMP-9和TIMP-1的水平。在450 nm處獲得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度值，并比較每個測定法構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線并用于最小化測定間變異。濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線外推并以ng/ml表示。MMP-9和TIMP-1的檢測下限為0.05 ng/ml。為了避免任何偏差，所有樣品一式兩份，以盲法分析，在96孔微量培養(yǎng)板上使用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品。

1.4.2 RNA提取和實(shí)時PCR分析:使用實(shí)時PCR技術(shù)分析MMP-9和TIMP-1基因在ANG處理中的表達(dá)。使用FAST Pure RNA提取試劑盒從細(xì)胞沉淀中分離RNA。使用Primescript RT酶將來自每個樣品的1 μg總RNA用于cDNA合成。使用RTPrimer數(shù)據(jù)庫中引用的特異性引物對和Taqman探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Rotor-gene 6000熱循環(huán)儀進(jìn)行反應(yīng)。穿梭PCR條件如下：在95℃下變性10 s和在59、60和62℃下退火/延伸40周期后，在95℃下初始變性15 s(對于TIMP-1，MMP-9和分別為GAPDH)25 s。針對β-actin表達(dá)對靶基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并基于ΔΔCt計(jì)算進(jìn)行相對定量分析。還通過Rotor-gene 6000軟件進(jìn)行解鏈曲線分析以確保有利序列的特異性擴(kuò)增。用于PCR反應(yīng)的引物如下。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡分析:樣本處理后立即將細(xì)胞置于冰上，并用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次。將細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解，并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce，Billings，MT，USA)通過BCA測定提取和定量總蛋白質(zhì)。通過10%SDS-PAGE分離總細(xì)胞蛋白(每孔20 μg)，然后通過電印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，Boston，MA，USA)。將膜用含有TBST的5%脫脂奶粉封閉，并在4℃下與以下一抗孵育過夜：抗ERK1/2抗體(1∶1 000)，抗-phospho-ERK1/2抗體(1∶1 000)和抗GAPDH抗體(CST)。用TBST洗滌后，將膜與抗兔或抗大鼠HRP偶聯(lián)的第二抗體一起溫育，隨后用ECL Plus試劑(Millipore)檢測。使用多規(guī)格光密度測定系統(tǒng)量化該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

1.4.4 CCL3和CCL4的IHC染色:進(jìn)行IHC染色以確定2組CCL3和CCL4表達(dá)水平。手術(shù)后3周進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查。解剖方案類似于我們先前研究中使用的方案。然后，將切片與兔抗大鼠多克隆CCL3抗體(1∶200稀釋)一起孵育。兔多克隆CCL4抗體(1∶200稀釋)，然后是生物素化的山羊抗兔IgG抗血清(1∶200稀釋)。洗滌后，將切片與生物素標(biāo)記的兔抗山羊抗體在室溫下孵育15 min，隨后與鏈霉抗生物素蛋白綴合的辣根過氧化物酶一起溫育。將切片進(jìn)一步與2,4-二氨基酸一起溫育。用附著在CCD點(diǎn)照相機(jī)上的熒光顯微鏡捕獲染色切片的圖像，并用Leica IM50軟件處理。

1.4.5 大鼠髓核細(xì)胞凋亡率測定:CCK-8測定用于細(xì)胞活力評估。將細(xì)胞以每孔2×104個細(xì)胞的懸浮液轉(zhuǎn)移到96孔鏗俛tbottomed微孔板中。溫育24 h后，分別用含有H2O2，COS或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;對照組)的DMEM/F-12替換培養(yǎng)基。分別用100,200,300和400 mmol/L H2O2處理細(xì)胞，不含COS，或300 mmol/L H2O2以及不同濃度的殼聚糖寡糖(50、100、200 mg/ml)。向含有100 ml DMEM/F-12的每個孔中加入10 ml CCK-8試劑以分析細(xì)胞增殖。然后將板在37℃下孵育2 h。使用EL 800 Absorbance Microplate Reader(BioTek Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA)在450 nm 波長的光下測量光密度。細(xì)胞活力計(jì)算公式如下：細(xì)胞活力(對照的%)=[(Ae Ab)/(Ac Ab)]100。Ae，Ab和Ac分別代表實(shí)驗(yàn)，空白和對照組的A450。還通過上述方法檢測COS對細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地一式三份進(jìn)行。用雙激光流式細(xì)胞儀分析凋亡程度。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清TIMP-1和MMP-9含量測定 2組大鼠清液以及血漿樣品進(jìn)行TIMP-1和MMP-9酶聯(lián)免疫吸附測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組的TIMP-1血漿水平相比，模型組含量上升，在MMP-9的含量檢測上發(fā)現(xiàn)模型組較對照組含量升高，2組指標(biāo)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2 RNA提取和實(shí)時PCR分析 通過RT-qPCR分析測定2組大鼠中TIMP-1和MMP-9 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組TIMP-1和MMP-9 mRNA的表達(dá)上升，炎性反應(yīng)加重，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

組別MMP-9TIMP-1對照組82.18±4.2635.43±5.28模型組237.54±1.2783.16±4.36t值5.5274.196P值0.0240.037

組別MMP-9mRNATIMP-1mRNA對照組1.37±0.011.24±0.23模型組2.37±0.153.05±0.05t值3.3253.766P值0.0030.028

2.3 大鼠炎性因子蛋白表達(dá)情況 通過蛋白質(zhì)免疫印跡，檢測2組大鼠炎性因子IL-1β和IL-6及TNF-α的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組IL-1β和IL-6及TNF-α的蛋白表達(dá)上升，炎性反應(yīng)加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

組別IL-1βIL-6TNF-α對照組1.53±0.021.36±0.051.27±0.03模型組3.12±0.172.94±0.032.76±0.18t值3.2564.1771.703P值0.0140.0210.006

2.4 CCL3和CCL4的IHC染色 通過IHC染色分析2組CCL3和CCL4表達(dá)水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組CCL3和CCL4的表達(dá)上升，炎性反應(yīng)加重，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

組別CCL3CCL4對照組1.15±0.211.04±0.05模型組3.18±0.042.97±0.02t值2.5274.668P值0.0010.016

2.5 大鼠髓核細(xì)胞凋亡率測定 用雙激光流式細(xì)胞儀分析2組大鼠細(xì)胞凋亡程度發(fā)現(xiàn)模型組與對照組相比細(xì)胞活力降低，凋亡率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表6。

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠髓核細(xì)胞凋亡情況

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶參與許多正常的生物過程(例如胚胎發(fā)育，胚泡植入，器官形態(tài)發(fā)生，神經(jīng)生長，排卵，宮頸擴(kuò)張，產(chǎn)后子宮復(fù)舊，子宮內(nèi)膜循環(huán)，毛囊循環(huán)，骨重建，傷口愈合，血管生成和細(xì)胞凋亡)和病理過程(例如關(guān)節(jié)炎，癌癥，心血管疾病，腎炎，神經(jīng)疾病，血腦屏障破壞，牙周病，皮膚潰瘍，角膜潰瘍，肝纖維化，肺氣腫和纖維化肺病)[7-10]。盡管基質(zhì)金屬蛋白酶的主要功能是在組織再吸收和許多疾病的進(jìn)展期間細(xì)胞外基質(zhì)的升高，但顯然基質(zhì)金屬蛋白酶也通過確定的蛋白水解改變細(xì)胞外基質(zhì)分子的生物學(xué)功能[11]。MMPs被TIMPs的組織抑制劑抵消，其通過限制細(xì)胞外基質(zhì)分解來抑制MMP活性。MMP和TIMP之間的平衡在維持健康組織的完整性方面起重要作用[12]。在各種病理狀況中發(fā)現(xiàn)MMP和TIMP的平衡受到干擾，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，癌癥和牙周炎MMP-9和TIMP-1被認(rèn)為通過溶解細(xì)胞外基質(zhì)參與癌細(xì)胞的傳播，但它們在創(chuàng)造支持原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的起始和生長的環(huán)境中也是重要的[13]。MMP-9是屬于鋅依賴性金屬蛋白酶的酶家族的成員，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中起作用[14]。MMP是IL-1β信號傳導(dǎo)的下游調(diào)節(jié)劑。MMPs和TIMPs活性的改變以及隨之發(fā)生的MMPs/TIMPs失衡，在動物模型中顯示，在動脈粥樣硬化，心肌梗死，左心室增生和心力衰竭期間介導(dǎo)病理性重構(gòu)[15]。缺血性心肌病，壓力和體積超負(fù)荷以及神經(jīng)內(nèi)分泌因子如血管緊張素Ⅱ，內(nèi)皮素1，TNF-α和TGF-β可以時間和細(xì)胞依賴性方式改變MMPs和TIMPs的表達(dá)，導(dǎo)致MMPs/TIMPs的紊亂心血管組織平衡[16]。

組別細(xì)胞凋亡率對照組12.44±1.29誘導(dǎo)組56.08±2.37t值2.342P值0.026

在正常健康成人中，MMPs以低水平表達(dá)，并且它們的上調(diào)似乎在許多病理過程中起重要作用[17]。MMPs活性表達(dá)及對基質(zhì)蛋白的降解需要一定的外在條件，如白細(xì)胞介素IL-1β和IL-6及腫瘤壞死因子，表皮生長因子，細(xì)胞因子和蛋白水解酶等[18]。引起椎間盤退變的因素也有很多，如細(xì)胞的衰老，代謝異常造成的分解物積累，營養(yǎng)代謝異常等等，這些因素都可加快椎間盤退變的發(fā)生。椎間盤自身結(jié)構(gòu)的病變是由基質(zhì)合成與分解的不平衡造成的，MMPs是造成這種不平衡的主要原因[19]。TNF-α MMP家族成員MMP-9參與慢性阻塞性肺病，多發(fā)性硬化癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的進(jìn)展。這些影響可能與生長因子的蛋白水解釋放和細(xì)胞環(huán)境的改變有關(guān)[20]。我們研究了椎間盤退變大鼠模型中的MMP-9和TIMP-1水平，并將其與對照組進(jìn)行了比較，還研究了與該疾病相關(guān)的蛋白因子的表達(dá)。研究中最重要的發(fā)現(xiàn)是椎間盤退變大鼠模型MMP-9和TIMP-1水平之間的關(guān)聯(lián)。此外，高M(jìn)MP-9和TIMP-1水平與某些臨床病理學(xué)變量顯著相關(guān)。筆者認(rèn)為，椎間盤中,細(xì)胞外基質(zhì)處于不斷地合成和分解的平衡之中,新合成的基質(zhì)分子不斷代替被酶降解的舊分子。這一平衡的破壞,即過量的 MMPs 的表達(dá)則引起椎間盤基質(zhì)中 Aggrecan 降解,蛋白多糖含量下降，硫酸軟骨素/硫酸角質(zhì)素比值下降和膠原類型發(fā)生明顯改變,造成髓核失水而喪失其固有的彈性，直接導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)功能的減退甚至喪失,從而出現(xiàn)椎間盤退變。TIMPs 則可以通過直接抑制 MMPs 對細(xì)胞外基質(zhì)的降解來發(fā)揮延緩椎間盤退變的作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9和TMP-1可視為椎間盤退變檢測的常規(guī)血清生物標(biāo)志物，兩種因子的表達(dá)不平衡會造成髓核細(xì)胞損害從而引發(fā)椎間盤退變等疾病發(fā)生，基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子1可做為預(yù)防治療椎間盤退變疾病的新型靶點(diǎn)。