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    基于HPLC 法測(cè)定秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液的環(huán)烯醚萜苷類成分

    2020-07-16 11:44:00高慧琴
    關(guān)鍵詞:獐牙菜水煎液秦艽

    吳 晨,魏 昀,高慧琴

    (甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,甘肅蘭州730000)

    秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)為龍膽科植物秦艽的干燥根,威靈仙(Clematis chinensis Osbeck.)為毛茛科植物威靈仙的干燥根和根莖[1]。秦艽和威靈仙二藥均具有祛風(fēng)濕之功效[2]。環(huán)烯醚萜類化合物苷元具有抗炎、止血、鎮(zhèn)痛等功效,可分為獐牙菜苦苷類、龍膽苦苷類和獐牙菜苷類等[3-4]。本研究首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索秦艽-威靈仙藥對(duì)中含有的環(huán)烯醚萜苷類有效成分,接著通過高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)對(duì)秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液成分進(jìn)行分析,最終將色譜分析結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索結(jié)果進(jìn)行比對(duì),判斷通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液成分結(jié)果的準(zhǔn)確性,為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 軟件數(shù)據(jù)庫(kù)

    中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)[5](TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 和 Cytoscape 3.2.1 分析軟件(https://cytoscape.org)。

    1.2 藥品與試劑

    秦艽和威靈仙飲片購(gòu)自蘭州惠仁堂藥店,批號(hào)分別為16062901 和16061406,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李成義教授鑒定為正品。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品:獐牙菜苦苷(批號(hào):CHB181105)、龍膽苦苷(批號(hào):CHB190130)和獐牙菜苷(批號(hào):CHB180115),純度均≥98%,購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;磷酸(色譜純)購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠;蒸餾水購(gòu)自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

    1260 系列高效液相色譜儀配 G7115A DAD檢測(cè)器(美國(guó)Ailent Technologies 公司);KQ-700DE型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);ME204E 型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO 國(guó)際貿(mào)易上海有限公司);MYB 型電子調(diào)溫電熱套(天津市中實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 藥對(duì)活性成分篩選與收集 依次以“秦艽”和“威靈仙”為關(guān)鍵詞通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索各味藥的活性成分,以生物口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[6],匯總整理秦艽-威靈仙藥對(duì)的活性成分,并通過Cytoscape 構(gòu)建“中藥-成分”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D,篩選環(huán)烯醚萜苷類成分。

    1.4.2 色譜條件 色譜柱為:安捷倫883975-902 ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相 A 為 0.04%磷酸水溶液(0~28 min,85%A→77%A;28~35 min,77%A→65%A)、流動(dòng)相 B 為甲醇,色譜柱采用梯度洗脫(0~28 min,15%B→23%B;28~35 min,23%B→35%B);流速設(shè)置為 0.8 mL/min;柱溫箱設(shè)置為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為245 nm;進(jìn)樣量設(shè)置為 5 μL。

    1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品和藥品的制備 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱取獐牙菜苦苷5.0 mg、龍膽苦苷10.6 mg 和獐牙菜苷3.1 mg,分別置于3 個(gè)10 mL 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,制得對(duì)應(yīng)高濃度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液。

    混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的制備:分別精密量取1 mL 獐牙菜苦苷、1 mL 龍膽苦苷和1 mL 獐牙菜苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液,置于1 個(gè)10 mL 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,制得混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液。其濃度分別為:獐牙菜苦苷0.050 0 mg/mL、龍膽苦苷0.106 0 mg/mL 和獐牙菜苷0.031 0 mg/mL,置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    通過冷凝回流法制備秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液,按照秦艽:威靈仙1∶1 的比例分別稱取秦艽飲片和威靈仙飲片各5 g 共10 g,分2 次煎煮。第1次加 10 倍量水(100 mL),浸泡 30 min 后,加熱至沸騰后再煎煮1 h,紗布過濾收集藥液;第2 次加8倍量水(80 mL),加熱至沸騰后再煎煮30 min,紗布過濾收集藥液,合并濃縮2 次水煎液,定容至100 mL,得到濃度為0.1 g/mL 的秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液。將以上制得中藥水煎液通過0.45 μm 濾器過濾,置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.4 適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 設(shè)定HPLC 色譜儀精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL,在“1.4.2項(xiàng)”色譜條件下分別進(jìn)樣進(jìn)行適應(yīng)性測(cè)定。

    1.5 線性關(guān)系

    設(shè)定HPLC 色譜儀分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液 2.5 μL、5 μL、10 μL 和混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液各 1.25 μL、2.5 μL、5 μL、10 μL、12.5 μL 進(jìn)樣,按步驟“1.4.2 項(xiàng)”的色譜條件測(cè)定峰面積,以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為 X 軸,峰面積值為 Y 軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到線性回歸方程和線性范圍。

    1.6 精密度實(shí)驗(yàn)

    設(shè)定HPLC 色譜儀,分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液5 μL,連續(xù)進(jìn)樣7 次,記錄分析色譜圖并計(jì)算混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量的RSD 值。

    1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    稱取秦艽 5 g,威靈仙 5 g,共10 g,設(shè)置為7 組平行,按“1.4.3 項(xiàng)”方法制備 7 份平行秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液的供試品溶液,設(shè)定HPLC 色譜儀分別精密吸取5 μL 供試品溶液進(jìn)樣檢驗(yàn),在“1.4.2 項(xiàng)”色譜條件下分析藥對(duì)水煎液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量的RSD 值。

    1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    取同一份秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液供試品溶液,設(shè)定HPLC 色譜儀精密吸取5 μL 供試品溶液,在“1.4.2 項(xiàng)”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定 0 h~24 h 內(nèi)每隔2 h 的獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的峰面積,并計(jì)算RSD 值。

    1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

    量取已知成分含量的秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液供試品溶液6 份,分別加入一定量的獐芽菜苦苷對(duì)照品、龍膽苦苷對(duì)照品和獐牙菜苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品,在“1.4.2 項(xiàng)”色譜條件下分別進(jìn)樣 5 μL,記錄色譜峰,計(jì)算加樣回收率。

    1.10 樣品含量測(cè)量

    取秦艽和威靈仙飲片按“1.4.3 項(xiàng)”方法平行制備5 份供試品溶液,在“1.4.2 項(xiàng)”色譜條件下進(jìn)樣5 μL,測(cè)量獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的峰面積并代入“1.5 項(xiàng)”中的線性回歸方程以計(jì)算獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量。

    2 結(jié) 果

    2.1 藥對(duì)活性成分篩選與收集結(jié)果

    以關(guān)鍵詞“秦艽”和“威靈仙”于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索活性成分,共檢索到:秦艽27 個(gè)成分,威靈仙57 個(gè)成分。根據(jù)步驟2.1 中標(biāo)準(zhǔn)篩選后,秦艽-威靈仙藥對(duì)共篩得13 個(gè)活性成分,其中屬于秦艽的活性成分6 個(gè),屬于威靈仙的活性成分7 個(gè),共有活性成分2 個(gè),分別是齊墩果酸和β-谷甾醇(表1)。通過Cytoscape 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D(圖 1),篩選得到藥對(duì)中的環(huán)烯醚萜苷類成分有獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷。

    表1 秦艽-威靈仙藥對(duì)活性成分及相關(guān)參數(shù)

    圖1 秦艽-威靈仙藥對(duì)“中藥-活性成分”拓?fù)鋱D

    2.2 適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    以“1.4.4 項(xiàng)”方法進(jìn)樣檢測(cè)的HPLC 色譜圖見圖2,結(jié)果可見獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的保留時(shí)間分別為 25.6 min、30.5 min 和 34.6 min,峰分離度良好。

    2.3 線性關(guān)系結(jié)果

    將“1.5 項(xiàng)”方法檢測(cè)所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為X 軸,峰面積值為Y 軸,最終得到線性回歸方程。獐牙菜苦苷的線性回歸方程為 Y=507X+5.531 8(R2=0.998 2);龍膽苦苷的線性回歸方程為Y=713.23X+12.219(R2=0.998 9);獐牙菜苷的線性回歸方程為Y=296.12X+8.881 6(R2=0.997)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):獐牙菜苦苷在0.021 0~1.056 0 μ g,龍膽苦苷在 0.036 5~11.720 0 μg 以及獐牙菜苷在 0.016 2~1.142 0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    圖2 高效液相色譜圖

    2.4 精密度結(jié)果

    以“1.6 項(xiàng)”方法分析色譜圖并計(jì)算混合對(duì)照品溶液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分別為0.42%、0.24%和1.79%,表明實(shí)驗(yàn)精密度良好。

    2.5 重復(fù)性結(jié)果

    以“1.7 項(xiàng)”方法檢測(cè)分析秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分別為1.21%、0.07%和0.49%,表明實(shí)驗(yàn)具有較好重復(fù)性。

    2.6 穩(wěn)定性結(jié)果

    以“1.8 項(xiàng)”方法,每隔 2 h 檢測(cè) 1 次,24 h 內(nèi)秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分別2.32%、0.33%和1.89%,表明樣品在24 h 內(nèi)具有良好穩(wěn)定性。

    2.7 加樣回收率結(jié)果

    以“1.9 項(xiàng)”方法檢測(cè)并計(jì)算秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液的加樣回收率,獐牙菜苦苷的平均加樣回收率為 99.64%(表2)、龍膽苦苷的平均加樣回收率為100.20%(表3)以及獐牙菜苷的平均加樣回收率為 101.11%(表4)。

    2.8 樣品含量測(cè)量結(jié)果

    表2 獐牙菜苦苷加樣回收結(jié)果

    表3 龍膽苦苷加樣回收結(jié)果

    表4 獐牙菜苷加樣回收結(jié)果

    以“1.10 項(xiàng)”方法檢測(cè)并將峰面積代入線性回歸方程計(jì)算秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液中獐芽菜苦苷、龍膽苦苷峰和獐牙菜苷的含量分別為2.13 mg/g、28.36 mg/g 和 4.51 mg/g。

    3 討 論

    獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷既是環(huán)烯醚萜苷中的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分,也是秦艽-威靈仙藥對(duì)發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[7-8]。近年來(lái),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展方興未艾,但是由于其所得結(jié)果多數(shù)基于數(shù)據(jù)庫(kù)查詢和軟件分析并且只能定性不能定量[9],其結(jié)果也備受爭(zhēng)議。本研究借助HPLC法對(duì)通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法檢索得到的秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液中含有的環(huán)烯醚萜苷類成分結(jié)果進(jìn)行定性檢測(cè)并確定了其含量,驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在預(yù)測(cè)秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液成分方面的可行性,進(jìn)而推廣到預(yù)測(cè)其他中藥的活性成分,為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

    本研究使用紫外全波長(zhǎng)掃描(190 nm~400 nm),查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn):獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為235 nm、270 nm和247 nm,因吸收波長(zhǎng)在245 nm 處獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷色譜峰的靈敏度較高且雜質(zhì)干擾較少,故選擇245 nm 作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)。通過查閱文獻(xiàn)并結(jié)合不同溶劑流動(dòng)相考察的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),較乙腈-磷酸水溶液來(lái)說(shuō),甲醇-磷酸水溶液作為流動(dòng)相有助于各峰之間的完全分離,獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的分離效果較好,色譜圖基線較平穩(wěn)。因?yàn)楸狙芯枯o助課題組藥效學(xué)研究,故選擇了與藥效研究相同的水煎液制備方法,以期其結(jié)果對(duì)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)具有指導(dǎo)作用[10]。

    最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,秦艽-威靈仙水煎液中含有獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷這3 種環(huán)烯醚萜苷類成分,與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致,其含量按順序排列為:龍膽苦苷(28.36 mg/g)>獐牙菜苷(4.51 mg/g)>獐牙菜苦苷(2.13 mg/g)。本研究從基礎(chǔ)的儀器分析方法入手,以秦艽-威靈仙藥對(duì)為例,考察了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中有效成分查詢方法的可靠性,彌補(bǔ)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)成分只能定性不能定量的缺陷,為日后基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥藥性理論或是作用機(jī)制提供了新的思路。

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